CC BY
243
9. "MALDI Biotyper 3.0 User Manual. Rev 2" (Bruker Daltonics, Germany. Feb., 2011).
10. Instructions for the control of specific .sterility of experimental drugs prepared from cultures of the plague and cholera microbe. Saratov; 1982. (in Russian)
11. Couderc C., Nappez C., Drancourt M. Comparing inactivation protocols of Yersinia organisms for identification with matrix-assisted laser esorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2012; 26: 710—4.
12. Drevinek M., Dresler J., Klimentova J., Pisa L., Hubalek M. Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria. Lett. Appl. Microbiol. 2012; 55: 40—6.
13. Wittwer M., Heim J., Schär M., Dewarrat G., Schürch N. Tapping the potential of intact cell mass spectrometry with a combined data ana-
lytical approach applied to Yersinia spp.: detection, differentiation and identification of Y. pestis. Syst. Appl. Microbiol. 2011; 34: 12—9.
14. Lasch P., Drevinek M., Nattermann H., Grunow R., Stämmler M., Dieckmann R. et al. Characterization of Yersinia using MALDI-TOF mass spectrometry and chemometrics. Anal. Chem. 2010; 82: 8464—75.
15. Ayyadurai S., Flaudrops C., Raoult D., Drancourt M. Rapid identification and typing of Yersinia pestis and other Yersinia species by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDITOF) mass spectrometry. BMC Microbiol. 2010; 10: 285.
16. Balakhonov S.V., Afanasiev M.V., Shestopalov M.Yu., Ostyak A.S., Vityazeva S.A., Korzun V.M. et al. The first case of allocation of Yersinia pestis subsp. pestis in the Altai mountain natural focus of plague. Message 1. Microbiological characterization of molecular-genetic and mass spectrometric identification of the isolate. Prob-lemy osobo opasnykh infektsiy. 2013; 1: 60—5. (in Russian)
Поступила 14.12.13 Received 14.12.13
© КоллЕКТив АВТОРОВ, 2014
УДК 616.832-001-06:616.24-002-022.7-078
Ульянов в.Ю.1, определенцева СБ.1, Швиденко и.Г.2, Норкин и.А.1, Коршунов Г.в.1, Гладкова Е.в.1
БИОЛОГИЧЕСКАЯ КИНЕТИКА БИОПЛЕНОК КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS И PSEUDOMONAS AERUGINOSA, ВЫДЕЛЕННЫХ У БОЛЬНЫХ С БРОНХОЛЕГОЧНЫМИ ОСЛОЖНЕНИЯМИ ПРИ ТРАВМАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СПИННОГО МОЗГА
1ФГБУ "Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии" Минздрава России, 410002, Саратов; 2ГБоУ впо "Саратовский государственный медицинский университет им. в.И. Разумовского" Минздрава России, 410012, Саратов
В статических условиях культивирования в течение 24, 48, 72 и 96 ч изучена способность и интенсивность формирования микробных биопленок у 24 клинических штаммов Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa, выделенных у больных с бронхолегочными инфекционными осложнениями в остром и раннем периодах травматической болезни спинного мозга.
Ключевые слова: бактериальные биопленки; золотистый стафилококк; синегнойная палочка; бронхолегочные осложнения; травматическая болезнь; спинной мозг.
V.Yu. Uliyanov1, S.V Opredelentseva1, I.G. Shvidenko2, I.A. Norkin1, G.V Korshunov1, E.V. Gladkova1
THE BIOLOGICAL KINETICS OF BIOFILMS OF CLINICAL STRAINS OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND PSEUDOMONAS AERUGINOSA SEPARATED FROM PATIENTS WITH BRONCHOPULMONARY COMPLICATIONS UNDER TRAUMATIC DISEASE OF SPINAL CORD
1The Saratov research institute of traumatology and orthopedics of Minzdrav of Russia, 410012 Saratov, Russia
2The V.I. Razumovskiy Saratov state medical university of Minzdrav of Russia, 410012 Saratov, Russia
The capacity and intensity of formation of microbial biofilms was analyzed in 24 strains of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa in .static conditions of cultivation during 24, 48, 72 and 96 yours. The microorganisms were separated from patients with bronchopulmonary infectious complications in acute and early periods of traumatic disease of spinal cord.
Keywords: bacterial biofilm; Staphylococcus aureus; Pseudomonas aeruginosa; bronchopulmonary complication; traumatic disease; spinal cord.
Бактериальные инфекции нижних дыхательных путей, вызванные условно-патогенными возбудителями, являются наиболее ранними осложнениями, развивающимися в остром и раннем периодах травматической болезни спинного мозга [1, 2]. Возникновение гнойно-воспалительных осложнений в бронхиальном дереве у больных с травматическими повреждениями шейного отдела позвоночника и спинного мозга обусловлено выраженным неврологическим дефицитом, характеризующимся параличом диафрагмы и других вспомогательных дыхательных мышц [3]. Неврологический дефицит в посттравматическом периоде приводит к неэффективной экс-пекторации, нарушениям мукоцилиарного клиренса, умень-
Для корреспонденции:
Ульянов Владимир Юрьевич, науч. сотр. Адрес: 410002, Саратов, ул. Чернышевского, 148. E-mail: [email protected]
шению резистентности и инфицированию слизистой оболочки нижних дыхательных путей [4]. Среди возбудителей бронхолегочных осложнений наибольшее клиническое значение в посттравматическом периоде имеют Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa, общим свойством которых является высокая патогенность, обусловленная наличием межклеточной сигнальной системы quorum sensing и способностью микроорганизмов к биопленкообразованию [5—7]. Способность к формированию биопленки определяется не только видом возбудителя, но и характером инфекционного процесса (аспирационный пневмонит, постинтубационные осложнения, функционирующая трахеостома, эндобронхит, пневмония), развивающегося на фоне иммуносупрессии и синдрома системного воспалительного ответа [8—10]. В основе патогенеза бронхолегочных инфекционных осложнений при травматической болезни спинного мозга лежит переход от планктонного фенотипа микроорганизмов к формированию
биопленки с изменением процессов метаболизма в ней [11]. При этом первичная адгезия на слизистой оболочке возникает случайным образом при пассивной миграции бактериальных клеток с током воспалительного секрета [12, 13]. Затем живые бактериальные клетки, погруженные в виде микроколоний в экзополимер-полисахаридный матрикс, начинают синтезировать полимеры (адгезины), защищающие и связывающие их между собой и подлежащей поверхностью слизистых оболочек бронхиального дерева, реализуя стадию необратимого связывания [14]. На этапе созревания биопленок в результате их деления возникают компактные микроколонии, которые постепенно увеличиваются и объединяются с образованием макроколоний. Этот процесс характеризуется увеличением толщины биопленок и формированием специфических структур — полостей, выростов, пор и каналов, обеспечивающих метаболическую кооперацию бактериальных клеток [15]. При достижении критической массы возникает дисперсия биопленки, в результате которой от наружных слоев начинают открепляться клетки, способные покидать биопленку и колонизировать все большие поверхности респираторного тракта, чтобы повторить свой биологический цикл [16].
Скоординированная активность микробного сообщества (клеточной коммуникации) защищает бактерии в биопленке от антибактериальных препаратов, а также от неблагоприятных воздействий внешней среды (рН среды, осмотический шок, высыхание, ультрафиолетовое облучение, фагоцитоз, лизоцим, лактоферрин, факторы иммунной защиты организма) [17, 18]. Указанные биологические свойства микробных биопленок определяют возможность генерализации инфекционного процесса и возникновение в посттравматическом периоде сепсиса и синдрома полиорганной недостаточности, являющихся непосредственной причиной летального исхода у пациентов молодого трудоспособного возраста, что делает проблему изучения интенсивности образования биопленок чрезвычайно актуальной в медицинском, социальном и экономическом аспектах [19, 20].
Цель работы — изучить способность и интенсивность формирования микробных биопленок клиническими штаммами S. aureus и P. aeruginosa, выделенными у больных с бронхолегочными инфекционными осложнениями в остром и раннем периодах травматической болезни спинного мозга.
Материалы и методы. В исследование включены 24 клинических штамма микроорганизмов (12 — S. aureus, 12 — P. aeruginosa), выделенных из трахеальных аспиратов у 22 пациентов с травматическими повреждениями шейного отдела позвоночника и спинного мозга при развитии у них в остром и раннем периодах бронхолегочных инфекционных осложнений. Группу сравнения составили 24 эталонных штамма микроорганизмов (12 — S. aureus АТСС 25923, 12 — P. aeruginosa АТСС 27853). В качестве контроля использовали 200 мкл 0,9% раствора натрия хлорида, внесенного в ячейки плоскодонных стерильных культуральных полистирольных планшетов с оптической плотностью 0,1 по Мак-Фарланду (Densi-La-Meter, Lachema, Чехия). Взятие биологического материала (трахеального аспирата) осуществляли до начала антибактериальной терапии при выполнении санационно-диагностической фибробронхоскопии с использованием защищенных катетеров и аспирационных банок в объеме 5 мл 0,9% раствора натрия хлорида. В соответствии с приказом МЗ СССР от 22.04.85 № 535 "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений" из образцов трахеальных аспиратов приготавливали мазки, окрашивали их по Граму с последующей микроскопией для оценки общей картины микрофлоры и оценки ее морфологических и тинкториальных свойств. Посев биологического материала осуществляли на 5% кровяной агар путем равномерного распределения по поверхности питательной среды с использованием дозаторов с последующей инкубацией в суховоздушном термостате ТС-1/80 СПУ в течение 24 ч при 37oC. Из материала изолиро-
ванных колоний, отобранных по культуральным признакам, выделяли чистые культуры. Биохимическую идентификацию штаммов осуществляли на микробиологическом анализаторе BD BBL Crystal (США). Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам проводили на плотной питательной среде Мюллера—Хинтона (HiMedia, Индия) диско-диффузионным методом. Для количественного учета интенсивности биопленкообразования из суточных культур исследуемых штаммов в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида готовили суспензии с оптической плотностью 0,5 по Мак-Фарланду (Densi-La-Meter, Lachema, Чехия). Вносили по 200 мкл бактериальной суспензии с начальной концентрацией бактерий 105 КОЕ/мл в ячейки плоскодонных стерильных культуральных полистирольных планшетов с 96 лунками, содержащие в каждом ряду соответственно по 200 мкл 0,9% раствора натрия хлорида (аналог электролитной среды) или 200 мкл питательного бульона для культивирования микроорганизмов, состоящего из 9 г пептона ферментативного сухого, 8 г гидролизата казеина ферментативного, 3 г дрожжевого экстракта, 5 г натрия хлорида, 2,5 г натрия гидроортофосфата (ОАО "Биомед" им. И.И. Мечникова, Россия). Бактериальную суспензию инкубировали в суховоздушном термостате при 37oC в течение 24, 48, 72 и 96 ч (статические условия культивирования). Планктонные бактерии удаляли аспирацией, ячейки планшетов осторожно промывали с помощью автоматического многофункционального промывателя для микропланшет, добавляли соответствующий объем 1% водного раствора красителя кристаллического фиолетового, экспонировали при комнатной температуре 10 мин, удаляли раствор и осторожно троекратно промывали планшеты водой. Связавшийся с биопленками краситель растворяли в 200 мкл смеси ацетон— этанол (20:80) и определяли на спектрофотометре оптическую плотность при длине волны 420 нм. Для построения калибровочной кривой готовили контрольные образцы (200 мкл 0,9% раствора натрия хлорида). Образование биопленок эталонными и клиническими штаммами микроорганизмов оценивали по величине связывания ими кристаллического фиолетового в стерильных плоскодонных культуральных по-листирольных планшетах с 96 лунками.
Полученные результаты экспериментальных и клинических исследований обработаны статистически экспресс-методом (Стрелков Р.Б., 1998) с вычислением средней арифметической (М), среднеквадратической ошибки средней арифметической (m) и показателя вероятности (р).
Результаты и обсуждение. При культивировании биопленки эталонных штаммов S. aureus в лунках планшета, содержащих по 200 мкл 0,9% раствора натрия хлорида, в 1-е сутки отмечали достоверное увеличение связывания кристаллического фиолетового в 3,33 раза по сравнению с контрольными значениями (р < 0,01). На 2, 3 и 4-е сутки исследования достоверных различий величин связывания биопленкой кристаллического фиолетового не выявлено (р > 0,05) (табл. 1).
При культивировании биопленки эталонных штаммов S. aureus в лунках планшета, содержащих по 200 мкл питательного бульона, в 1-е сутки также наблюдали увеличение связывания кристаллического фиолетового в 3,65 раза по сравнению с контрольными значениями (р < 0,01). На 2-е и 3-и сутки исследования достоверных различий в величинах связывания биопленкой кристаллического фиолетового не выявлено (р > 0,05). На 4-е сутки культивирования происходило достоверное уменьшение накопления биопленкой кристаллического фиолетового по сравнению с показателями на 3-и сутки наблюдения в 5,06 раза (р < 0,05); при этом величина исследуемого показателя была выше контрольных значений в 2,76 раза (р < 0,05; см. табл. 1).
При культивировании биопленки клинических штаммов S. aureus в лунках планшета, содержащих по 200 мкл 0,9% раствора натрия хлорида, в 1-е сутки отмечали повышение показателя связывания кристаллического фиолетового в 4,18 раза по сравнению с контрольными значениями (р < 0,001).
На 2-е сутки культивирования увеличения связывания биопленкой кристаллического фиолетового не обнаружено (р > 0,05). На 3-и сутки фиксировали увеличение накопления биопленкой кристаллического фиолетового по сравнению с показателями на 2-е сутки в 4,5 раза (р < 0,001). На 4-е сутки наблюдали уменьшение накопления кристаллического фиолетового в 1,93 раза (р < 0,001) по сравнению с показателями на 3-и сутки, однако количественные значения в этот период превышали контрольные в 9,76 раза (р < 0,001; табл. 2).
При культивировании биопленки клинических штаммов S. aureus в лунках планшета, содержащих по 200 мкл питательного бульона, в 1-е сутки регистрировали увеличение накопления кристаллического фиолетового в 6,16 раза по сравнению с контрольными значениями (р < 0,001), на 2-е сутки культивирования — в 1,94 раза по сравнению с показателями в 1-е сутки (р < 0,001), на 3-и сутки — в 2,61 раза по сравнению с показателями во 2-е сутки (р < 0,001). На 4-е сутки культивирования отмечали уменьшение величины накопления кристаллического фиолетового в 3,18 раза по сравнению с показателями на 3-и сутки (р < 0,001), однако этот показатель превышал контрольные значения в 9,81 раза (р < 0,001; см. табл. 2).
В процессе культивирования эталонных штаммов P. aeruginosa в лунках планшета, содержащих по 200 мкл 0,9% раствора натрия хлорида, наблюдали волнообразное изменение показателей накопления кристаллического фиолетового образующейся биопленкой. Так, в 1-е сутки фиксировали увеличение накопления кристаллического фиолетового биопленкой в 51,8 раза по сравнению с контрольными значениями (р < 0,001). На 2-е сутки накопление красителя уменьшалось по сравнению с показателями в 1-е сутки в 4,8 раза (р < 0,001). На 3-и сутки вновь отмечали увеличение накопления кристаллического фиолетового в 3,5 раза по сравнению с показателями на 2-е сутки культивирования (р < 0,01). На 4-е сутки возникло уменьшение накопления красителя в 8 раз по сравнению с показателями на 3-и сутки (р < 0,001; табл. 3).
При культивировании эталонных штаммов P. aeru-ginosa в лунках планшета, содержащих по 200 мкл питательного бульона, в 1-е сутки отмечали увеличение накопления красителя в 8,9 раз по сравнению с контрольными значениями (р < 0,001). На 2-е сутки достоверных изменений накопления красителя по сравнению с 1-ми сутками не выявлено (р > 0,05). На 3-и сутки возникло увеличение накопления кристаллического фиолетового биопленкой в 15 раз по сравнению с показателями на 2-е сутки (р < 0,001), которое на 4-е сутки сменилось уменьшением накопления красителя в 5,8 раза (р < 0,01; см. табл. 3).
При изучении биопленкообразования клинических штаммов P. aeruginosa в лунках планшета, содержащих по 200 мкл 0,9% раствора натрия хлорида, в 1-е и 2-е сутки культивирования не отмечали достоверного увеличения накопления кристаллического фиолетового по сравнению с контрольными значениями (р > 0,05). Увеличение накопления красителя в 8,5 раза происходило лишь на 3-и сутки (р < 0,001) с последующим уменьшением в 2,3 раза к 4-м суткам культивирования биопленки (р < 0,001; табл. 4).
При культивировании биопленки клинических штаммов P. aeruginosa в лунках планшета, содержащих по 200 мкл питательного бульона, в 1-е сутки фиксировали увеличение накопления красителя в 9,5 раза по сравнению с контрольными значениями (р < 0,001), на 2-е сутки изменения накопления красителя имели недостоверный характер (р > 0,05), на 3-и сутки возникло увеличение накопления красителя в 2,2 раза по сравнению с показателями на 2-е сутки (р < 0,001). На 4-е сутки культивирования отмечали угнетение накопления кристаллического фиолетового в 2,1 раза по сравнению с показателями на 3-и сутки (р < 0,001; см. табл. 4).
Согласно данным литературы, биопленки способно образовывать более 90% известных видов бактерий, а их формирование выявляется более чем при 80% заболеваний бактериальной этиологии [21—23]. Это определяет необходимость изучения способности и интенсивности формирования биопленок у наиболее распространенных видов микроорганизмов. Установлено, что все исследуемые эталонные и
Таблица 1
Динамика показателей связывания кристаллического фиолетового микробными биопленками, образованными эталонными штаммами S. aureus (n = 12)
Вид питательной среды 1-е сутки 2-е сутки 3-и сутки 4-е сутки
связывание кристаллического фиолетового микробными биопленками, ед.
Контроль 0,038±0,001 0,038±0,001 0,038±0,001 0,038±0,001 0,9% раствор 0,129±0,011 0,154±0,026 0,296±0,115 0,269±0,095 натрия хлорида р < 0,01) (р2 > 0,05) (р3 > 0,05) (р4 > 0,05) Питательный 0,139±0,014 0,210±0,050 0,532±0,239 0,105±0,006 бульон (р1 < 0,01) (р2 > 0,05) (р3 > 0,05) (р4 > 0,05)
Примечание. Здесь и в табл. 2—4 приведены достоверные различия: р1 — с контрольными значениями, р2 — с показателями в 1-е сутки, р3 — с показателями на 2-е сутки, р4 — с показателями на 3-и сутки; n — число наблюдений.
Таблица 2
Динамика показателей связывания кристаллического фиолетового микробными биопленками, образованными клиническими штаммами S. aureus (n = 12)
Вид питательной среды 1-е сутки 2-е сутки 3-и сутки 4-е сутки
связывание кристаллического фиолетового микробными биопленками, ед.
Контроль 0,038±0,001 0,038±0,001 0,038±0,001 0,038±0,001 0,9% раствор 0,159±0,015 0,157±0,014 0,719±0,077 0,371±0,065 натрия хлорида (р1 < 0,001) (р2 > 0,05) (р3 < 0,001) (р4 < 0,001) Питагельньш 0,234±0,023 0,454±0,041 1,189±0,105 0,373±0,025 бульон (р1 < 0,001) (р2 < 0,001) (р3 < 0,001) (р4 < 0,001)
Таблица 3
Динамика показателей связывания кристаллического фиолетового микробными биопленками, образованными эталонными штаммами P aeruginosa (n = 12)
Вид питательной среды 1-е сутки 2-е сутки 3-и сутки 4-е сутки
связывание кристаллического фиолетового микробными биопленками, ед.
Контроль 0,038±0,001 0,038±0,001 0,038±0,001 0,038±0,001 0,9% раствор 1,970±0,307 0,403±0,216 1,433±0,302 0,179±0,117 натрия хлорида (р1 < 0,001) (р2 < 0,001) (р3 < 0,01) (р4 < 0,001) Питательный 0,341±0,285 0,102±0,019 1,533±0,353 0,262±0,207 бульон (р1 < 0,001) (р2 > 0,05) (р3 < 0,001) (р4 < 0,01)
Таблица 4
Динамика показателей связывания кристаллического фиолетового микробными биопленками, образованными клиническими штаммами P aeruginosa (n = 12)
Вид питательной среды 1-е сутки 2-е сутки 3-и сутки 4-е сутки
связывание кристаллического фиолетового микробными биопленками, ед.
Контроль 0,038±0,001 0,038±0,001 0,038±0,001 0,038±0,001 0,9% раствор 0,092±0,012 0,104±0,012 0,886±0,101 0,372±0,065 натрия хлорида (р1 < 0,001) (р2 > 0,001) (р3 < 0,01) (р4 < 0,001) Питательный 0,363±0,055 0,338±0,055 0,772±0,076 0,364±0,026 бульон (р1 < 0,001) (р2 > 0,05) (р3 < 0,001) (р4 < 0,01)
выделенные от больных штаммы S. aureus и P. aeruginosa, обладали способностью к образованию биопленки.
При изучении биопленкообразования у эталонных и клинических штаммов S. aureus отмечалось усиление накопления кристаллического фиолетового в период инкубации с 1-х по 3-и сутки как в лунках, содержащих 200 мкл 0,9% раствора натрия хлорида, так и в лунках, содержащих 200 мкл питательного бульона, что, вероятно, соответствует периоду созревания и дифференцировки биопленки и может косвенно свидетельствовать о высокой способности клеток в составе микробного сообщества к метаболической кооперации и экспрессии неспецифических факторов адгезии. Полученные сведения соответствуют данным литературы о реализации факторов патогенности биопленок именно по такому пути [24—26]. Быстрое достижение к концу 3-х суток культивирования критической массы биопленкой, образуемой эталонными и клиническими штаммами S. aureus, по нашему мнению, достигнуто за счет микронутриентов, содержащихся в питательном бульоне. Это привело к возникновению дисперсии биопленки на 4-е сутки наблюдения, что проявлялось in vitro уменьшением способности к накоплению красителя. Наши сведения о сроках дисперсии биопленки несколько отличаются от данных литературы, согласно которым дисперсия наступает после 7-х суток культивирования [27].
Прослежен полный жизненный цикл биопленки, образуемой эталонными и клиническими штаммами S. aureus от момента неспецифической адгезии на поверхности лунки планшета до ее дисперсии.
Закономерности пленкообразования эталонными и клиническими штаммами S. aureus отличались от таковых у эталонных и клинических штаммов P. aeruginosa.
В процессе культивирования эталонных штаммов P. aeruginosa в лунках, содержащих 200 мкл 0,9% раствора натрия хлорида или 200 мкл питательного бульона, отмечен двухфазный характер накопления кристаллического фиолетового биопленкой, что не описано в литературе. Первый пик накопления кристаллического фиолетового совпадает со стадией созревания биопленки и определяется интенсивностью аутометаболизма клеток и их метаболической кооперацией. Уменьшение способности к накоплению красителя на 2-е сутки наблюдения может быть связано с гибелью части сообщества в результате несоответствия метаболических возможностей и метаболической потребности созревающей биопленки. Погибшие клетки, находящиеся в составе сообщества, становятся при этом питательным субстратом, который позволяет ликвидировать относительную трофическую недостаточность и предопределяет возникновение второго пика ростовой активности, а также возможность дифферен-цировки биопленки и достижения ей критической массы к 3-м суткам наблюдения. Развивающаяся на 4-е сутки дисперсия биопленки определяет начало нового жизненного цикла.
Особенностью культивирования биопленки клинических штаммов P. aeruginosa в лунках планшета, содержащих 200 мкл 0,9% раствора натрия хлорида или 200 мкл питательного бульона, была пролонгация фазы созревания биопленки, что, вероятно, связано с низкой метаболической активностью, присущей "агрессивным" клиническим штаммам микроорганизмов и проявлялось in vitro монотонностью показателей накопления красителя в 1-е и 2-е сутки культивирования. Затем, вероятно, наступала стадия дифференци-ровки биопленки, характеризующаяся независимостью от наличия питательного субстрата. In vitro это совпадало с увеличением накопления кристаллического фиолетового к 3-м суткам. Сроки наступления стадии дисперсии биопленки не отличались от таковых у биопленок, образованных эталонными штаммами.
Нам представляется доказанным, что способность к формированию биопленок определяется не только описываемыми в источниках литературых неспецифическими факторами адгезии, "новыми" генетическими особенностями микроорганизмов, образующих биопленку, и обусловленных экспрес-
сией специфических генов, феноменом Quorum Sensing, типом используемых микропланшетов и прочими факторами, но и биологической природой возбудителя, модификацией его в клинических условиях [28—30]. Выводы
1. Способность образования биопленки микроорганизмами, являясь одним из генетически детерминированных факторов их патогенности, имеет важное значение в патогенезе инфекционно-воспалительных осложнений, развивающихся в бронхиальном дереве в остром и раннем периодах травматической болезни спинного мозга.
2. Кинетика биопленок, образованных эталонными и клиническими штаммами S. aureus, характеризуется увеличением микробной биомассы в течение 1—3-х суток культивирования с последующим уменьшением к 4-м суткам, что соответствует ее одному полному жизненному циклу.
3. Процесс биопленкообразования эталонными штаммами P. aeruginosa имеет двухфазный характер — последовательной смены фаз усиления и подавления роста биомассы, что обусловлено несоответствием метаболических возможностей отдельных представителей микробного сообщества и метаболических потребностей созревающей биопленки.
4. Образование биопленки клиническими штаммами P. aeruginosa характеризуется пролонгацией стадии созревания в сроки до 2-х суток культивирования с последующим быстрым ростом биомассы к 3-м суткам и дисперсией к 4-м суткам, что связано со значительной "агрессией" указанных штаммов и их потенциальной способностью к генерализации инфекционного процесса.
5. Знание особенностей кинетики микробных биопленок и стадий их развития для конкретных возбудителей бронхо-легочных инфекционных осложнений может быть использовано при разработке новых способов антибактериальной терапии указанной патологии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Крылов В.В., Галанкина И.Е., Поздняков А.В., Гринь А.А., Попов С.В. Причины летальных исходов и ошибки диагностики при повреждениях позвоночника и спинного мозга у больных с сочетанной травмой. Нейрохирургия. 2003; 3: 17—21.
2. Проценко Д.Н., Романовский Ю.Я., Яковлев С.В., Гельфанд Б.Р. Возбудители нозокомиальной пневмонии, связанной с ИВЛ (НПИВЛ) у больных с тяжелой травмой. Вестник интенсивной терапии. 2003; 2: 39—44.
3. Гринь А.А., Горохова Е.Н. Множественные и многоуровневые повреждения позвоночника. Нейрохирургия. 2008; 4: 52—9.
4. Лукьянов Д.С., Шевченко В.П., Сизиков М.Ю. Актуальные вопросы лечения острой позвоночно-спинномозговой травмы шейного отдела позвоночника. В кн.: Материалы VII научно-практической конференции травматологов и ортопедов "Актуальные проблемы травматологии и ортопедии: возможности, ошибки и осложнения". Томск; 2012: 43—4.
5. Руднов В.А., Бельский Д.В., Белкин А.А. Этиологическая структура и характер резистентности возбудителей инфекций нижних дыхательных путей в отделении интенсивной терапии нейрохирургического профиля. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2005; 2: 50.
6. Соколов Д.М., Соколов М.С. Популяционная плотность бактерий как форма их эволюционной адаптации. Агро XXI. 2013; 4—6: 3—5.
7. Сидоренко С.В. Роль бактериальных биопленок в патологии человека. Инфекции в хирургии. 2012; 3: 16—20.
8. Вознесенский Н.А. Биопленки — терапевтическая мишень при хронических инфекциях. Пульмонология и аллергология. 2008; 3: 4.
9. Чернявский В.И. Бактериальные биопленки и инфекции (лекция). Annals of Mechnikov Institute. 2013; 1: 86—90.
10. Шагинян И.А., Чернуха М.Ю. Неферментирующие грамотри-цательные бактерии в этиологии внутрибольничных инфекций: клинические, микробиологические и эпидемиологические особенности. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2005; 3: 271—85.
11. Шуб Г.М., Швиденко И.Г., Пронина Е.А., Белобородова Н.В. Материалы к элективному курсу "Микробные сообщества". Саратовский научно-медицинский журнал. 2010; 2: 245—7.
12. Белобородова Н.В., Байрамов И.Т. Микробные биопленки. В кн.: Материалы Vежегодной московской конференции "Гнойно-септические заболевания у детей" с участием регионов России и стран СНГ. М.; 2009: 7—38.
13. Белобородова Н.В. Клиническое значение микробных биопленок. Available at: http://www.internist.ru/articles/cardiology/cardio-logy_216.html.
14. Хренов П.А., Честнова Т.В. Обзор методов борьбы с микробными биопленками при воспалительных заболеваниях. Вестник новых медицинских технологий. 2013; 1.
15. Тец В.В. Микроорганизмы и антибиотики. Нозокомиальные инфекции. СПб.: КЛЕ-Т; 2007.
16. Голуб А.В. Бактериальные биопленки — новая цель терапии? Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2012; 1: 23—9.
17. Лямин А.В., Боткин Е.А., Жестков А.В. Методы выявления биопленок в медицине: возможности и перспективы. Клиническая микробиология и антибактериальная химиотерапия. 2012; 1: 17—22.
18. Чеботарь И.В., Маянский А.Н., Кончакова Е.Д., Лазарева А.В., Чистякова В.П. Антибиотикорезистентность биопленочных бактерий. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2012; 1: 51—8.
19. Lasa I., Del Pozo J.L., Penades J.R., Leiva J. Bacterial biofilms and infection. An. Sist. Sanit. Navar. 2005; 32: 163—75.
20. O'Toole G.A., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Ann. Rev. Microbiol. 2000; 54: 49—79.
21. Гостев В.В., Сидоренко С.В. Бактериальные биопленки и инфекции. Журнал инфектологии. 2010; 2 (3): 4—15.
22. Donlan R.M. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganism. Clin. Microbiol. Rev. 2002; 15: 167—93.
23. Михайлова Е.С., Червинец Ю.В., Червинец В.М., Гаврило-ва О.А., Самоукина А.М. Способность к формированию биопленок у микроорганизмов, выделенных из верхних отделов ЖКТ у больных хроническим холециститом и ЖКБ. Успехи современного естествознания. 2009; 7: 76—7.
24. Ульянов В.Ю., Лунева И.О., Ульянова Е.В. Способность госпитальных штаммов St.aureus к пленкообразованию. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2012; 5: 89.
25. Серегина Н.В. Обзор биофизических особенностей микробной адгезии. Вестник новых медицинских технологий. 2008; 3: 175—7.
26. Ульянов В.Ю. Способность госпитальных штаммов Ps. aeruginosa к пленкообразованию. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2012; 2: 52.
27. Wagner V.E., Gillis R.J., Iglewsky B.N. Transcriptome analysis of quorum-sensing regulation and virulence factor expression in Ps. aeruginosa. Vaccine. 2004; 22: 15—20.
28. Лагун Л.В., Тапальский Д.В., Жавороник С.В. Интенсивность образования микробных биопленок микроорганизмами, выделенными при пиелонефритах и мочекаменной болезни. Медицинский журнал. 2012; 4: 64—7.
29. Costerton W., Veeh R., Shirliff M., Pasmore M., Post C., Ehrlich G. The application of biofilm science to the stady and control of chronic bacterial infections. J. Clin. Invest. 2003; 112: 466—7.
30. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Бактериальные биопленки как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и в организме хозяина. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011; 3: 99—109.
REFERENCES
1. Krylov V.V., Galankina I.E., Pozdnyakov A.V., Grin' A.A., Popov S.V. Causes of death and error diagnosis of injured spinal column and spinal cord in patients with associated trauma. Neyrokhirurgiya. 2003; 3: 17—21. (in Russian)
2. Protsenko D.N., Romanovskiy Yu.Ya., Yakovlev S.V., Gel'fand B.R. Causative agents of hospital-acquired pneumonia associated with mechanical ventilation (NPIVL) in patients with severe trauma. Vest-nik intensivnoy terapii. 2003; 2: 39—44. (in Russian)
3. Grin' A.A., Gorokhova E.N. Multiple and multi-level spinal injury. Neyrokhirurgiya. 2008; 4: 52—9. (in Russian)
4. Luk'yanov D.S., Shevchenko V.P., Sizikov M.Yu. Topical issues of the treatment of acute spinal cord injury of the cervical spine. In: Materialy VII nauchno-prakticheskoy konferentsii travmatologov i ortopedov "Aktual'nye problemy travmatologii i ortopedii: vozmozh-nosti, oshibki i oslozhneniya". Tomsk; 2012: 43—4. (in Russian)
5. Rudnov V.A., Bel'skiy D.V., Belkin A.A. The etiological structure and the nature of bacterial resistance lower respiratory tract infec-
tions in the intensive care neurosurgical. Klinicheskaya mikrobio-logiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2005; 2: 50. (in Russian)
6. Sokolov D.M., Sokolov M.S. The population density of the bacteria as a form of evolutionary adaptation. Agro XXI. 2013; 4—6: 3—5. (in Russian)
7. Sidorenko S.V. The role of bacterial biofilms in human pathology. Infektsii vkhirurgii. 2012; 3: 16—20. (in Russian)
8. Voznesenskiy N.A. Biofilms — a therapeutic target in chronic infections. Pul'monologiya i allergologiya. 2008; 3: 4. (in Russian)
9. Chernyavskiy V.I. Bacterial biofilms and infections (lecture). Annals of MechnikovInstitute. 2013; 1: 86—90. (in Russian)
10. Shaginyan I.A., Chernukha M.Yu. Non-fermentative Gram-negative bacteria in the etiology of nosocomial infections: clinical, microbiological and epidemiological features. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2005; 3: 271—85. (in Russian)
11. Shub G.M., Shvidenko I.G., Pronina E.A., Beloborodova N.V. Materials for the elective course "Microbial community". Saratovskiy nauchno-meditsinskiy zhurnal. 2010; 2: 245—7. (in Russian)
12. Beloborodova N.V., Bayramov I.T. Microbial biofilms. In: Materialy V ezhegodnoy moskovskoy konferentsii "Gnoyno-septicheskie zabol-evaniya u detey" s uchastiem regionov Rossii i stran SNG. Moscow; 2009: 7—38. (in Russian)
13. Beloborodova N.V. The clinical significance of microbial biofilms. Available at: http://www.internist.ru/articles/cardiology/cardiol-ogy_216.html. (in Russian)
14. Khrenov P. A., Chestnova T.V. Review of methods to control microbial biofilms in inflammatory diseases. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. 2013; 1. (in Russian)
15. Tets V.V. Microorganisms and antibiotics. Nosocomial infections [Mikroorganizmy i antibiotiki. Nozokomial'nye infektsii], Saint Petersburg: KLE-T; 2007. (in Russian)
16. Golub A.V. Bacterial biofilms — a new goal of therapy? Klinicheska-ya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2012; 1: 23—9. (in Russian)
17. Lyamin A.V., Botkin E.A., Zhestkov A.V. Methods for detection of biofilms in medicine: opportunities and prospects. Klinicheskaya mi-krobiologiya i antibakterial'naya khimioterapiya. 2012; 1: 17—22. (in Russian)
18. Chebotar' I.V., Mayanskiy A.N., Konchakova E.D., Lazareva A.V., Chistyakova V.P. Biofilm antibiotic resistance of bacteria. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2012; 1: 51— 8. (in Russian)
19. Lasa I., Del Pozo J.L., Penades J.R., Leiva J. Bacterial biofilms and infection. An. Sist. Sanit. Navar. 2005; 32: 163—75.
20. O'Toole G.A., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development. Ann. Rev. Microbiol. 2000; 54: 49—79.
21. Gostev V.V., Sidorenko S.V. Bacterial infection and biofilm. Zhurnal infektologii. 2010; 2 (3): 4—15. (in Russian)
22. Donlan R.M. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganism. Clin. Microbiol. Rev. 2002; 15: 167—93. (in Russian)
23. Mikhaylova E.S., Chervinets Yu.V., Chervinets V.M., Gavrilova O.A., Samoukina A.M. The ability to form biofilms of microorganisms isolated from the upper gastrointestinal tract in patients with chronic cholecystitis and cholelithiasis. Uspekhi sovremennogo est-estvoznaniya. 2009; 7: 76—7. (in Russian)
24. Ul'yanov V.Yu., Luneva I.O., Ul'yanova E.V. The ability of hospital strains St.aureus to film formation. Mezhdunarodnyy zhurnal priklad-nykh i fundamental'nykh issledovaniy. 2012; 5: 89. (in Russian)
25. Seregina N.V. Review of the biophysical characteristics of microbial adhesion. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. 2008; 3: 175— 7. (in Russian)
26. Ul'yanov V.Yu. The ability of hospital strains Ps.aeruginosa to film formation. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khi-mioterapiya. 2012; 2: 52. (in Russian)
27. Wagner V.E., Gillis R.J., Iglewsky B.N. Transcriptome analysis of quorum-sensing regulation and virulence factor expression in Ps.aeruginosa. Vaccine. 2004; 22: 15—20.
28. Lagun L.V., Tapal'skiy D.V., zhavoronik S.V. The intensity of the formation of microbial biofilms of microorganisms isolated in pyelonephritis and urolithiasis. Meditsinskiy zhurnal. 2012; 4: 64—7. (in Russian)
29. Costerton W., Veeh R., Shirliff M., Pasmore M., Post C., Ehrlich G. The application of biofilm science to the stady and control of chronic bacterial infections. J. Clin. Invest. 2003; 112: 466—7.
30. Romanova Yu.M., Gintsburg A.L. Bacterial biofilms as a natural form of existence of bacteria in the environment and in the host. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2011; 3: 99—109. (in Russian)
Поступила 09.01.14 Received 09.01.14
