CC BY
44
свидетельствуют о высокой реактивности всех звеньев микроге-моциркуляторного русла в миокарде левого и правого желудочков сердца при действии ПГГ, имеющие место в 1-7-е сутки экспериментального воздействия.
Таблица 2
Изменения сосудов микроциркуляции в миокарде левого и правого желудочков сердца у крыс (М±т) в разные сроки адаптации к гипобарической гипоксии
Показатели контроль 1 сутки 7 сутки 15 сутки 30 сутки
л.ж. пр ж. л.ж. пр. ж. л.ж. пр. ж. л.ж. пр. ж. л.ж. пр. ж.
Ба.н., мкм 43,2 ±3,3 40,5 ±1,9 45,5 ±4,1 44,3 ±2,5 49,6 ±3,9 44,5 ±2,1 45,8 ±3,5 42,4 ±1,6 46,9 ±3,4 43,1 ±1,9
Ба.в., мкм 31,5 ±1,7 30,1 ±1,5 36,9 ±1,5* 37,7 ±2,2* 37,7 ±1,9* 36,9 ±2,6* 33,9 ±2,2 37,3 ±2,4* 33,6 ±2,1 34,6 ±2,0*
Т.ст., мкм 11,7 ±1,3 10,4 ±0,8 8,6 ±0,7* 6,6 ±0,6* 11,9 ±1,3 7,6 ±0,5* 11,9 ±2,1 5,1 ±0,9 13,3 ±0,9 8,5 ±1,5
Б.у., мкм 27,9 ±2,1 30,1 ±1,8 33,5 ±1,9* 35,6 ±1,5* 34,2 ±1,5* 36,2 ±2,1* 30,8 ±1,8 36,2 ±2,1* 31,5 ±1,5 34,9 ±1,9*
Ок., мкм 3,2 ±0,2 3,1 ±0,3 4,2 ±0,3* 4,0 ±0,3* 4,3 ±0,4* 4,4 ±0,4* 3,9 ±0,5 4,3 ±0,5* 3,6 ±0,3 4,2 ±0,5*
Ч.Т 2 Мк., мм 2733 ±209 2310 ±240 3245 ±187* 2840 ±235 3310 ±220* 2973 ±261* 3196 ±253* 2881 ±130* 3207 ±239 2510 ±213
Примечание: * - различия достоверны по сравнению с контролем
Прерывистая гипоксическая тренировка сидет со структурно-функциональными адаптивными имениями в органах и тканях по мере увеличения продолжительности действия стимула [6]. Результаты исследования показали, что на 15-30 сутки прерывистой гипобарической тренировки имеют место внутриорганные особенности изменений сосудов микрогемоциркуляции и их реактивности на действие гипоксических стимулов (табл.2). После сеанса ПГГ просвет артериальных микрососудов в левом желудочке сердца практически не изменяется, при этом неизменными остаются наружные размеры мелких артерий и артериол с тенденциями к увеличению толщины сосудистой стенки. При визуальном рассмотрении гистологических препаратов установлено уплотнение артериальных сосудистых стенок, в которых хорошо видны крупные ядра гладкомышечных клеток. Исчезают внесосудистые реактивные изменения, отмеченные в первые дни эксперимента (1-7 сутки), в частности, изменения проницаемости, интерстициальный и паравазальный отеки.
На 15-е сутки количество функционирующих капилляров в миокарде левого желудочка сердца после сеанса ПГГ достоверно повышено, при неизменном диаметре обменных сосудов. При этом просвет венул и мелких вен несколько повышен (р>0,05). На 30 сутки реакции всех звеньев микрогемоциркуляторного русла в левом желудочке сердца после гипоксичесекого воздействия выражено незначительно. В целом реакции сосудов микрогемоциркуляции в левом желудочке сердца коррелируют с изменениями газового состава и КОС артериальной крови, в которой, как было указано выше, отмечается тенденция к улучшению аэрации, с некоторым повышением РаО2 и снижением ионов Н+. в правом желудочке сердца реактивность сосудов микрогемоциркуляции на 15-30 сутки ПГГ сохраняется повышенной. Подтверждением этому служит достоверно высокий просвет артериальных микрососудов после гипоксических сеансов на 15-30 сутки эксперимента. При этом достоверно увеличены диаметры капилляров и просвет мелких вен и венул.
Эти данные говорят о повышении кровотока в правом желудочке сердца при действии ПГГ. В основе этого лежит повышенная нагрузка на правые отделы сердца, что связано с повышенной реактивностью сосудов малого круга кровообращения и высоким сосудистым сопротивлением, сохраняющиеся при гипоксии на 15-30-е сутки тренинга. увеличение насосной функции миокарда в условиях сохраняющейся артериальной гипоксе-мии сопряжено с возникновением тканевой гипоксии миокарда и с повышением роли местной ауторегуляции сосудистого тонуса, ведущего к вазодилатации и росту регионарного кровотока. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о внутри-органной гетерогенности и гетерохронности реакций сосудов микрогемоциркуляции в различных отделах сердца в зависимости от длительности воздействия ПГГ.
Литература
1.Балыкин М.В. Кислотно-основной гомеостаз и его регуляция в условиях высокогорья. / Организм и среда.: Новосибирск, 2003.С.143
2.Волков Н.И и др. // Физиология человека. 1998. Т.24, №3.
С. 51-63.
Ъ.Волков Н.И. // Теория и практ. физ. Культуры. 2000. №7. С.20-23.
4.Каркобатов Х.Д. и др. //Известия АН Кирг. ССР, 1986. №3.С.48-51
5. Катинас Г.С., Полонский Ю.З. // Цитоло-гия.1970.Т.12,№3.С.399-403
6. Колчинская А.З и др. // Патолог. физиол. и экс-пер. терапия 2002. Вып. 3. С.52-54.
7. Меерсон Ф.З. Адаптационная медицина: механизмы и защитные эффекты адаптации. М., 1993. 248 с.
8. Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г. Адаптация к стрессорным ситуациям и физическим нагрузкам. М.: Медицина, 1988. 256с.
9. Шидаков, Ю. Х.-М. диология. Бишкек, 2001. - С.
и др. Высокогорная кар-109-118.
УДК 616.36-004+616.36-002
ВОЗДЕЙСТВИЕ ФЕТАЛЬНЫХ КЛЕТОК НА СОДЕРЖАНИЕ ПРОДУКТОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЦИРРОЗЕ ПЕЧЕНИ У КРЫС
Э.М. ШЕНДЕР, А.Е. КОЛОСОВ*
Ключевые слова: цирроз печени, фетальные клетки
Окислительный стресс является важным патогенетическим звеном в возникновении цирроза печени (ЦП). Токсическое действие активных форм кислорода истощает антиоксидантную систему [1,2,6-8]. Перекисное окисление липидов при циррозе печени изучено недостаточно.
Цель работы — исследование воздействия фетальных клеток на содержание продуктов перекисного окисления липидов при экспериментальном циррозе печени (ЭЦП) у крыс. Объектом эксперимента служили 340 половозрелых беспородных крыс массой 200 г. Во всех экспериментах соблюдены требования, предъявляемые при проведении экспериментальных работ на животных.
Подопытные крысы были разделены на следующие группы: 1 - контрольная; 2 - с ЭЦП; 3 - с ЭЦП, им проводилась стимуляция регенерации печени на с помощью трансплантации суспензии тканей печени, селезенки и тимуса 18-19-дневных плодов крыс; 4. - с ЭЦП, им проводилась стимуляция регенерации печени с помощью трансплантации суспензии тканей печени, селезенки и тимуса 18-дневных плодов крыс после предварительного воздействия на эти ткани низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ). В качестве излучателя применяли гелиево-неоновый полупроводниковый аппарат с длиной волны 632 нм. Облучение велось 2-кратно по 1,7 минуты с перерывом 5 минут и плотности излучения 75 мВт/см2.
Цирроз печени воспроизводился путем длительного введения гепатотропного яда - 4-хлористого углерода. В течение 3-х месяцев (90 суток) под кожу спины вводили 50% масляный раствор 4-хлористого углерода в дозе 0,4 мл на 100 г веса животного 4 раза в неделю [8]. Трансплантат готовился от самок крыс со сроком беременности 18-19 суток. Во всех группах животных трансплантация фетальной взвеси осуществлялась сразу после создания модели ЭЦП (на 91 сутки эксперимента). Беременных самок выводили из эксперимента путем декапитации.
Использован метод гомогенизации фрагментов фетальных тканей печени, селезенки и тимуса в равных количествах. При окраске трипановым синим гомогенат представлял суспензию жизнеспособных ядросодержащих клеток 3-5х105. Трансплантацию осуществляли посредством внутрибрюшинной инъекции 1мл. приготовленной фетальной суспензии [3-5].
Животных 2-4 групп выводили из эксперимента через 70 суток после введения трансплантата путем декапитации. Активность репаративных процессов оценивали с учетом морфофункционального состояния печени. Гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином, по Ван Гизону, ШИК-реакцией. Морфометрическое исследование осуществлялось с помощью компьютерной системы анализа цветового изображения ДиаМорф-Ско (Россия). На условной единице площади в ткани печени подсчитывались диаметры клеток и их ядер, а так же митотический индекс гепатоцитов.
* 610027, г. Киров, ул. К. Маркса, 112, Кировская ГМА
Проводилось определение Т- и В-лимфоцитов непрямым методом Кунса с помощью MKAT(«Ortho») в 1мм2 гистологического среза ткани печени и селезенки. Клетки, вступившие в апоптоз, определяли с помощью специфических антител к нуклеотидам ядерной ДНК («RD systems»). В качестве вторичных антител использовали антимышиный IgG, меченный флюорохромом изотиоционатом. Индекс апоптоза (ИА) вычисляли путем определения % содержания клеток с позитивной реакцией на 500 клеток.
Таблица 1
Изменение активности процессов ПОЛ в сыворотке крови крыс (относительные единицы экстинкции) при экспериментальном циррозе печени
Группы животных (№) n Гептановая фаза Изопропанольная фаза
диеновые конъюга- ты (ДК) 232/22G Сопря- жен ные кетот- риены (СК) 248/22G Шиффовы основания (ШО) 4GG/22G диеновые конъюга- ты (ДК) 232/22G Сопряженные кетотриены (СК) 248/22G Шиффовы основания (ШО) 4GG/22G
Контроль G,839 ± G,3GG ± G,G62 ± G,385± G,287 ± G,G54 ±
(1) G,253 G,G92 G,GG1 G,124 G,G93 G,GG1
ЦП 1,54G ± 2,279 ± 2,111 ± 2,279± 2,57б± G,316 ±
(2) G,262* G,172* G,G12* G,748 * G,273* G,G36*
ЦП+фет.тк 1,237 ± 1,473 ± G,443± 1,327 ± 1,43G± G,2G6±
(3) G,159*** G,134*** G,GG2*** G,441*** G,352*** G,G18*,*W
ЦП+ фет. 1G G,94G± G,361± G,111 ± G,518 ± G,493 ± G,112 ±
тк+лаз (4) G,257** G,G9G** G,GG2** G,G14 ** G,G32** G,G13**
Для определения содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови применяли спектрофотометрический метод комплексного определения продуктов ПОЛ. Экстракцию липидов из сыворотки крови проводили гептан-изопропанольной смесью в соотношении 1:1 по объему. Оптическую плотность гептановой и изопро-панольной фаз измеряли против соответствующего контроля на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 220, 233, 278, 400 нм. При этом экстинкция при длине волн 220 нм отражала содержание изолированных двойных связей в экстрагированных липидах и использовалась нами для расчета относительного содержания продуктов липидной пероксидации. Оптическая плотность при 233 нм отражала содержание диеновых конъюгатов. Поглощение при 278 нм соответствовало концентрации вторичных молекулярных продуктов переокисления (кетодиенов и сопряженных триенов). Поглощение при длине волны 400 нм отражало число шиффовых оснований. Относительное содержание соответствующих продуктов выражали в усл. ед., расчитывая их как отношение Е 232/Е220, Е 278/ Е22, Е 400/ Е 220. Результаты обрабатывали по ЕХСЕЬ-2007. Вычисляли 1-критерий Стьюдента.
При ЭЦП в гептановой фазе во 2 группе наблюдалась активация перекисного окисления липидов. Она сопровождалась достоверным увеличением концентрации первичных (диеновых конъюгат), вторичных (сопряженных кетотриенов) и конечных (шиффовых оснований) продуктов перекисного окисления по сравнению с контролем (табл.1). В изопропанольной фазе выраженность этих изменений была значительно ниже.
Таблица 2
Изменение площади фолликулов со светлыми центрами и без них в селезенке крыс (мкм2)
Экспериментальные группы (№) Число животных Площадь фолликулов без светлых центров (M ± m) Площадь фолликулов со светлыми центрами (M ± m)
1 2Q 3151Q±6124* 143766± 42281*
2 11Q 9848±24б1*'**'*** 49919± 146Q******
3 11Q 2Q68Q± 6895** 9584Q± 29Q41**
4 11Q 31512± 9846**'*** 141761± 4428Q***
Примечание: * - достоверность различий между группами №1,2; ** -достоверность различий между группами №2,3; *** - достоверность различий между группами №2,4; Р<0,05.
Несмотря на то, что при введении взвеси фетальных тканей крысам регистрировалось снижение концентрации ПОЛ в 3 группе эксперимента, исследуемые показатели не достигали значений здоровых животных. Поэтому следующим этапом нашего эксперимента явилось предварительное воздействие на взвесь фетальных тканей НИЛИ. После облучения НИЛИ в 4 группе было выявлено снижение концентрации диеновых конъюгатов, сопряженных кетотриенов и шиффовых оснований в обеих фазах (гептановой и изопропанольной) значительно больше по сравнению с 3 группой.
Таким образом, введение фетальных клеток, облученных НИЛИ, наиболее эффективно воздействует на процессы ПОЛ.
Оно оказывает стабилизирующее влияние на мембраны клеток цирротической печени. Полученные результаты подтверждаются проведенными гистологическими исследованиями. Так, морфологически во 2 группе выявлялись атрофические изменения в тимусе и селезенке (табл.1). Нарушения процессов репаративной регенерации в печени, которые выражались достоверным уменьшением числа Т-лимфоцитов в указанных органах (рис.1).
Рис.1. Содержание Т-лимфоцитов в ткани печени (р<0,05)
В тимусе у крыс 3 и 4 групп шел рост числа лимфоцитов в корковом веществе, в селезенке - рост уровня Т- и В-лимфоцитов, в печени - активация пролиферации гепатоцитов с достоверным возрастанием митотического индекса (рис. 2) и купферовских клеток в сочетании с увеличением числа Т- и В-лимфоцитов в портальных трактах, а также увеличением числа контактов между гепа-тоцитами, лимфоцитами и купферовскими клетками (рис. 3).
Рис.3. Характеристика клеточных контактов между гепатоцитами, лимфоцитами и купферовскими клетками (р<0,05).
В то же время указанные изменения были более выражены у животных 4 группы. Исходя из полученных результатов можно утверждать, что активация перекисного окисления липидов у крыс с экспериментальным циррозом печени играет важную роль в развитии регенераторных процессов в ней и иммунной системе. Фетальные ткани, облученные лазером, ингибируют окислительный стресс и стимулируют процессы восстановления в печени.
Литература
1. Гуляева Н.В и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1988. Т.2, № 12. С.660-663.
2. Дубинина Е.Е. //Вопр. мед. химии.2001.Т.47, №6. С.561.
3. Курбатова Г.Р и др. // Лазер. новости. 2004. №1-2. С.107.
4. Курбатова Г.Р. и др. //Лазер. новости.2004. №1-2. С.107.
5. Курбатова Г.Р и др. Способ патогенетической терапии хронических заболеваний печени (реферат изобретения к патенту РФ №2203675): Лазерные новости. 2004. №1-2.С.107.
6. Никифорова Н.В и др. //Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2001. Т.132, № 11. С.565-568.
7. Николаев А.И. и др.// Тер. архив.1989, Т.61.№9,С.109—112
8. Саркисов Д.С. //Эксперим. хир. 1960. Т.3, № 1. С.3-8.
9. Choi M.K. et. al. // J. Pharm. Sci. 2007 Sep. 16;10(4):443-54.
10. Oshino N. et al. //Arch. Biochem. and Byohys. 1998. 153.4. P.116-130.
11. Robinson S. // Nurs. Stand. 2007 Jul. 4-10;21(43):59-60.
12. TanimizuN., Miyajima A. // Int. Rev. Cytol. 2007;259:1^8.
УДК 616.89-008.441.13-074: 611.018.54
МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛАЗМЫ КРОВИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ АЛКОГОЛЬНОМ ОТРАВЛЕНИИ
Л.М. ОБУХОВА, М.В. ВЕДУНОВА, К.Н. КОНТОРЩИКОВА,
Е.Б. КРЮКОВА *
Ключевые слова: хронический алкоголизм, плазма крови
Показана возможность использования клиновидной дегидратации плазмы крови для оценки интоксикации и уровня билирубина при хроническом алкогольном отравлении. Степень эндогенной интоксикации организма обуславливает общее количество аномальных особенностей структурного макропортрета плазмы крови. Тип особенностей определяется характером субстрата эндогенной интоксикации. При хронической алкогольной интоксикации преобладающими являются закругленные трещины и трещины типа черная сеть, что свидетельствует о наличии воспалительных и деструктивных процессов в организме. Показана возможность диагностики гиперби-лирубинемии с помощью анализа кристаллических включений билирубина в краевой зоне дегидратированной капли.
К основным лабораторным признакам хронической алкогольной интоксикации относят превышение активности аспартатами-нотрансферазы (АсАт) над аланинаминотрансферазой (АлАт) в 1,5-2 раза, повышение активности у-глутамилтранспептидазы (ГГТП), а также наличие ацетальдегидмодифицированного гемоглобина [1]. Однако среди рутинных методов лабораторной диагностики нет специфических тестов для определения этого вида интоксикации.
Основной мишенью токсического действия алкоголя является печень: именно здесь идет разрушение 90% поступающего в организм этанола [2]. В ходе окисления алкоголя образуется токсическое соединение - ацетальдегид, который затем превращается в ацетат. Эти вещества легко соединяются с белками и фосфолипидами клеточных мембран, нарушая их функции [3-5].
При диагностике и лечении хронического алкоголизма, исключительное значение имеет контроль функционального состояния печени и уровня интоксикации организма. В этой ситуации вполне оправдан поиск новых объективных тест-методов, пригодных для решения данных задач. К таковым, на наш взгляд, можно отнести метод клиновидной дегидратации биожидкостей [6]. Принцип данного метода заключается в анализе системной организации биожидкости после перевода ее в твердую фазу при испарении жидкости из капли на подложке. Фазовый переход из жидкого состояния в твердотельное организует структурный статический порядок, который становится наблюдаемым. Данный феномен обусловлен неравновесным состоянием наноструктур белка, возникающих при дегидратации далекой от термодинамического равновесия открытой системы «белок - вода» [7].
Цель — изучение применения метода клиновидной дегидратации для оценки хронической алкогольной интоксикации и функционального состояния гепатобилиарной системы.
При подборе больных с хронической алкогольной интоксикацией учитывали анамнестические данные: количество и качество суточного употребления алкоголя, длительность его приема. Исключались другие этиологические факторы - вирусные, иммунные, метаболические, лекарственные. Обследован 21 больной с хронической алкогольной интоксикацией - 15 мужчин и 6 женщин в возрасте 27-60 лет (группа 1). Группу 2 составляли 20 пациентов с поражениями печени неалкогольного генеза (хронический холецистит и фиброз печени): 6 мужчин и 2 женщины в возрасте от 16 до 62 лет. В контрольную группу (группа 3) входило 15 практически здоровых людей: 9 мужчин и 6 женщин в возрасте 19-57 лет.
Было изучено содержание общего и связанного билирубина, активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансфера-зы, у-глутамилтранспептидазы, уровень веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) плазмы крови и эритроцитов параллельно с изучением структурного макропортета плазмы крови. Химический состав кристаллических включений краевой зоны дегидратированной капли плазмы крови определяли методом инфракрасной (ИК) Фурье спектроскопии. Спектры пропускания регистрировались в области частот от 35G до 5GGG см-1 с разрешением 2 см-1 на вакуумном Фурье-спектрометре «Bruker IFS-113v», совмещенном с оптическим микроскопом «IR Microscope A590».
Результаты. Уровень общего билирубина при хроническом алкогольном отравлении был достоверно выше, чем в контрольной группе (табл.1). Также повышался уровень связанного билирубина (по сравнению с контролем), при практически неизменном содержании свободного.
Таблица І
Величина биохимических показателей при хронической алкогольной интоксикации и поражениях печени неалкогольного генеза (М±т)
Показатели Группа 3 Группа 1 Группа 2
ВНСММ плазмы, усл.ед 8,55± 2,973 21,86± 3,53^ З0,З5± 4,49^
ВНСММ эритроцитов, усл.ед 21,66± 6,870 26,06± 3,98 36,71± 5,88^
Билирубин общий, мкмоль/л 11,42± 2,00 17,74± 2,5Г 22,67±7,52^
Билирубин связанный, мкмоль/л 2,97± 0,81 8,79 ± 3,03^ 8,8±З,З4^
Билирубин свободный, мкмоль/л 8,45± 1,58 6,27± 2,38 13,87±4,69
АсАт, ед/л 24,52± 6,60 64,75± 11,03^ 186,50±56,78^
АлАт, ед/л 15,2± 4,24 36,75± 9,25^ 285,5±7З,15^
ГГТП, ед/л 19,84±1,51 127,8±2З,47^ 71,68±18,25^
Примечание: * - достоверные отличия в сравнении с контролем (р<0,05)
При поражениях печени неалкогольного генеза имеет место значительный рост всех фракций билирубина, причем эти показатели превышают среднюю границу нормы (табл.1). В группах хронического алкогольного отравления и при неалкогольных поражениях печени были выявлены показатели активности трансфераз, превышающих таковые в контроле (табл.1). Соотношение АсАт/АлАт у больных группы 1 составляет ~ 1,76, что является одним из признаков хронической алкогольной интоксикации [1]. В случаях поражения печени неалкогольного генеза данное соотношение активности ферментов было <1 (0,65), при наблюдаемой более значительной гиперферментемии, чем в группе больных с алкогольной интоксикацией. Вероятно, данный факт обусловлен преобладанием в группе 2 больных с хроническим холециститом, поскольку при данном заболевании коэффициент АсАт/АлАт значительно меньше 1[8].
Фермент ГГТП является высокочувствительным индикатором при заболеваниях печени [9]. Активность ГГТП в плазме крови больных хроническим алкоголизмом в 6,5 раз выше показателя в контрольной группе и в 1,8 раз превышает таковую в группе сравнения (табл.1). Хроническое алкогольное поражение гепатобилиарной системы в 74% случаев идет с ростом активности ГГТП даже в период абстиненции [8]. При алкогольном отравлении уровень ВНСММ в плазме крови возрастал более чем в 2 раза при практически неизменном соотношении ВНСММ в эритроцитах по сравнению со здоровыми (табл. 1). У больных исследуемой группы (хронический алкоголизм) была диагностирована 24 степень эндогенной интоксикации. При изучении структурного макропортрета плазмы крови обнаружено повышение общего количества особенностей при хроническом алкогольном отравлении (7,37±1,75) и поражениях печени неалкогольного генеза (8,6±0,71) по сравнению с контролем (1,57±1,22). Причем количество особенностей в высохшей капле плазмы крови при алкоголизме возрастало по мере увеличения уровня ВНСММ (рис.1).
Нижегородская государственная медицинская академия, г. Нижний Новгород, Научный центр волоконной оптики РАН, г. Москва
Рис. 1. Количество особенностей в структурном макропортрете плазмы крови при хронической алкогольной интоксикации при различной степени
эндогенной интоксикации организма:
2-я
- 3-я
4-я
