CC BY
51
DOI: 10.24412/2074-5036-2021-2-3-8 УДК 619: 619.98:578.821.2:636:22/28
Ключевые слова: Нодулярный дерматит, Казахстан, ПЦР, вектор, эпидемиология
Key words: Lumpy skin disease, Kazakhstan, PCR, vector, epidemiology
Юрынбаев М.Б., 1,2Копеев С.К., хТулендибаев А.Б., хРыстаева Р.А., хСултанкулова К.Т.
ВОСПРИИМЧИВОСТЬ САЙГАКОВ К НОДУЛЯРНОМУ ДЕРМАТИТУ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЗАРАЖЕНИИ
SUSCEPTIBILITY OF SAIGAS TO LUMPY SKIN DISEASE IN EXPERIMENTAL INFECTION
'Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН РК Адрес: 080409, Казахстан, Жамбылская область, пгт. Гвардейский
Research Institute of Biological Safety Problems of the science committee of the Ministry of Education and Science
of the Republic of Kazakhstan Addres:080409, Kazakhstan, Zhambyl region, uts Gvardeysky 2Кыргызский национальный аграрный университет им. К.И.Скрябина Адрес: 720005, Кыргызстан, г. Бишкек Kyrgyz National Agrarian University named after K.L. Scriabin Addres:720005, Kyrgyzstan, Bishkek city
Орынбаев Мухит Бармакулы, кандидат ветеринарных наук, профессор, член-корреспондент Национальной Академии Наук Республики Казахстан.
Е-mail:omb65@mail.ru
Orynbaev Mukhit Barmakuly, PhD of Veterinary Science, Professor, Corresponding Member National Academy of Sciences of the Republic of Kazakhstan. Е-mail:omb65@mail.ru Копеев Сырым Калдыбаевич, магистр ветеринарных наук. Е-mail:kopeyev85@mai.m Kopeyev Syrym Kaldybayevich, Master of Veterinary Science. Е-mail:kopeyev85@mai.ru Тулендибаев Али Бахытжанович, магистр ветеринарных наук. Е-mail:tulendibaev93@mail.ru Tulendibaev Ali Bakhytzhanovich, Master of Veterinary Science. Е-mail:tulendibaev93@mail.ru Рыстаева Рашида Аусекановна, магистр естествознания. Е-mail: oj-rashida@mail.ru Rystaeva Rashida Ausekanovna, Master of Natural Science. Е-mail:oj-rashida@mail.ru Султанкулова Куляйсан Турлыбаевна, кандидат биологических наук, профессор.
Е-mail: sultankul70@mail.ru Sultankulova Kulyaisan Turlybayevna, PhD of Biological Science, Professor. Е-mail: sultankul70@mail.ru
Аннотация. Нодулярный дерматит как эмерджентная трансграничная болезнь крупного рогатого скота распространена во многих странах Африки, в настоящее время получил широкое распространение в ближнем востоке, Европе и Южной Азии. В июле 2016 г. в первые зарегистрирован среди поголовья крупного рогатого скота в Атырауской области Республики Казахстан. Экспериментальное заражение сайгака вирусом нодулярного дерматита показало, что сайгаки восприимчивы к данному заболеванию. Сайгак пал на 23 сутки после заражения. Гибель сайгака подтверждена выделением вируса, электронной микроскопией и ПЦР. На территории Казахстана обитает основная популяция сайгака. Распространение вируса в популяции сайгака может существенно повлиять на популяцию вида. Необходимо проведение исследований по изучению восприимчивости сайгака к вирусу нодулярного дерматита КРС и роли этого вида в эпидемиологии данного заболевания.
Summary. Lumpy skin disease as an emergent cross-border bovine disease is common in many African countries, and is now widespread in the Middle East, Europe, and South Asia. In July 2016, it was registered for the first time among the cattle population in the Atyrau region of the Republic of Kazakhstan. Experimental infection of saigas with lumpy skin disease virus showed that saigas are susceptible to this disease. The saiga fell on the 23rd day after infection. The death of the saiga antelope was confirmed by the isolation of the virus, election microscopy and PCR. The main population of saiga antelope lives on the territory of Kazakhstan. The spread of the virus into the saiga population can significantly affect the population of the species. It is necessary to conduct research on the susceptibility of saiga antelope to the virus of nodular dermatitis of cattle and the role of this species in the epidemiology of this disease.
Введение
Нодулярный дерматит (НД) (Lumpy skin disease) - контагиозная вирусная болезнь крупного рогатого скота (КРС), характеризующаяся интоксикацией организма, лихорадкой, папулезно-пустулезными поражениями кожи и слизистых оболочек [4]. Она наносит огромный экономический ущерб скотоводству, слагающийся из гибели и вынужденного убоя больных животных, снижения продуктивности, затрат на проведение ветеринарно-санитарных и охранно-каран-тинных мероприятий.
К заболеванию восприимчивы КРС и буйволы. Имеются отдельные сообщения о чувствительности некоторых диких жвачных животных к вирусу НД. В естественных условиях клинические признаки заболевания наблюдали у арабского орикса (Oryx leucoryx) [2] и у спрингбока (Antidorcas marsupialis) [6]. Восприимчивость диких животных также была продемонстрирована обнаружением нейтрализующих антител у африканского буйвола (Syncerus caffer), синего гну (Connochaetes taurinus), черного антилопа гну (Connochaetes gnou), канны (Taurotragus oryx), водяного козла (Kobusel lipsiprymnus), куду, жирафа и импалы в Чаде, Зимбабве, Замбии, Кении, Ботсване и Южной Африке [1, 3]. После экспериментальной инокуляции импалы (Aepyceros melampus), газели Томсона (Gazella thomsonii) и жирафа (Giraffa camelopardalis) на коже развились LSD-поражения [12].
Возбудитель НД является ДНК-содержа-щий вирус рода Capripox virus семейства Poxviridae [9].
НД относится к особо опасным болезням, которые имеют способность к быстрому распространению. Впервые оно было зарегистрировано в Центральной Африке в 1929 году как ложная крапивница. В 1940-х годах оно было идентифицировано как инфекционное заболевание, вызванное вирусом но-дулярного дерматита. Долгое время распространение НД ограничивалось африканским континентом, с 1989 г. является достаточно распространенной болезнью на территории стран Ближнего Востока [11]. В 2014 и 2016 годах болезнь распространилась на Юго-Восточную Европу, Балканы и Россию [8, 13].
В странах СНГ заболевание впервые зарегистрировано в Азербайджане в 2014 г., откуда через Северный Кавказ распространилось на европейскую часть России [8, 13]. В июне 2016 г. заболевание было зарегистрировано в Атырауской области Казахстана [7]. Появление заболевания в Казахстане может иметь серьёзные последствия. Фауна Казахстана богата различными видами парнокопытных животных, которые могут быть восприимчивы к данному заболеванию, а большое количество различных видов эндемичных насекомых и клещей могут способствовать укоренению данного заболевания и дальнейшему распространению в другие регионы. Наши исследования были направлены на оценку чувствительности сайгака (Saiga tatarica tatarica), вида, находящегося под угрозой исчезновения (МСОП 2019), к ноду-лярному дерматиту.
Материалы и методы
Дизайн заражения сайгаков. Экспериментальное исследование заражения сайгака проводилось в конце 2018 - начале 2019 года. Для заражения был использован сайгак 4-летнего возраста, который содержался в вольере Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности (НИИПЬБ). Новорожденный сайгак был привезен в НИИПЬБ в 2014 г. из Костанай-ской области.
Единственное животное в этом исследовании содержалось в изоляторах для животных, оборудованных фильтрами HEPA, чтобы предотвратить утечку патогена в окружающую среду. Питьевая вода и сено подавались вволю, а гранулированный корм - два раза в день.
Кровь у животного собирали за 20 дней до инфицирования с использованием ваку-тейнеров BD Vacutainer Plus Serum Blood Collection Tube - 6 мл (BD, Plymouth.PL6 7BP, UK). Стерильную сыворотку тестировали в реакции нейтрализации на наличие антител к каприпокс вирусам. Животное было серонегативным к каприпокс вирусам.
Для заражения сайгака использовали штамм вируса НД Nodulares / Dermatitis / Aty-rau-2016, выделенный в культуре LT-клеток
с биологической активностью 5,5 ^ТЦД50/см3. Перед заражением у животного измеряли температуру тела, исследовали на наличие каких-либо физиологических отклонений. Вирус вводили подкожно в среднюю треть шеи в дозе 100 000 ТТЦД50.
За животным проводили клиническое наблюдение с ежедневным измерением температуры тела. Ежедневно проводился осмотр полости рта и носа, безволосых участков кожи, пальпация участков кожи на предмет изменений. Начиная с 1 дня после заражения у животного брали кровь и мазки из носа. Кровь собирали из яремной вены с использованием вакутейнеров (BD Vacutainer® EDTA K2E). Мазки из носа, собранные с помощью стерильных ватных тампонов, помещали в стерильные криопробирки с фосфатно-со-левым буферным раствором. Собранные образцы крови и мазки замораживали при температуре минус 70 °C и хранили до исследования.
После гибели животного отбирали с помощью вакутейнера кровь из сердца. Стерильные образцы были собраны из легких, селезенки, лимфатических узлов, печени и почек.
Образцы крови, мазки и супернатанты органов исследовали с помощью ПЦР на наличие ДНК вируса НД. Образцы органов исследовали с помощью электронной микроскопии. Положительными в ПЦР образцами инфицировали культуру клеток тестикул ягнят (ТЯ). Специфичность цитопатического эффекта в культуре клеток подтверждена методом ПЦР.
Чтобы исключить сопутствующие вирусы и бактерии биологические образцы павшего сайгака были исследованы на наличие ДНК / РНК различных вирусов и бактерий.
Обнаружение вирусов чумы мелких жвачных животных, ящура, блютанга проводилось с использованием специфических наборов RT-PCR Target Specific Reagents (RT-PCR Kit, Tetracore, Rockville USA). Амплификацию и анализ ее продуктов проводили в Light Cycler 2.0 (Roche).
Обнаружение пастерелл и микоплазм проводилось методом ПЦР.
Выделение вируса в культуре клеток. Для этого использовали первичную культуру
клеток теститкул ягнят (ТЯ) и перевиваемую культуру клеток почки быка (MDBK) [7].
Выделение каприпокс вируса из суспензии образца проводили, как описано в протоколах Всемирной организации животных.
Выделение ДНК. Выделение ДНК проводят с помощью набора "DNeasy® Blood&Tissue Kit (250)" фирмы QIAGEN согласно протоколу изготовителя.
Постановка ПЦР. Наработку ПЦР-про-дуктов проводили с использованием набора Ampli Taq Gold (Applied Biosystems). Для выявления и идентификации вируса НД, при постановке ПЦР использованы праймеры на видоспецифический ген GPCR, кодирующий рецептора хемокинов G-белок. Размер полученных амплификонов соответствовал ожидаемому размеру ПЦР продукта (~200 п.н.). Реакционная смесь содержала 25 мкл 2х буферов Ampli Taq Gold, по 1 мкл 20 пкм праймеров, 1 мкл ДНК и воды до 50 мкл. Последовательности прямого и обратного прай-мера: 5'-TTTCCTGATTTTTCTTACTAT-3' и 5'-AAATTATATACGTAAATAAC-3', соответственно. Режимы амплификации: начальная денатурация прошла при 95 °С в течение 5 минут, денатурация при 94 °С - 45 сек, отжиг при 56-60 °С в течение 45 сек, репликация при 72 °С в течение 2 мин, 35 циклов, пострепликация при 72 °С в течение 10 минут [7, 9].
Электрофорез ДНК в 2 % агарозном геле проводили, используя ТВЕ буфер, содержащий 1 мкл/мл бромистого этидия. Использовали аппарат для электрофореза нуклеиновых кислот G-100, Pharmacia.
Электронная микроскопия. Для изучения морфологии вируса нодулярного дерматита использовали образцы, выделенные от патологических материалов (кожа, бугорчат-ка) КРС и насекомых. Вирусный препарат нодулярного дерматита исследовали под электронным микроскопом (JEM-100 CX), используя негативное контрастирование 4 % раствором фосфатно-фольфрамовой кислоты рН 6,8.
Результаты исследований и обсуждение
Сайгак, не содержащий в крови антител к каприпокс вирусам, был инфицирован
Рис. 1. Серозные истечения у сайгака, зараженного вирусом НД.
вирусом НД, и за животным вели клиническое наблюдение в течение 23 дней. На 4-й день после инфицирования в месте введения вируса регистрировали припухлость диаметром приблизительно 1 см. На 10-е сутки припухлость в диаметре достигла 1,4 см, а на 17-е сутки после инфицирования припухлость исчезла (рассосалась). Температура тела в период наблюдения колебалась в пределах 39,5-40,3 °С. Нормальные колебания температуры тела сайгака неизвестны. На 21-е сутки у животного отсутствовал аппетит, и регистрировались серозные выделения из носа и депрессия (рис. 1). Поражения кожи не были выявлены. Животное внезапно умерло на 23-й день после заражения (рис. 2).
У павшего животного были собраны образцы внутренних органов и кровь из сердца. Все смывы от зараженных сайгаков, кровь и органы от павших животных были исследованы в ПЦР на наличие вируса НД (табл. 1). Вирус в крови обнаруживали, начиная с 10-го дня, а в мазках из носоглотки с 11-го дня после заражения и вплоть до гибели животного. Вирус НД был также обнаружен во всех органах (се-
лезенка, лимфатические узлы, печень, почки и легкие) и в крови сердца мертвого сайгака. Положительные образцы использовали для инфицирования первичных трипсинизированных культур клеток ТЯ. Вирус НД был выделен из всех испытанных образцов.
Образцы (легкие, селезенка, лимфатические узлы) от мертвого сайгака были протестированы с помощью ПЦР на наличие Pasteurella multocida, Ыап^ет1а haemolytica (причины пастереллеза), микоплазмы овипневмонии, чумы мелких жвачных животных, ящура и вируса блютанга. Во всех пробах были получены отрицательные результаты.
Специфичность выделенных вирусов была подтверждена в ПЦР и электронной микроскопией. Во всех образцах был получен продукт амплификации размером 192 п.н. характерный для вируса НД. В результате исследования морфологии и тонкой структуры негативно-окрашенных препаратов были обнаружены вирусные частицы характерные для вируса НД. Размеры вирионов варьировали в пределах 300x370 нм, тогда как основная масса частиц (90%) имела размеры 300x350 нм (рис. 3).
НД - одно из социально значимых особо опасных вирусных заболеваний животных, к которому в последние годы приковано внимание ветеринарных врачей всего мира. За короткий период времени заболевание распространилось из стран Африки через ближний восток в Европу, Азербайджан, Россию и нанесло существенный урон экономике данных стран [7, 8, 13]. Анализ данных литературы
Рис. 2. Сайгак, павший на 23-и сутки после экспериментального заражения вирусом НД.
Таблица 1
Результаты исследования образцов сайгака
Образцы НД ПЦР
ПЦР Выделение вируса (^ ТЦД50/мл) Ящур ЧМЖЖ Ы. ovip-neumonia Блютанг М haemo-[у^са P multocida
Назальные смывы Полож. 10-22 дпи + Отр Отр Отр Отр Отр Отр
Кровь Полож. 10-22 дпи + Отр Отр Отр Отр Отр Отр
Лимфатические узлы Полож. + (1,43±0,11) Отр Отр Отр Отр Отр Отр
Селезенка Полож. + (1,31±0,06) Отр Отр Отр Отр Отр Отр
Легкие Полож. + (1,43±0,06) Отр Отр Отр Отр Отр Отр
Печень Полож. + (0,93±0,11) Отр Отр Отр Отр Отр Отр
Почки Полож. + (0,68±0,11) Отр Отр Отр Отр Отр Отр
Кровь из сердца после гибели Полож. + Отр Отр Отр Отр Отр Отр
Примечания: Д.п.и - день после инфекции; "+" - выделение вируса; Пол - положительно; Отр - Отрицательно.
показывает, что заболевание имеет тенденцию к быстрому распространению. Заболевание за короткий период распространилось на Кавказе, южных регионах России и занесено на территорию Казахстана. Первые случаи заболевание животных НД в Казахстане были зарегистрированы в конце июня -начале июля 2016 г. в Курмангазинском районе Атырауской области [7]. Учитывая значительную плотность поголовья скота на территории Казахстана, а также векторов возможно дальнейшее распространение этой инфекции, что может привести к се-
рьезным социально-экономическим последствиям.
Для искоренения этой инфекции необходимо изучение всех звеньев эпизоотического процесса. Работ по исследованию патогенности вируса нодулярного дерматита для диких жвачных животных в настоящее время крайне недостаточно для оценки роли таких животных в передаче вируса. Имеются данные, что при экспериментальном заражении к вирусу восприимчивы жирафы и антилопы импала [12], и это исследование предполагает, что сайгаки также
Рис.3. Электронная микроскопия препаратов изолята нодулярного дерматита. Ув. х125 000 (А) и х60 000 (В).
могут быть хозяевами. Мы впервые оценили патогенность вируса нодулярного дерматита, выделенного от КРС на территории Атырауской области в 2016 году, для сайгаков. Сайгак один из многочисленных видов диких парнокопытных Казахстана. Большая часть мировой популяции сайгака обитает в Республике Казахстан. Сайгак мигрирует на большие расстояния дважды в год и в ходе своих миграций может быть источником заражения и распространения различных заболеваний, в том числе и НД. Можно ожидать, что по мере увеличения популяции сайгака общая площадь среды обитания, занимаемой сайгаком, будет увеличиваться. Вполне вероятно, что будут контакты между сайгаком и домашним скотом, а это в свою очередь будет способствовать передаче болезней как от сайгака домашнему скоту, так и наоборот.
Это исследование было направлено, чтобы расширить понимание роли сайгаков в поддержании вируса НД путем определения его чувствительности к данному заболеванию. Наши исследования показали, что сайгак, экспериментально зараженный вирусом НД, заболел без проявления клинических признаков заболевания (кожные высыпания отсутствуют) и пал на 23 сутки. Специфичность заболевания сайгака было подтверждено в ПЦР и выделением вируса в культуре клеток ТЯ. Отсутствие клинических признаков заболевания у сайгака возможно связано с биологией данного вируса. Так при экспериментальном заражении не всегда удается воспроизвести заболевания с типичными клиническими признаками даже у крупного рогатого скота [5, 10], но у сайгака отмечена виремия. В исследованиях, проведенных Kitching и др., [5] показали, что из 40 экспериментально зараженных животных у 25 наблюдалась местная реакция, и только у 9 наблюдалась генерализованная форма болезни и вире-мия в течение 9 дней. Тирригатеп и другие [10] также отметили, что тяжесть клинических признаков не коррелирует с продолжительностью виремии у экспериментально инфицированного крупного рогатого скота. Наблюдались длительные периоды
отсутствия клинических признаков. Наши данные по сайгаку согласуются с данными этих исследований.
Выводы
Таким образом, показано, что сайгак восприимчив к экспериментальному заражению вирусом НД, но потребуется проведение дополнительных исследований, чтобы подтвердить, являются ли сайгаки потенциальными хозяевами и могут ли они иметь значение для поддержания и распространения НД в Казахстане. Для окончательного утверждения данной гипотезы необходимо проведение исследований по изучению восприимчивости сайгака к вирусу НД на большем количестве животных. Кроме того, необходимо проводить мониторинг популяций сайгаков в дикой природе с целью установления роли данного вида животных в поддержании и распространении НД.
Список литературы
1. Barnard B. J. Antibodies against some viruses of domestic animals in southern African wild animals / B. J. Barnard // Onderstepoort Journal of Veterinary Research.1997. Vol. 64. Р. 95-110.
2. Greth A. Capripox virus disease in an Arabian Oryx (Oryx leucoryx) from Saudi Arabia / A. Greth, J. M. Gourreau, M. Vassart, Ba-Vy Nguyen, M. Wyyers, P. C. Lefevre // Journal of Wild life Diseases. 1992. Vol. 28. Р. 295-300. http://dx.doi.org/10.7589/0090-3558-28.2.295.
3. Hedger R.S. Neutralising antibodies to lumpy skin disease virus in African wildlife / R. C. Hedger, C. Hamblin // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 1983. Vol. 6. Р. 209-213. http://dx.doi.10.1016/0147-9571(83)90012-7.
4. Kitching R. P. Transmission of capripox viruses / R. P. Kitching, W.P. Taylor // ResVetSci. 1985. № 39. Р. 196-199.
5. Kitching R. P. The clinical response of cattle experimentally infected with lumpy skin disease (Neethling) virus / R. P. Kitching, V. M. Carn // Archive of Virology. 1995. Vol. 140. Р. 503-513.
6. Last R. D. Lumpy Skin Disease of Springbok / R. D. Last // CPD Articles. 2017. Vol. 11. №4. 12 р.
7. Orynbayev M. B. Lumpy skin disease in Kazakhstan / M. B. Orynbayev, R. K. Nissanova, S. K. Kopey-ev, A. Issimov, K. D. Zakarya, K. T. Sultankulova, L. B. Kutumbetov, A. B. Tulendibayev, B. Myr-zakhmetova, E. D. Burashev, O. V. Chervaykova, S. S. Nurabayev, A. K. Nakhanov, R.A. Kock // Tropical Animal Health and Production. 2021. Vol. 53. 166 р. https://doi.org/10.1007/s11250-021-02613-6.
8. Salnikov N. Identification and characterization of lumpy skin disease virus isolated from cattle in the Republic of North Ossetia Alania in 2015 / N. Salnikov, T. Usadov, A. Kolcov, S. Zhivoderov, Y. Morgunov, V Gerasimov, A. Gogin, I. Titov, S. Yurkov, A. Malogolov-kin, D. Kolbasov, A. Lunitsyn // Transbound Emerg Dis. 2018. P. 1-5. https://doi.org/10.1111/tbed.12818.
9. Tulman E. R. Genome of lumpy skin disease virus / E. R. Tulman, C. L. Afonso, Z. Lu // J Virol. 2001. P. 2-4.
10. Tuppurainen E. S. M. The detection of lumpy skin disease virus in samples of experimentally infected cattle using different diagnostic techniques / E. S. M. Tuppurainen, E. H. Venter, J. A. W. Coetzer // Onderstepoort J. Vet. Res. 2005. Vol. 72. P. 153-164.
11. Wainwright S. Emergence of lumpy skin disease in the Eastern Mediterranean Basin countries / S. Wainwright, A. Elldrissi, R. Mattioli, M. Tibbo, F. Njeumi, E. Raizman // FAO Empres Watch. 2013. № 29. P. 1-6.
12. Young E. Experimental infection of game animals with lumpy skin disease virus / E. Young, P. A. Basson, K. E. Weiss // Onderstepoort J VetRes. 1970. Vol. 37. № 2. P. 79-87.
13. Zeynalova S. Epizootology and molecular diagnosis of lumpy skin disease among livestock in Azerbaijan / S. Zeynalova, K. Asadov, F. Guli-yev, M. Vatani, V. Aliyev // Frontiers in Microbiology. 2016. №7. 1022 p. https://doi.org/10.3389/fmicb. 2016.01022
