CC BY
63
Радиофизические методы в медицине и экологии Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 5 (3), с. 142-145
УДК 531.76
ВОССТАНОВЛЕНИЕ ВОЛНОВОГО ФРОНТА МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ИЗОБРАЖЕНИЙ В УСЛОВИЯХ ЗАПИСИ ГОЛОГРАММ С НЕРЕГУЛЯРНЫМИ ФАЗОВЫМИ ИСКАЖЕНИЯМИ СКАНИРУЮЩЕГО СИГНАЛЬНОГО ПУЧКА
© 2011 г. Ю.Н. Захаров, В.В. Лобынцева, М.С. Муравьева
Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
Поступила в редакцию 26.05.2011
Рассматривается задача получения цифровых голограмм биологических культур с использованием микроскопа LSM-510. Приведены основные принципы получения и восстановления голограмм, а также описаны проблемы, связанные с нерегулярными искажениями сканирующего сигнального пучка, и пути их решения.
Ключевые слова: микроскопия, голография, фазовые искажения.
Введение
В настоящее время микроскопия все больше превращается из наблюдательной в измерительную. Так, научное исследование клеточных культур сердечных и нейрональных тканей невозможно без использования оптических микроскопов с хорошим разрешением. Однако наблюдаемое в окуляры микроскопа, выведенное на экран монитора или захваченное в цифровом виде изображение может в значительной мере отличаться от реального исследуемого биологического объекта. Оператор может сильно ошибаться в интерпретации полученных изображений вследствие малого контраста и интегральных искажений при прохождении неоднородного полупрозрачного объекта. Это было доказано нами на примере серии контрольных измерений с тестовым объектом - микрометрической сеткой, когда в качестве погружной среды иммерсионного объектива были использованы среды с температурной или плот-ностной стратификацией. При таких условиях наблюдения искажались как поперечные, так и продольные размеры объектов. Соответственно, неоднородная среда приведет к неоднородным искажениям изображения.
Даже если для исследования живых нейрональных культур и переживающих срезов используется метод сканирующей конфокальной микроскопии, в случае таких прозрачных объектов с малыми различиями коэффициента поглощения или, в зависимости от схемы, отражения, изображения получаются малоконтраст-
ными и содержащими информацию лишь о поперечном строении выбранного сечения. Для получения объемной структуры объекта необходимо получить его трехмерное представление. Это возможно при использовании метода последовательного сканирования каждого уровня. В этом случае результат говорит об отражающих (пропускающих) свойствах каждой плоскости и, в принципе, можно построить трехмерную форму мембран клеток и выделить более плотные внутриклеточные образования. Но даже при этом теряется большая часть информации, которая содержится в фазе волны.
Нашей целью являлось проведение измерений и амплитуды, и фазы объектной волны на основе стандартного оборудования, имеющегося во многих научных лабораториях. Поэтому мы доработали конфокальный сканирующий микроскоп LSM-510, расширив его методы работы получением информации не только об интенсивности, но и о фазе (об интегральной оптической толщине объекта), что открывает возможность ЗБ-имиджинга биологических объектов.
Запись цифровых голограмм лазерным сканирующим микроскопом
Благодаря используемым в сканирующей микроскопии лазерам с хорошей когерентностью и цифровому методу получения и обработки изображения мы без серьезных конструктивных изменений можем записать цифровую голограмму исследуемого объекта и восстано-
вить комплексную амплитуду объектной волны. Важными преимуществами разрабатываемого нами метода являются высокое разрешение продольных измерений получаемых изображений и объемность, необходимая для адекватного восприятия и изучения биологических объектов. Все действия осуществляются бесконтактно. Данный метод значительно ускоряет процесс накопления данных по сравнению со стандартным методом z-сканирования, что дает возможность регистрации динамических процессов при исследовании биологических объектов. Также экономится объем цифровой памяти, необходимой для записи и восстановления изображения с высоким разрешением.
Для записи цифровой осевой голограммы в сканирующем конфокальном режиме необходимо завести в регистрирующий канал опорный луч, когерентный с объектным. Этот луч мы получаем делением зондирующего луча по амплитуде. При этом необходимо учитывать как принципы получения конфокальных изображений при оптическом сканировании, так и конструктивные особенности канала прохождения сканирующего луча. Если получать опорный луч путем помещения полупрозрачной пластинки непосредственно перед объектом, как в широкопольной микроскопии [1], то такой луч в силу особенности системы сканирования отклонится от оптической оси и не будет попадать в регистрирующий блок. Поэтому мы использовали в качестве светоделителя полупрозрачное зеркало, расположенное до оптических сканеров. Также было соблюдено равенство длин оптических путей опорной и объектной волн, необходимое для формирования голограммной структуры.
Наш метод дает возможность выполнять морфологические измерения с поперечным разрешением 0.2 мкм и измерения оптической разности хода с точностью 0.01 мкм. Оптические дисперсионные характеристики получаются из фазовых данных разных частот, независимое определение геометрической длины и показателя преломления - при совмещении голографической записи с z-сканированием. При этом временное разрешение определяется только скоростью сканирования.
Однако на пути практического применения разработанного метода при получении цифровых голограмм биологических культур в реальных рабочих режимах сканирования микроскопа Zeiss LSM-510 мы столкнулись с рядом трудностей. В частности, при восстановлении голограммы биологического объекта видна сложная фазовая структура, изменяющаяся по
мере сканирования. Для анализа этого явления решено было проверить, является ли это следствием нестационарности биологического объекта или искажения вызваны оптической схемой. Проверяя метод записи на стационарных тестовых объектах - плоском и сферическом зеркалах, мы также наблюдали нестабильную, меняющуюся от снимка к снимку интерференционную картину. Это показано на рис. 1. Проанализировав возможные причины этой неста-ционарности, мы пришли к выводу, что искажения вносятся блоком сканирования лазерных лучей. Невоспроизводимость этой паразитной фазовой добавки в восстановленном изображении приводит к желанию компенсировать ее каждый раз непосредственно во время голографического процесса.
Возможные способы компенсации искажений
Устранить фазовые искажения при записи голограммы не представляется возможным, так как, по-видимому, они следуют из конструкции самого микроскопа при его работе в сканирующем режиме записи, поэтому нами предлагаются методы компенсации этих искажений.
Первый метод - это восстановление волнового фронта кодированным опорным пучком. При восстановлении используется опорный пучок с фазовыми искажениями, компенсирующими те, которые возникают в объектном при записи голограммы. Вообще идея метода голограмм с кодированным опорным пучком [2] состоит в том, что при получении голограммы плоский волновой фронт опорной волны искажается кодовой фазовой маской. При восстановлении голограммы излучением, проходящим через ту же кодовую маску (то есть получающим те же фазовые искажения), изображение возникает в том же виде, какой имел объект при записи, и может быть идентифицировано с помощью фотоприемного устройства или визуально. При отличии же фазовых искажений от тех, что были использованы при записи, изображение не восстанавливается. В нашем случае, если получить информацию о фазовых искажениях оптической схемы, при цифровом восстановлении голограммы можно смоделировать восстанавливающий волновой фронт, сопряженный с ними - виртуально перенести их в опорный пучок и использовать его для безаберрационного восстановления голограммы. Анализ показывает, что эффективность метода высока даже тогда, когда фазовые искажения достаточно велики.
Рис. 1. Интерферограммы поверхности одной и той же сферической линзы, полученные при сканировании в
различных реализациях
Рис. 2. Принципиальная оптическая схема регистрации цифровых голограмм с разделением сигнальных волн по поляризации. X/Y - блок сканирования, Ideal S - идеальное зеркало, Re S -объект, R - зеркало для формирования опорной волны, У4 - двулучепреломляющая фазовая пластинка
Второй метод - аналог двухэкспозиционной голографической интерферометрии [2]. Если голограмма, на которой записано более одной волны, освещается когерентным светом, то восстановленные волны могут интерферировать друг с другом (или с любой другой когерентной волной, исходящей из освещающего источника). Метод двухэкспозиционной интерферометрии заключается в том, что голограмма до фотографической обработки экспонируется дважды: один раз, когда поверхность находится в исходном состоянии, другой раз - когда она деформирована. При обеих экспозициях используется одинаковая опорная волна. После того как экспонирование голограммы закончено, ни сам предмет, ни оптические элементы голографической установки не внесут вклад в получаемую на этапе восстановления интерферограмму. Как волна сравнения, характеризующая начальное состояние поверхности, так и волна, соответствующая измененному состоянию поверхно-
сти, восстанавливаются одновременно при освещении голограммы волной, подобной исходной опорной волне. К восстанавливающему пучку предъявляются такие же требования, как и при освещении любой обычной голограммы.
Пусть в некоторый момент времени ?1 регистрируется оптическая волна, комплексная амплитуда которой в плоскости голограммы равна и1(х,у). В момент времени ?2 на той же пластинке регистрируется вторая волна с амплитудой и2(х,у). Это обычный двухэкспозиционный голографический процесс: сначала фотопластинка экспонируется волной и1(х,у) и одновременно опорной волной и^(х,у), а затем волной и2(х,у) вместе с волной ЦХх,у). При освещении голограммы, образовавшейся после проявления фотопластинки, волной и%_(х,у) комплексная амплитуда восстановленной волны пропорциональна сумме иI (х,у) + и2(х,у), а освещенность определяется выражением
IО,у) = \и1(х,у) + и2{х,У)\2. (1)
В применении к интерферометрии и1=и0(х,у) представляет собой волну в плоскости голограммы, рассеянную или пропущенную каким-либо объектом, а и2= и0 (х,у) - волну от того же объекта после того, как он был слегка деформирован или претерпел какие-либо иные изменения. В нашем случае аналогичный метод применяется для избавления от фазовых искажений, и и0 - это волна, отраженная от идеального зеркала, а и 0 - волна, отраженная от объекта. При этом выявляется фазовая структура объекта, а фазовые искажения оптического тракта убираются. Неоднородность объекта влияет только на комплексную амплитуду волны и0, поэтому можно записать
и0 (х, у )= 1 • ехр[- /ф(х, у)], (2)
u0(x, У) = Л(х У)^ ехр{- ¿[ф^ У)+ Aф(x, у)]}. (3)
Тогда для освещенности, создаваемой восстановленной волной в информационном порядке, получим
I(х, у) = |1 • ехр[- /ф(х, у)] +
+ Л(х У) • ехР{- ¿[ф^ у) + Aф(x, у)]}2 = (4)
= 1 + Л(х, у)+ 2А(х, у)соэ[Дф(х, у)] откуда можно получить изменение фазы Дф, которое отвечает в данном случае за фазовый набег волны, прошедшей через объект. По изменению фазы Дф возможно восстановить оптическую длину пути, а следовательно, и изменение толщины объекта.
Цифровая регистрация голограмм с нестабильным сигнальным каналом
Для одновременной регистрации волн и0 и и0 нам пришлось выполнить дополнительную доработку оптической схемы регистрации цифровых голограмм (рис. 2). С помощью пластинки Х/4 мы преобразуем поляризацию лазера в круговую, а после прохождения блока сканирова-
ния микроскопа, вносящего нерегулярный фазовый набег при каждом шаге сканирования, направляем взаимно ортогональные поляризации, полученные с помощью линейных поляризаторов, на идеальное зеркало и объект. Отраженные лучи вновь совмещаются и, объединяясь с опорным лучом, поступают в блок фотоэлектронной регистрации, где опять разделяются светоделителем, после которого поляризаторы выбирают «свою» поляризацию для разделения волн, формирующих голограмму зеркала и объекта. Таким образом, мы сделали возможной регистрацию отдельно (но в один и тот же момент времени) волны, идущей от объекта и интерферирующей с опорной волной, и волны, идущей от идеального зеркала, также интерферирующей с опорной волной. Поскольку в сканирующем режиме запись изображения, а в данном случае - голограммной структуры производится поточечно, проблемы совмещения волн при восстановлении не возникает.
Выводы
1. Применение голографического процесса для получения микроскопических изображений существенно улучшает продольное разрешение.
2. Блок сканирования вносит нерегулярные фазовые искажения в зондирующий пучок, искажающий фазовый фронт объектной волны.
3. Фазовые искажения объектной волны могут быть устранены путем одновременной записи двух голограмм.
Работа выполнена при поддержке аналитической ведомственной целевой программой «Развитие научного потенциала Высшей школы» 2.1.1./6223.
Список литературы
1. Lobyntseva V.V., Zakharov Yu.N. // Physics of Wave Phenomena, 2011. V. 19. №. 1. P. 1-3.
2. Кольер Р., Беркхарт К., Лин Л. Оптическая голография. М.: Мир, 1973. 688 с.
MICROSCOPIC IMAGE WAVEFRONT RESTORATION AT HOLOGRAM RECORDING WITH IRREGULAR PHASE DISTORTIONS OF SIGNAL SCANNING BEAM
Yu.N. Zakharov, V. V. Lobyntseva, M.S. Murav’eva
The problem of obtaining digital holograms of biocultures using LSM 510 microscope is considered. Basic principles of hologram recording and restoration are presented and the ways to solve the problem related to irregular phase distortions of the signal scanning beam are discussed.
Keywords: microscopy, holography, phase distortions.
