CC BY
26
2017, Т. 159, кн. 2 С.272-282
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. СЕРИЯ ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ
ISSN 2542-064X (Print) ISSN 2500-218X (Online)
УДК 573.663
ВОССТАНОВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ Serratia marcescens NucSma(H89G) ГИДРОКСИЛАМИНОМ
Р.Г. Хамидуллина, И.И. Фазлеева, О.А. Гимадутдинов
Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань, 420008, Россия
Аннотация
Известно, что гистидин играет важную роль в каталитической активности многих нуклеаз. Выполняя функцию общего основания данных ферментов, он активирует образование гидроксила из молекулы воды, который, в свою очередь, атакуя атом фосфора диэфирной связи, вызывает ее разрыв. Ранее было установлено, что у эндонуклеазы Serratia marcescens замена гистидина на глицин приводит к инактивации этого фермента. В настоящей работе было показано, что гидроксиламин восстанавливает активность мутантного фермента эндонуклеазы Serratia marcescens, у которого гистидин в 89-м положении заменен на глицин.
Ключевые слова: эндонуклеаза, плазмида, гидроксиламин, гистидин, имидазол
Введение
Эндонуклеаза Serratia marcescens относится к ферментам, способным расщеплять как ДНК, так и РНК [1]. Ранее ген эндонуклеазы был клонирован в плазмиде pHisNucSma [2, 3], были получены мутантные белки [4], а также изучен механизм действия этого фермента [5].
В настоящее время широкое распространение получил метод химического восстановления ферментов. При добавлении в среду с неактивным мутантным энзимом низкомолекулярных соединений, сходных по химическим свойствам с утерянными аминокислотными остатками, происходит восстановление активности данного фермента.
Эффект восстановления связан с тем, что в результате мутаций исходные аминокислоты заменяются на более низкомолекулярные. В результате этого в активном центре могут образоваться своеобразные «карманы», в которые диффундируют экзогенные молекулы, содержащие утерянные при мутагенезе необходимые для катализа реакционные группы [6]. Было предположено, что такими молекулами могут служить вещества, содержащие радикалы аминокислот, а также низкомолекулярные амины [7]. Было также показано, что увеличение размера молекулы экзогенного вещества, находящегося в активном центре фермента, уменьшает восстановление его активности [8].
Метод химического восстановления активности для ДНКаз был впервые применен В.-Я. Чен с соавторами [8] к мутантной панкреатической ДНКазе, у которой в активном центре гистидин в положении 134 и 252 замещен на глицин
и аланин. Добавление в реакционную среду имидазола, а также первичных аминов приводило к увеличению активности мутантных ферментов. Такой же эффект наблюдался у мутантного фермента ДНКазы II (Н115А и Н297А) при добавлении в реакционную среду имидазола [8].
Позже М. Мидон с соавторами [9] выявили возможность восстановления имидазолом каталитической активности ряда эндонуклеаз: Steptococcus pneumonia EndA(H160A), Anabaena sp. NucA(H124A) и Serratia marcescens NucSma(H89G). Они выдвинули предположение о том, что восстановление активности фермента будет происходить не полностью, так как при замещении утерянного радикала гистидина имидазолом его расположение в активном сайте будет неоптимальным. Ими также было показано, что при базальном уровне экспрессии гена эндонуклеазы Serratia marcescens в клетках E. coli, небольшое количество фермента может синтезироваться в клетках, вызывая гидролиз хозяйской ДНК и РНК, что приводит к замедлению роста культуры.
Наряду с вышеуказанными веществами некоторые низкомолекулярные амины (этиламин, гидроксиламин, гидрозин и др.) также способны восстанавливать активность ферментов, выполняя функцию общего основания, которую в ферментах дикого типа осуществляет остаток гистидина.
На основании того, что гистидин, имидазол и амины, являющиеся нуклео-филами, могут восстанавливать активность мутантной эндонуклеазы Serratia marcescens, у которой в 89-м положении гистидин заменен на глицин [9], мы предположили, что гидроксиламин, как и гистидин, обладает отмеченной способностью.
1.1. Объекты исследования. В работе были использованы рекомбинант-ные штаммы E. coli TGE900 [4], несущие плазмиды pHisNuc<Sma(H89G) или pHisNucSma(wt). Плазмиды содержат ген мутантного или дикого вариантов NucSrna, обладающих 0%-ной или 100%-ной нуклеазной активностью соответственно. Гены в плазмиде pHisNuc<Srna находятся под контролем ^¿-промотора фага X, транскрипционная активность которого в клетках E. coli TGE900 регулируется термочувствительным С1-белком-репрессором (рис. 1) [10].
1. Материалы и методы
р - promoter
t,ori
Рис. 1. Строение плазмиды pHisNucSma [4]
1.2. Питательные среды. В работе были использованы жидкая и твердая LB-среды, в которые для создания селективных условий вносили ампициллин в концентрации 100 мкг/мл.
1.3. Влияние гидроксиламина на рост рекомбинантных штаммов E. coli TGE900 pHisNuc£ma(H89G) и E. coli TGE900 pHisNuc£ma(wt). Выращенную при комнатной температуре ночную культуру разводили в LB-бульоне, содержащем ампициллин, до оптической плотности D6oo 0.05. Полученную культуру разливали в три колбы по 10 мл, в опытные варианты добавляли раствор гидрок-силамина так, чтобы конечная концентрация гидроксиламина в среде составляла 0.2 мМ. Штаммы выращивали на качалке при комнатной температуре.
В процессе роста отбирали пробы с интервалом в 1 ч для измерения оптической плотности. Измерение оптической плотности проводили на фотоэлет-кроколориметре КФК-2 при длине волны 600 нм.
На основании полученных данных построены кривые зависимости оптической плотности от времени культивирования в среде с гидроксиламином и без него. Статическую обработку данных проводили с использованием программы Microsoft Excel.
1.4. Очистка фермента. К 100 мл среды с ампициллином добавляли 2 мл ночной культуры, выращенной при комнатной температуре, и культивировали при 28°С на качалке до достижения оптической плотности D600 0.5.
Для индукции экспрессии генов эндонуклеазы S. marcescens увеличивали температуру выращивания до 42 °С и инкубировали культуру в течение 4-5 ч. После этого клетки осаждали на центрифуге Awell MF20R (Франция) при 5000 об./мин, t = 4 °С. Далее осадок ресуспензировали в 20 мл буфера (10 мМ Tris, pH 8.2 + 1 мМ EDTA + 20 мМ имидазол) и разрушали клетки на ультразвуковом дезинтеграторе 6 раз по 1 мин с промежутком 1 мин. Обломки клеток осаждали при 14000 об./мин в течение 30 мин, надосадок отбирали и использовали для очистки фермента.
Колонки с никелевой агарозой промывали 10 мл буфера (10 мМ Tris, pH 8.2 + 1 мМ EDTA + 10 мМ имидазол). На колонки наносили по 20 мкл надосадка, осажденного при 14000 об./мин, затем промывали 10 мкл буфером (10 мМ Tris, pH 8.2 + 1 мМ EDTA + 20 мМ имидазол). Связавшиеся нуклеазы с никелевой агарозой элюировали порциями по 1 мл буфера (10 мМ Tris, pH 8.2 + 1 мМ EDTA + 200 мМ имидазол). Из каждого элюата отбирали по 10 мкл пробы.
Элюаты помещали в диализные мешочки и диализировали против 1000 мл буфера, содержащего 10 мМ Tris, pH 8.2, и 1 мМ EDTA. После диализа определяли концентрацию ферментов на приборе NanoDrop и добавляли к диализату глицерин до конечной концентрации 30%. Ферменты хранили при -20 °С.
1.5. SDS-электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле. Электрофорез вели 2-3 ч при силе тока 35 мА, затем гель окрашивали раствором Кумасси и подвергали дальнейшему анализу.
1.6. Восстановление активности мутантной нуклеазы Serratia marces-cens(H89G) гидроксиламином. Восстановление активности фермента определяли по гидролизу плазмидной ДНК. В качестве субстрата использовали ДНК плазмиды pBSK размером 3.19 kb.
Очищенный фермент NucSma(wt) разводили в 1000 раз (1 мкл фермента и 999 мкл буфера). Для разведения использовали буфер следующего состава: 1 мкл 2М Tris pH 8.2 + 1 мкл 50 мМ MgCl2 + 8 мкл дистиллированной воды.
Для реакции готовили смесь, состоящую из 10 мкл буфера, 10 мкл ДНК pBSK (15 нг/мкл), 80 мкл дистиллированной воды. Затем из полученной смеси отбирали 54 мкл и добавляли 5 мкл разведенного фермента (H89G), 1 мкл NH2OH (200 пМ) и 6 мкл дистиллированной воды в случае контроля или 6 мкл фермента (wt) в качестве контроля для дикого типа. Реакцию проводили в течение 2 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 10 мкл буфера для нанесения на электрофорез.
1.7. Электрофорез в агарозном геле. Электрофорез в агарозном геле проводили при постоянном напряжении электрического тока 8 В/см. Состав геля: 1%-ная агароза; 100 мМ трис-боратный буфер, pH 8.0.
2. Результаты и их обсуждение
Как уже отмечалось ранее, в последнее время находит большое применение метод химического восстановления ферментов, позволяющий активировать неактивные мутантные варианты энзимов путем внесения в реакционную среду веществ, сходных по свойствам с замененной в процессе мутагенеза аминокислотой [7, 9]. В связи с этим мы исследовали возможность восстановления под действием гидроксиламина неактивного мутантного варианта H89G нуклеазы S. marcescens, у которой в 89-м положении гистидин заменен на глицин.
Известно, что гидроксиламин является слабым мутагеном, который специфически вызывает дезаминирование цитозина, приводящее к транзиции CG ^ TA. Поскольку у изучаемого неактивного мутантного варианта гистидин в 89-м положении заменен на глицин, мы проверили, будут ли триплеты, кодирующие глицин, в процессе транзиции заменены на триплет, кодирующий другую аминокислоту. Результаты такого анализа показали, что имеется только один триплет, у которого возможна транзиция, однако она не приводит к замене глицина на другую аминокислоту (табл. 1).
Табл. 1
Генетический код глицина
Кодоны Аминокислота
GGT Глицин
GGC ^ GGT
GGA
GGG
Кроме того, гидроксиламин в экспериментах in vivo может не только обладать способностью потенциально восстанавливать активность мутантных нуклеаз
приводя к замедлению роста клеток, но и оказывать токсическое действие на культуру. Поэтому для определения концентрации гидроксиламина, которая не будет оказывать токсического действия на рост культуры рекомбинантного штамма E. coli TGE900 pHisNuc<Srna(H89G), мы использовали только рекомби-нантный штамм E. coli TGE900, несущий ген дикого типа Nuc<Srna(wt). В качестве контроля использовали культуру без добавления гидроксиламина.
Нами были использованы следующие концентрации гидроксиламина: 50, 10, 5, 1, 0.2 и 0.1 мМ. В пробирки, содержащие по 1 мл среды с гидроксилами-ном в указанных концентрациях, засевали клетки рекомбинантного штамма E. coli TGE900 pHisNuCiSma(wt). В контрольную пробирку гидроксиламин не добавляли. Пробирки оставляли инкубироваться на качалке при комнатной температуре на ночь. На следующий день оценивали рост культуры в пробирках по сравнению с контрольным вариантом. Оказалось, что гидроксиламин при концентрации 0.2 мМ и ниже не оказывал влияния на рост клеток. Поэтому для дальнейших экспериментов нами была выбрана концентрация гидроксиламина, равная 0.2 мМ.
2.1. Влияние гидроксиламина на рост рекомбинантных штаммов E. coli TGE900 pHisNucSma(H89G) и E. coli TGE900 pHisNucSma(wt). Учитывая то, что вещество, потенциально способное восстанавливать активность мутантной нуклеазы, при добавлении in vivo может вызывать замедление роста культуры, мы выращивали рекомбинантные штаммы E. coli TGE900 pHisNuc<Sma(H89G) и E. coli TGE900 pHisNuc<Srna(wt) при комнатной температуре в присутствии и в отсутствие гидроксиламина. Динамику роста культуры клеток определяли по изменению оптической плотности культуральной жидкости (см. рис. 2).
Как видно из рисунка, культура клеток E. coli TGE900 pHisNuc<Srna(H89G) существенно замедляла свой рост в присутствии гидроксиламина. В то же время такой зависимости у рекомбинантного штамма E. ^li TGE900 pHisNuc<Srna(wt) обнаружено не было.
Мы установили, что гидроксиламин, так же как и гистидин, имидазол и амины, являющиеся нуклеофилами, может восстанавливать активность мутант-ного фермента. Это можно объяснить тем, что, попав внутрь активного центра инактивированного фермента, гидроксиламин, выполняя функцию общего основания, которую в ферменте дикого типа выполняет остаток His89, может активировать образование гидроксила (OH). Гидроксил, атакуя атом фосфора фос-фоэфирной связи, находящейся в активном центре, вызывает ее разрыв.
2.2. Влияние гидроксиламина на восстановление активности мутант-ного варианта эндонуклеазы NucSma(H89G). Для изучения влияния гидроксиламина на восстановление активности нуклеазы Nuc<Srna(H89G) in vitro мы выделяли и очищали исходный и мутантный ферменты с помощью Ni-NTA-агарозы.
t, ч
Рис. 2. Зависимость оптической плотности D600 от времени культивирования для ре-комбинантных штаммов E. coli'. 1 - E. coli TGE900 NucSma(H89G) без гидроксиламина; 2 - E. coli TGE900 NucSma(H89G) с гидроксиламином; 3 - E. coli TGE900 NucSma(wt) с гидроксиламином; 4 - E. coli TGE900 NucSma(wt) без гидроксиламина
Поскольку ген эндонуклеазы рекомбинантного штамма E. coli TGE900 pHisNucSma(H89G) находится под ^¿-промотором, который репрессируется температурочувствительным белком-репрессором С1 бактериофага X (ген которого находится в хромосоме клетки хозяина), рекомбинантные штаммы сначала выращивали на качалке при температуре 28 °С до оптической плотности 0.5 (600 нм), а затем проводили индукцию синтеза фермента, повысив температуру выращивания до 42 °С, в течение 5 ч. Индукцию анализировали с помощью SDS-электрофореза (рис. 3).
Как видно из рис. 3, после индукции рекомбинантных штаммов клеток E. coli TGE900 pHisNucSma(H89G) и E. coli pHisNucSma(wt) происходит увеличение белка в области ~ 30 кДа, что указывает на увеличение синтеза эндонуклеазы NucSma под действием температуры. У неиндуцированных рекомби-нантных штаммов такого увеличения не наблюдается.
Очистку нуклеазы проводили методом хроматографии на Ni-NTA-колонке. Элюаты очищенных ферментов проверяли на чистоту с помощью SDS-электро-фореза в 15%-ном полиакриламидном геле (рис. 4).
[кДа] M 1 2 3 4
Рис. 3. Электрофореграмма белков рекомбинантных штаммов E. coli TGE900 до и после индукции гена эндонуклеазы S. marcescens: М - молекулярный маркер RageRuler Unstained Protein Ladder фирмы Fermentas; 1 - NucSma(H89G) до индукции гена эндонуклеазы S. marcescens; 2 - NucSma(H89G) после индукции гена эндонуклеазы S. marcescens; 3 -NucSma(wt) до индукции гена эндонуклеазы S. marcescens; 4 - NucSma(wt) после индукции гена эндонуклеазы S. marcescens
Рис. 4. Электрофореграмма фракций белков после элюции с Ni-NTA-агарозой: М - молекулярный маркер RageRuler Unstained Protein Ladder фирмы Fermentas; 1-3 -NucSwa(H89G); 4-6 - NucSwa(wt)
1 2 3 4 5 6
Рис. 5. Электрофореграмма продуктов гидролиза плазмидной ДНК pBSK эндонуклеазой S. marcescens исходного и мутантного вариантов в присутствии и в отсутствие гидрокси-ламина: 1 - маркер фирмы Fermentas; 2 - плазмидная ДНК pBSK(контроль); 3 -NucSma(H89G) без добавления гидроксиламина; 4 - NucSma(H89G) с добавлением гид-роксиламина; 5 - NucSma(wt) без добавления гидроксиламина; 6 - NucSma(wt) с добавлением гидроксиламина
Как видно из рис. 4, элюаты очищенных белков на электрофореграмме представлены в виде единственной полосы с молекулярной массой ~ 29 кДа, что соответствует ожидаемой массе нуклеазы NucSma. После диализа концентрацию ферментов измеряли на приборе Nanodrop (А280). Она составляла для NucSma(H89G) 0.025 мкг/мкл, а для NucSma(wt) - 0.022 мкг/мкл.
Восстановление активности мутантного варианта эндонуклеазы NucSma(H89G) определяли с помощью гидролиза плазмидной ДНК
Гидролиз плазмидной ДНК анализировали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле (см. рис. 5).
Как видно из рис. 5, нуклеазная активность мутантного варианта фермента NucSma(H89G) при добавлении гидроксиламина восстанавливается, что приводит к гидролизу плазмидной ДНК. В то же время в отсутствие гидроксиламина в реакционной среде такого гидролиза не наблюдалось. В отличие от мутантного варианта, исходный тип NucSma(wt) фермента, который являлся контролем, гидролизовал плазмидную ДНК как в присутствии, так и в отсутствие гидрок-силамина.
Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что гидроксиламин снижает рост рекомбинантного штамма E. coli TGE900 pHisNucSma(H89G) по сравнению с контролем без гидроксиламина. Такое уменьшение роста может быть связано с восстановлением активности мутант-ного фермента, приводящим к расщеплению нуклеиновых кислот в клетке. Это предположение было подтверждено экспериментом по гидролизу плазмидной ДНК очищенным ферментом мутантного варианта эндонуклеазы NucSma(H89G).
Литература
1. Лещинская, И.Б., Беляева М.И., Гильфанова К.З. Сравнительное изучение бактериальных фосфомоно- и фосфодиэстераз, гидролизующих нуклеиновые кислоты и нуклеотиды // Микробиология. - 1968. - Т. 37. - С. 979-983.
2. Гимадутдинов, О.А., Анцилевич Л.М. Синтез внеклеточной эндонуклеазы Serratia marcescens рекомбинантными штаммами Escherichia coli // Биотехнология. - 1993. -№ 5. - С. 15-18.
3. Friedhoff P., Gimadutdinow O., Ruter T., Wende W., Urbanke C., Thole H., PingoudA. A procedure for renaturation and purification of the extracellular Serratia marcescens nuclease from genetically engineered Escherichia coli // Protein Expression Purif. -1994. - V. 5, No 1. - P. 37-43.
4. Friedhoff P., Gimadutdinow O., Pingoud A. Identification of catalytically relevant amino acids of the extracellular Serratia marcescens endonuclease by alignment-guided mutagenesis // Nucleic Acids Res. - 1994. - V. 22, No 16. - P. 3280-3287.
5. Friedhoff P., Kolmes B., Gimadutdinow O., Wende W., Krause K.L., Pingoud A. Analysis of the mechanism of the Serratia nuclease using site-directed mutagenesis // Nucleic Acids Res. - 1996. - V. 24, No 14. - P. 2632-2639.
6. Venkataraman P., Lamb R.A., Pinto L.H. Chemical rescue of histidine selectivity filter mutants of the M2 ion channel of influenza A virus // J. Biol. Chem. - 2005. - V. 280, No 22. -P.21463-21472.
7. Peracchi A. How (and why) to revive a dead enzyme: the power of chemical rescue // Curr. Chem. Biol. - 2008. - V. 2, No 1. - P 32-49.
8. Chen W.J., Lai P.J, Lai Y.S., Huang P.T., Lin C.C., Liao T.H. Probing the catalytic mechanism of bovine pancreatic deoxyribonuclease I by chemical rescue // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2007. - V. 352, No 3. - P. 689-696. - doi: 10.1016/j.bbrc.2006.11.078.
9. Midon M., Gimadutdinow O., Meiss G., Friedhoff P., Pingoud A. Chemical rescue of active site mutants of S. pneumoniae surface endonuclease EndA and other nucleases of the HNH family by imidazole // ChemBioChem. - 2012. - V. 13, No 5. - P. 713-721. - doi: 10.1002/cbic.201100775.
10. Meiss G., Gimadutdinow O., Friedhoff P., Pingoud A. Microtiter-plate assay and related assays for nonspecific endonucleases // Methods Mol. Biol. - 2001. - V. 160. - P. 37-48. -doi: 10.1385/1-59259-233-3:037.
Поступила в редакцию 21.12.16
Хамидуллина Раиса Гусмановна, кандидат биологических наук, доцент кафедры генетики
Казанский (Приволжский) федеральный университет ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия
Фазлеева Ильмира Ильдаровна, магистр кафедры генетики
Казанский (Приволжский) федеральный университет ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия
Гимадутдинов Олег Александрович, кандидат биологических наук, доцент кафедры генетики Казанский (Приволжский) федеральный университет ул. Кремлевская, д. 18, г. Казань, 420008, Россия E-mail: Oleg.Gimadutdinov@kpfu.ru
ISSN 2542-064X (Print) ISSN 2500-218X (Online)
UCHENYE ZAPISKI KAZANSKOGO UNIVERSITETA. SERIYA ESTESTVENNYE NAUKI (Proceedings of Kazan University. Natural Sciences Series)
2017, vol. 159, no. 2, pp. 272-282
Reactivation of Serratia marcescens Endonuclease NucSma(H89G) by Hydroxilamine
R.G. Khamidullina, I.I. Fazleyeva, O.A. Gimadutdinow
Kazan Federal University, Kazan, 420008 Russia
*
E-mail: Oleg.Gimadutdinov@kpfu.ru Received December 21, 2016
Abstract
Serratia marcescens endonuclease is the most nonspecific nuclease known. This nuclease refers to enzymes that can cleave both DNA and RNA. The active site of this enzyme is characterized by the H-N-H motif, but more important functions have been shown for the first amino acid of this motif in Serratia marcescens nuclease. It is known that histidine is essential in catalytic activity of many nucleases. Histidine functions as a general base that activates a water molecule for a nucleophilic attack at the diester linkages phosphorus atom and causes its rupture. It has been demonstrated that glycine-histidine substitution in Serratia marcescens endonuclease leads to inactivation of the enzyme. At present, the method of chemical recovery of enzymes has become very widespread. Upon addition of certain low molecular compounds, which are similar in chemical properties to the lost amino acid residues, to the medium with the inactive mutant enzyme, the activity of this enzyme has been restored. The recovery effect has been observed due to the fact that the original amino acids are replaced by a low molecular weight as a result of mutations. In this work we have been able to restore the activity of Serratia marcescens mutant endonuclease by adding hydroxylamine, where histidine at position 89 is replaced by glycine. Keywords: endonuclease, plasmid, hydroxylamine, histidine, imidazole
Figure Captions
Fig. 1. The structure of pHisNucSma plasmid [4].
Fig. 2. The dependence of optical density D600 on time for E. coli recombinant strains: 1 - E. coli TGE900 NucSma(H89G) without hydroxylamine; 2 - E. coli TGE900 NucSma(H89G) with hydroxylamine; 3 - E. coli TGE900 NucSma(wt) with hydroxylamine; 4 - E. coli TGE900 NucSma(wt) without hydroxylamine. Fig. 3. The electropherogram of proteins of E. coli TGE900 recombinant strains before and after the induction of S. marcescens endonuclease gene: М -RageRuler Unstained Protein Ladder molecular marker produced by Fermentas; 1 - NucSma(H89G) before the induction of S. marcescens endo-nuclease gene; 2 - NucSma(H89G) after the induction of S. marcescens endonuclease gene; 3 -NucSma(wt) before the induction of S. marcescens endonuclease gene; 4 - NucSma(wt) after the induction of S. marcescens endonuclease gene. Fig. 4. The electropherogram of protein fractions after the elution with Ni-NTA agarose: М - RageRuler Unstained Protein Ladder molecular marker produced by Fermentas; 1 -3 - NucSma(H89G); 4-6 -NucSma(wt).
Fig. 5. The electropherogram of products of the hydrolysis of pBSK plasmid DNA by S. marcescens endonuclease of the initial and mutant variants in the presence of hydroxylamine: 1 - marker produced by Fermentas; 2 - pBSK plasmid DNA (control); 3 - NucSma(H89G) without hydroxylamine; 4 - NucSma(H89G) with hydroxylamine; 5 - NucSma(wt) without hydroxylamine; 6 - NucSma(wt) with hydroxylamine.
References
1. Leshchinskaya I.B., Belyaeva M.I., Gil'fanova K.Z. Comparative study of bacterial phosphomono-and phosphodiesterases hydrolyzing nucleic acids and nucleotides. Mikrobiologiya, 1968, vol. 37, pp. 979-983. (In Russian)
2. Gimadutdinow O.A., Antsilevich L.M. The synthesis of Serratia marcescens extracellular endonucle-ase by Escherichia coli recombinant strains. Biotekhnologiya, 1993, no. 5, pp. 15-18. (In Russian)
3. Friedhoff P., Gimadutdinow O., Ruter T., Wende W., Urbanke C., Thole H., Pingoud A. A procedure for renaturation and purification of the extracellular Serratia marcescens nuclease from genetically engineered Escherichia coli. Protein Expression Purif., 1994, vol. 5, no. 1, pp. 37-43.
4. Friedhoff P., Gimadutdinow O., Pingoud A. Identification of catalytically relevant amino acids of the extracellular Serratia marcescens endonuclease by alignment-guided mutagenesis. Nucleic Acids Res., 1994, vol. 22, no. 16, pp. 3280-3287. (In Russian)
5. Friedhoff P., Kolmes B., Gimadutdinow O., Wende W., Krause K.L., Pingoud A. Analysis of the mechanism of the Serratia nuclease using site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res., 1996, vol. 24, no. 14, pp. 2632-2639.
6. Venkataraman P., Lamb R.A., Pinto L.H. Chemical rescue of histidine selectivity filter mutants of the M2 ion channel of influenza A virus. J. Biol. Chem., 2005, vol. 280, no. 22, pp. 21463-21472.
7. Peracchi A. How (and why) to revive a dead enzyme: The power of chemical rescue. Curr. Chem. Biol., 2008, vol. 2, no. 1, pp. 32-49.
8. Chen W.J., Lai P.J, Lai Y.S., Huang P.T., Lin C.C., Liao T.H. Probing the catalytic mechanism of bovine pancreatic deoxyribonuclease I by chemical rescue. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2007, vol. 352, no. 3, pp. 689-696. doi: 10.1016/j.bbrc.2006.11.078.
9. Midon M., Gimadutdinow O., Meiss G., Friedhoff P., Pingoud A. Chemical rescue of active site mutants of S. pneumoniae surface endonuclease EndA and other nucleases of the HNH family by imidazole. ChemBioChem, 2012, vol. 13, no. 5, pp. 713-721. doi: 10.1002/cbic.201100775.
10. Meiss G., Gimadutdinow O., Friedhoff P., Pingoud A. Microtiter-plate assay and related assays for nonspecific endonucleases. Methods Mol. Biol., 2001, vol. 160, pp. 37-48. doi: 10.1385/1-59259233-3:037.
<Для цитирования: Хамидуллина Р.Г., Фазлеева И.И., Гимадутдинов О.А. Восстановление активности эндонуклеазы Serratia marcescens NucSma(H89G) гидроксиламином // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. - 2017. - Т. 159, кн. 2. - С. 272-282.
<For citation: Khamidullina R.G., Fazleyeva I.I., Gimadutdinow O.A. Reactivation of Serratia marcescens endonuclease NucSma(H89G) by hydroxilamine. Uchenye Zapiski Kazanskogo Universiteta. Seriya Estestvennye Nauki, 2017, vol. 159, no. 2, pp. 272-282. (In Russian)
