CC BY
3
Original report
DOI: https://orcid.org/10.17650/2222-1468-2023-13-3-51-62
C«D
Внутриопухолевая молекулярная гетерогенность астроцитом и олигодендроглиом grade 3 и ее значение в прогнозе заболевания
П.В. Никитин1, А.Ю. Беляев2, Г.Р. Мусина3, Г.Л. Кобяков2, И.Н. Пронин2, Д.Ю. Усачев2
Хьюстонский университет; 4849 Калхун-роуд, Хьюстон 77004, Техас, США;
2ФГАУ«Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко» Минздрава России; Россия, 125047Москва, 4-я Тверская-Ямская, 16;
3Медицинский колледж Бэйлора; 1 Бэйлор Плаза, Хьюстон 77030, Техас, США Контакты: Артем Юрьевич Беляев [email protected]
Введение. Злокачественные опухоли головного мозга, такие как астроцитомы и олигодендроглиомы grade 3 (ана-пластические астроцитомы и анапластические олигодендроглиомы), характеризуются высокой агрессивностью и представляют собой серьезную клиническую проблему. Данная работа посвящена оценке внутриопухолевой гетерогенности этих новообразований и ее влияния на прогноз заболевания.
Цель исследования - изучение свойств внутриопухолевой гетерогенности, в частности морфологических критериев, таких как некрозы, сосудистая пролиферация, митозы, и мутаций в наиболее значимых для прогрессирования глиом генах в группах астроцитом и олигодендроглиом grade 3, а также анализ прогностической значимости этих показателей.
Материалы и методы. В исследование включены 389 пациентов с JDW-мутантными анапластическими астроцито-мами и 200 пациентов с анапластическими олигодендроглиомами. Средний индекс мечения Ki-67 для астроцитом составил 12,78 %, для олигодендроглиом - 8,54 %.
Результаты. Наличие сосудистой пролиферации, некроза, более 20 % площади препарата, занятой саркомоподоб-ными участками, а также количество митозов существенно влияли на показатели не только безрецидивной, но и общей выживаемости пациентов. В клинических условиях мутации в промоторе гена TERT, амплификация и мутация гена EGFR, делеция генов CDKN2A и TP53 оказывали значительное негативное влияние на эти показатели. Заключение. По результатам single-cell секвенирования РНК выявлены дополнительные факторы прогрессирования рассматриваемых опухолей и повышения их злокачественного потенциала, в том числе наличие саркомоподобных участков, а также мутаций в генах TERT, EGFR, CDKN2A и TP53.
Ключевые слова: астроцитома grade 3, олигодендроглиома grade 3, внутриопухолевая гетерогенность, общая выживаемость, безрецидивная выживаемость
Для цитирования: Никитин П.В., Беляев А.Ю., Мусина Г.Р. и др. Внутриопухолевая молекулярная гетерогенность астроцитом и олигодендроглиом grade 3 и ее значение в прогнозе заболевания. Опухоли головы и шеи 2023;13(3):51-62. DOI: https://orcid.org/10.17650/2222-1468-2023-13-3-51-62
Intra-tumoral molecular heterogeneity of grade 3 astrocytomas and oligodendrogliomas and its significance in disease prognosis
P. V. Nikitin1, A. Yu. Belyaev2, G.R. Musina3, G.L. Kobyakov2, I.N. Pronin2, D. Yu. Usachev2
University of Houston; 4849 Calhoun Road, Houston 77004, Texas, USA;
2N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery, of the Ministry of Health of Russia; 16, 4th Tverskaya-Yamskaya, Moscow 125047, Russia;
3Baylor Medical College, 3; 1 Baylor Plaza, Houston 77030, Texas, USA Contacts: Artem Yuryevich Belyaev [email protected]
Introduction. Malignant brain tumors, such as anaplastic astrocytomas and anaplastic oligodendrogliomas grade 3, are characterized by high aggressiveness and pose a serious clinical problem. This study focuses on assessing intratumoral heterogeneity in anaplastic astrocytomas and anaplastic oligodendrogliomas and its impact on disease prognosis.
Aim. To study characteristics of intratumoral heterogeneity, in particular such morphological criteria as necrosis, vascular proliferation, mitoses, and mutations in the most significant for glioma progression genes in the groups of grade III astrocytomas and oligodendrogliomas, as well as analysis of prognostic significance of these parameters.
Materials and methods. The study included 389 patients with IDH-mutant astrocytomas and 200 patients with oligodendrogliomas. The mean Ki-67 labeling index of astrocytomas was 12.78 %, while that of oligodendrogliomas was 8.54 %. Results. The presence of vascular proliferation, necrosis, of more than 20 % of the area of the specimen occupied by sarcoma-tous-like areas and the number of mitoses significantly affected not only disease-free survival but also overall survival of patients. In the clinical setting, mutations in the TERTpromoter gene, amplification and mutation of the EGFR gene, deletion of the CDKN2A gene, and TP53 gene had a significant negative impact on recurrence-free and overall survival. Conclusion. The results of single-cell RNA sequencing showed additional factors, including sarcomatous-like areas, as well as TERT, EGFR, CDKN2A and TP53 mutations, in the progression of the tumors under consideration and in ensuring an increase in their malignant potential.
Keywords: astrocytoma grade 3, oligodendroglioma grade 3, intra-tumoral heterogeneity, overall survival, progressionfree survival
For citation: Nikitin P.V., Belyaev A.Yu., Musina G. R. et al. Intra-tumoral molecular heterogeneity of grade 3 astrocytomas and oligodendrogliomas and its significance in disease prognosis. Opukholi golovy i shei = Head and Neck Tumors 2023;13(3):51-62. (In Russ.). DOI: https://orcid.org/10.17650/2222-1468-2023-13-3-51-62
Введение
Современное представление о диффузных глиомах в диагностическом аспекте постепенно, с каждой последующей классификацией Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), приводится в соответствие с фундаментальными свойствами новообразований в молекулярно-генетической плоскости, в которой определяющими являются механизмы развития заболевания. Рассматривать данные механизмы можно с различных сторон; ключевым в последнее время становится патогенетический подход, поскольку он позволяет изучать опухоли не просто как отдельные, отграниченные нозологические единицы с некими наборами молекулярных признаков, но и как результат закономерной эволюции новообразования, прошедшего определенные этапы прогрессирования, приобретения новых молекулярных характеристик и соответствующих им функциональных свойств. Подобная трассировка патогенетического пути опухоли от ранних предшественников до полноценных опухолевых клеточных клонов, присутствующих в симптомном новообразовании, позволяет более точно и с большей ком-плаентностью транслировать достижения в диагностике и лечении опухолей в клиническую практику [1].
Цель исследования — изучение свойств внутриопухо-левой гетерогенности, в частности морфологических критериев, таких как некрозы, сосудистая пролиферация, митозы, и мутаций в наиболее значимых для прогресси-рования глиом генах в группах астроцитом и олигоден-дроглиом grade 3 — морфологической, молекулярно-ге-нетической, в том числе в аспекте прогностической значимости этих показателей.
Материалы и методы
В исследование вошли 389 пациентов с анапласти-ческими астроцитомами (АА) и 200 пациентов с ана-
пластическими олигодендроглиомами (АО), прооперированные в Национальном медицинском исследовательском центре нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко в 2017—2020 гг. Средний возраст больных АА (179 (46 %) женщин и 210 (54 %) мужчин) составил 40,85 года (от 18 до 75 лет), больных АО (115 (57,5 %) женщин и 85 (42,5 %) мужчин) — 44,4 года (от 19 до 75 лет).
Гистологическое исследование. Подготовка гистологических препаратов проводилась по стандартной схеме [2]. Каждый полученный препарат проходил оценку тремя опытными патологами, компетентными в сфере нейропатологии. Патогистологический диагноз устанавливался в строгом соответствии с диагностическими критериями классификации ВОЗ опухолей центральной нервной системы 2016 г. 4-го пересмотра.
Иммуногистохимическое исследование. Материал парафиновых блоков с фиксированными в нем фрагментами новообразования использовали для изготовления срезов толщиной 3 мкм, далее проводилось имму-ногистохимическое исследование с моноклональными антителами против антигена Ki-67 человека (CONFIRM anti-Ki67, Roche-Vfentana, США) по ранее описанной методике [3]. Для подсчета индекса мечения (ИМ) Ki-67 применяли стандартную методику — выявление процента клеток с положительной экспрессией рассматриваемого маркера.
Иммунофлуоресцентный анализ. Материал парафиновых блоков с фиксированными в нем фрагментами новообразования использовали для изготовления срезов толщиной 3 мкм. Сначала проводили депарафи-нирование и регидратирование срезов с помощью их последовательного погружения в ксилол, 100, 95, 70 и 50 % этанол, деионизированную воду. После этого срезы высушивали в термостате при 45 °C. Далее проводили их инкубирование с первичными моноклональ-ными антителами к NMDA-рецепторам глутамата
(Sigma-Aldrich, США) с метками зеленого цвета, разведенными в 1 % растворе PBS, при комнатной температуре в течение 1—2 ч. Затем образцы инкубировали в течение ночи при 4 °С во влажной камере. После этого срезы дважды промывали 1 % раствором PBS-T в течение 10 мин. Далее добавляли флуоресцентную метку конъюгированного вторичного антитела, разведенного в 1 % растворе PBS, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1—2 ч. Затем срезы дважды промывали 1 % раствором PBS-T в течение 10 мин и наносили краситель DAPI. После инкубации с красителем слайды промывали 1 раз в течение 5 мин PBS. Далее препараты подвергались конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с использованием конфокальной микроскопической системы Aperio VERSA (Leica, Германия).
Полимеразная цепная реакция. Сначала проводилось выделение тотальной РНК из всех фрагментов новообразования с помощью набора RNeasy FFPE Kit (Qiagen, Германия) согласно рекомендациям производителя. Далее выполнялась полимеразная цепная реакция (ПЦР) по описанной ранее методике [3]. Ген ß-актина использовали в качестве внутреннего стандарта, и данные выражали как отношение матричной РНК (мРНК) NMDA-рецепторов глутамата к мРНК ß-актина.
Секвенирование. Для проведения полноэкзомного секвенирования ДНК из всей когорты были случайным образом выбраны 208 больных с АА и 122 — с АО. ДНК выделялась из опухолевого материала с помощью DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Германия). Целостность ДНК и размер фрагментов были определены на биоанализаторе (Harvard Bioscience, США). Процедура полноэкзомного секвенирования ДНК проводилась по ранее описанной методике с помощью прибора NextSeq 1000 (Illumina, США) [4]. Также был выполнен анализ покрытия с помощью пакета R bioconductor TEQC, который вычисляет соотношение считываний с целевыми и нецелевыми значениями, покрытие на целевую область, а также среднее покрытие на образец. Графики изменения числа копий созданы с помощью пакета R bioconductor seqCNA.
Single-cell секвенирование. Для реализации предана-литических стадий применяли приведенный выше протокол секвенирования. Количественно выраженность экспрессии определяли по формуле:
(TPM
E. . = log2 ( , п '■1 + 1),
',' 6 10
где TPM. 1 относится к количеству транскриптов на миллион для гена ' в образце j, рассчитанному с помощью RSEM.
Значения TPM делились на 10, поскольку выявлялась сложность библиотек отдельных клеток порядка 100 000 транскриптов. Для каждой клетки рассчитывались 2 меры качества: количество генов, для которых
было картировано хотя бы одно чтение, и средний уровень экспрессии курируемого списка генов домашнего хозяйства. Затем проводилось консервативное исключение всех клеток с менее чем 2500 обнаруженными генами или со средним уровнем экспрессии генов домашнего хозяйства ниже 2,5 единицы в клетке. Для других клеток рассчитывали совокупную экспрессию каждого гена по формуле:
Ea (t> = log2 (average (TPM . L „) + 1).
Для остальных клеток и генов выявляли относительную экспрессию с центрированием уровней экспрессии в клетке.
Результаты
Морфологическое исследование анапластических
астроцитом
Мутацию в гене IDH1 (АА IDH-мут) несли 225 (57,84 %) новообразований астроцитарного ряда, не имели мутаций в генах IDH1 и IDH2 (АА IDH-дт) 164 (42,16 %) опухоли. Усредненная патогистологиче-ская картина астроцитарных глиом включала в себя диффузно инфильтрирующее новообразование глиаль-ной гистиоархитектоники с повышенной митотической активностью: среднее число митозов в АА IDH-мут составило 4,42 ± 0,80 на 10 полей зрения при большом увеличении, при этом в АА IDH-дт митотическая активность составила 4,48 ± 0,82 на 10 полей зрения при большом увеличении. Также наблюдалась отчетливая ядерная атипия, которая выявлена в 82,41 % АА IDH-мут и 83,22 % АА IDH-дт (рис. 1).
Еще один характерный признак АА — высокая плотность клеточного слоя — выявлен в 76,38 % АА IDH-мут и 76,51 % АА IDH-дт. Крупные уродливые ядра встречались в 42,21 % АА IDH-мут, что было значительно выше по сравнению с АА IDH-дт, в которых этот признак наблюдался в 35,57 % случаев (p = 0,004). Значительные внутриопухолевые колебания формы ядра — пойкилоцитоз — выявлены в 54,27 % АА IDH-мут и 52,34 % АА IDH-дт. Маргинация хроматина в ядре определялась в значительном количестве в 36,18 % АА IDH-мут, что было ниже чем в АА IDH-дт, в которых данная особенность встречалась в 41,16 % случаев (p = 0,002). Многоядерные клетки в опухолевой ткани также значительно чаще наблюдались в АА IDH-дт по сравнению с АА IDH-мут (p = 0,002) наравне с патологическими митозами, выявленными в 38,19 % АА IDH-мут и 42,95 % АА IDH-дт (p <0,001). В то же время в соответствии с патогистологическими критериями диагностики АА ни в АА IDH-мут, ни в АА IDH-дт не были определены микроваскулярная пролиферация и некротические фрагменты (см. рис. 1).
Дополнительная характеризация ткани образцов с помощью иммуногистохимического анализа
Рис. 1. Классическая гистологическая картина астроцитомы, grade 3: а, б — окраска гематоксилином и эозином, в, г — иммуногистохимическое исследование выраженности экспрессии маркера Ki-67
Fig. 1. Classical histological pathological picture of astrocytoma, grade 3: а, б — hematoxylin and eosin staining; в, г — immunohistochemical study of the expression of the Ki-67 marker
показала, что пролиферативный потенциал АА ТДй-дт, выраженный в среднем ИМ Ю-67 12,78 ± 2,42 %, был значительно выше пролиферативного потенциала АА ТДЙ-мут, в которых ИМ Ю-67 в среднем составил 8,54 ± 2,48 % (р <0,001) (см. рис. 1).
С помощью регрессионного анализа было показано, что число митозов и патологических митозов оказывало значимое влияние как на показатели безрецидивной (р = 0,024 и 0,028 соответственно), так и общей выживаемости (р <0,001 для всех типов митозов). Кроме того, ИМ Ю-67 также значительно влиял на эти показатели (р <0,001 для всех типов выживаемости) (рис. 2).
Морфологическое исследование анапластических
олигодендроглиом
Мутацию в гене ШН1 имели 90,48 % АО, в то время как 9,52 % новообразований не несли мутаций в генах ШН1 и ШН2. В большинстве случаев, вошедших в настоящую работу, для АО выявлялась классическая патогистологическая картина, включавшая в себя диф-фузно инфильтрирующее глиальное новообразование со значительно повышенной плотностью клеточного слоя, которая была характерна для 88,89 % образцов (рис. 3). В массе своей в опухолевых клетках определялись типичные признаки олигодендроглиальной
дифференцировки, в том числе округлые гиперхромные ядра, перинуклеарные светлые ободки цитоплазмы и несколько клеточных отростков. В 84,12 % случаев присутствовали очаговые микрокальцификации.
Наблюдалась заметная пролиферативная мито-тическая активность: в АО ШН-мут она составила 6,48 ± 1,28 митоза на 10 полей зрения при большом увеличении, в АО ЮН-дт данный параметр был достоверно выше и составил 8,48 ± 1,34 митоза на 10 полей зрения при большом увеличении (р <0,001). Для некоторой части АО (12,69 % случаев) характерен выраженный клеточный плеоморфизм с наличием многоядерных гигантских клеток. Данная разновидность патогистологической картины получила название по-лиморфноклеточного варианта Цюльха, при этом рассматриваемый вариант намного чаще наблюдался в АО Шй-мут по сравнению с АО ШН-дт (р <0,001). Также в 2,12 % случаев встречались саркомоподобные веретеновидные участки, т. е. присутствовали признаки так называемого патогистологического варианта оли-госаркомы; все рассматриваемые случаи принадлежали когорте АО Шй-дт. Характерный сосудистый рисунок с наличием ветвящихся капилляров довольно отчетливо выявлялся в 64,55 % случаев. Патологическая микро-васкулярная пролиферация определена в 56,08 % АО, причем в АО ШН-дт рассматриваемый признак
100
¡3
с
о
50
0 100
50
о
:
Количество митозов <8 / Number of mitoses <8 Количество митозов >8 / Number of mitoses >8
ч
ИМ Ki-67 <14 % / LI Ki-67 <14 % ИМ Ki-67 >14 % / LI Ki-67 >14 %
—i-
-L-
Количество митозов <8 / Number of mitoses <8 Количество митозов >8 / Number of mitoses >8
ИМ Ki-67 <14 % / LI Ki-67 <14 % ИМ Ki-67 >14 % / LI Ki-67 >14 %
-i-
50 100 150
Безрецидивная выживаемость, мес / Recurrence-free survival, months
50 100 150
Общая выживаемость, мес / Overall survival, months
Рис. 2. Безрецидивная выживаемость (а, б) и общая выживаемость (в, г) при диффузных глиомах с различными уровнями митотической активности и выраженности маркера Ki-67. Кривые Каплана—Майера. ИМ — индекс мечения
Fig. 2. Recurrence-free survival (а, б) and overall survival (в, г) in diffuse gliomas with varying mitotic activity level and Ki-67 proliferation marker. KaplanMeier curves; LI — labeling index
а
в
б
г
0
0
0
встречался намного чаще по сравнению с АО /ДН-мут (р <0,001). В зонах опухолевой инфильтрации коры в 60,32 % случаев наблюдалось образование вторичных структур в форме перинейронального сателлитоза. Следует заметить, что в 35,09 % АО /ДН-мут встречались палисадные некрозы, напоминающие таковые при гли-областоме, в то время как в АО /ДН-дт данный признак встречался намного чаще — в 38,89 % случаев (р <0,001). Наличие заметного астроцитарного патогистологиче-ского компонента, включающего не менее 20 % клеточной массы, было характерно для 48,68 % новообразований (рис. 3).
Для более подробного рассмотрения пролифера-тивного профиля новообразований были проанализированы результаты определения ИМ Ю-67, продемонстрировавшие значимое превосходство АО /ДН-дт со средним ИМ Ю-67 14,82 ± 2,26 % над АО /ДН-мут, в которых данный показатель составил 10,44 ± 2,38 % (р <0,001).
Согласно результатам регрессионного анализа наличие сосудистой пролиферации, некрозов, более 20 % площади препарата, занятой саркомоподобными участками, и количество митозов значимо влияют на прогноз не только безрецидивной (p = 0,008 для саркомоподоб-ных фрагментов, p <0,001 для других показателей), но и общей выживаемости пациентов (p = 0,006 для сар-комоподобных фрагментов, p <0,001 для других показателей). Также стоит заметить, что ИМ Ki-67 значимо влиял на показатели безрецидивной и общей выживаемости (p <0,001 для всех типов выживаемости) (рис. 4).
Молекулярно-генетическое исследование
Мутационный профиль астроцитом grade 3. В ходе полноэкзомного секвенирования АА выявлены существенные различия мутационного профиля АА IDH-мут и АА IDH-дт. Самой частой мутацией в АА IDH-мут была мутация в гене ATRX, которая встречалась в 94,48 % случаев. Далее по частоте выявляемости следовали
а б .
у ? (л V-, „ -■ -у, л 5* , f. * . ,> i
г. . t'ii* У'л/ ' . * V\v'
-Г* • V- * /;.< ** .V ~ts . 4
г
Д.' . " , ,, ' л-,
*,. 1 ■ »ii i
у '
* * 54
•Г.
- „г ■ - -
*Vf'
- л
Ч4*- t' у
* i •* Ш&Н'*,
h * I
> V
-Т . * ; ' Л
* V ' . /' f 1 ■ ' .Vi-
•-r-JÄ * г д.-"J
** К -t - - * - * *
.*- » ; . ' * , •• /
" i- / t I
* v
.s r •
V , .
•Vy
л -
■ 1 r
Рис. 3. Классическая гистологическая картина олигодендроглиомы grade 3: а, б — окраска гематоксилином и эозином; в, г — степень выраженности маркера Ki-67
Fig. 3. Classical histological picture of oligodendroglioma grade 3: а, б — stained with hematoxylin and eosin; в, г — the degree of expression of the Ki-67 marker
мутации в гене ТР53, определяющиеся в 84,72 % случаев. Другие мутационные события были существенно более редкими и включали в себя делеции и мутации гена СД^2А (2,08 % случаев), мутации и амплификации гена PDGFRA (2,08 % случаев), мутации промоте-ра генов ТЕЯТ и PTEN (1,38 % случаев), а также мутации в генах ЕОНВ. и NF1 (0,69 % случаев). Характерно, что в АА /ДН-дт чаще всего встречались мутация про-мотера гена ТЕЯТ (80,76 % случаев), амплификации и мутации гена EGFR (61,54 % случаев), делеция CDKN2A (59,62 % случаев), мутации генов ТР53 (45,19 % случаев) и PTEN (32,69 % случаев). Реже наблюдались мутации генов NF1 (29,81 % случаев), PDGFRA (25 % случаев) и ATRX(0,96 % случаев). Метилирование промотера гена MGMT определялось в 42,31 % АА /ДН-мут и 55,77 % АА /ДН-дт.
На показатели безрецидивной выживаемости значимое негативное влияние оказывали мутация про-мотера гена TERT(р <0,001), амплификация и мутация гена EGFR (р <0,001), делеция гена СДШ2А (р <0,001), а также мутации генов ТР53 (р = 0,004) и NF1 (р = 0,002), а на показатели общей выживаемости — мутация промотера гена TERT(р <0,001), амплификация и мутация
гена EGFR (p <0,001), делеция гена CDKN2A (p = 0,002) и мутация гена NF1 (p = 0,004) (рис. 5).
Мутационный профиль олигодендроглиом grade 3.
В случае АО мутационный профиль также сильно зависел от наличия IDH-мутаций. В группе АО IDH-мут коделеция 1p /19q встречалась в 88,89 % случаев, в то время как в группе АО IDH-дт — в 11,11 % случаев. В АО IDH-мут наиболее часто выявлялась мутация промотера гена TERT (94,74 % случаев). Гомозиготная делеция гена CDKN2A встречалась в 46,15 % случаев, мутация гена FUBP1 - в 30,77 %, гена NOTCH1 -в 26,92 % случаев. Более редко наблюдались мутации генов PIK3CA (17,31 % случаев), PIK3R1 (7,69 % случаев), TCF12 (5,77 % случаев) и ARID1A (3,85 % случаев). При этом метилирование промотера гена MGMT выявлялось в 43,68 % АО. Мутационный профиль АО IDH-дт характеризовался высокой встречаемостью мутации промотера гена TERT (83,33 % случаев), амплификации и мутации гена EGFR (77,78 % случаев), делеции гена CDKN2A (55,56 % случаев), мутаций генов TP53 (61,11 % случаев) и PTEN (38,89 % случаев). В меньшей части новообразований определялись мутации генов NF1 (33,33 % случаев), PDGFRA (27,78 %
100
50
0 100
— C пролиферацией сосудов / With vascular proliferation
— Без пролиферации сосудов / Without vascular proliferation
а
C пролиферацией сосудов / With vascular proliferation Без пролиферации сосудов / Without vascular proliferation
\
б
50
0 100
— С некрозами / With necroses
— Баз некрозов/ Without necroses
о i=I
50
в
— Саркомоподобные участки менее 20 % площади препарата / arcoma-like areas less than 20 % of sample area — Саркомоподобные участки более 20 % площади препарата / Sarcoma-like areas more than 20 % of sample area
i
ж
Количество митозов <8 / Number of mitoses <8 — Количество митозов >8 / Number of mitoses >8
С некрозами / With necroses Баз некрозов / Without necroses
ИМ Ki-67 <14 % / LI Ki-67 <14 % ИМ Ki-67 >14 % / LI Ki-67 >14 %
д
Саркомоподобные участки менее 20 % площади препарата / arcoma-like areas less than 20 % of sample area — Саркомоподобные участки более 20 % площади препарата / Sarcoma-like areas more than 20 % of sample area
и
— Количество митозов <8 /
Number of mitoses <8 — Количество митозов >8 / Number of mitoses >8
ИМ Ki-67 <14 % / LI Ki-67 <14 % ИМ Ki-67 >14 % / LI Ki-67 >14 %
50 100 150 0 50 100 Безрецидивная выживаемость, мес / Recurrence-free survival, months
150
50 100 150 0 50 100 Общая выживаемость, мес / Overall survival, months
150
200
Рис. 4. Безрецидивная (а, в, г, ж, з) и общая (б, д, и, е, к) выживаемость пациентов с анапластическими олигодендроглиомами в зависимости от значимых патогистологических факторов, в том числе пролиферации сосудов (а, б), некрозов (в, г), количества митозов (д, е), наличия сар-комоподобных патологических фрагментов (ж, з), пролиферативного маркера Ki-67 (и, к). Кривые Каплана—Майера
Fig. 4. Recurrence-free (а, в, г, ж, з) and overall (б, д, и, е, к) survival in patients with anaplastic oligodendrogliomas depending on significant pathohistological factors including number of vascular proliferation (а, б), necroses (в, г), number of mitoses (д, е), presence of sarcoma-like pathological fragments (ж, з), Ki-67 proliferative marker (и, к). Kaplan—Meier curves
случаев) и ATRX (0,96 % случаев). Метилирование про-мотера гена MGMT наблюдалось в 55,56 % новообразований.
При рассмотрении практических следствий фундаментальных закономерностей выявлено, что на показатели безрецидивной выживаемости значимое негативное влияние оказывали делеция генов CDKN2A (p <0,001) и PIK3CA (p = 0,002), а на показатели общей выживаемости - также CDKN2A (p <0,001) и PIK3CA (p = 0,004) (рис. 6).
Внутриопухолевая гетерогенность
Внутриопухолевая гетерогенность глиом с IDH1-и ГОЮ-мутациями. Изучен клеточно-популяционный состав АА IDH-мут (grade 3) и АО IDH-мут (grade 3) с помощью single-cell секвенирования РНК, и проведено сравнение полученных этим методом («Атлас ракового генома», The Cancer Genome Atlas) данных с результатами по диффузным глиомам (IDH-мут, grade 2).
Большую часть клеточной массы составили астроци-топодобные (AC-подобные) и олигодендроглиально-подобные (OPC-подобные) клеточные популяции (в приблизительно равной пропорции), в качестве камбиального пула выступали пронейрональные глиомные стволовые клетки (PGSC). При сравнении с диффузными глиомами (IDH-мут, grade 2) качественный состав клеточных популяций сохранялся, равно как и количественное соотношение AC-подобных и OPC-подобных клеточных популяций. Тем не менее количество PGSC значимо возросло в диффузных глиомах IDH-мут grade 3 по сравнению с диффузными глиомами IDH-мут grade 2 (p <0,001) (рис. 7).
Внутриопухолевая гетерогенность глиом без IDH1-и ГОШ-мутаций. При рассмотрении состояния внутри-опухолевой гетерогенности АА IDH-дт и АО IDH-дт выявлено продолжение намеченных ранее тенденций к сохранению паритета AC- и OPC-подобных клеточных популяций, а также к дальнейшему значимому
е
г
к
з
0
0
0
100
50
0 100
Без мутации в гене TERT / TERTgene mutation С мутацией в гене TERT / With TERT gene mutation
- Do my I аЦ1г1
Without TER
а
Без мутации в гене EGFR / Without EGFR gene mutation
С мутацией в гене EGFR / With EGFR gene mutation
Без мутации в гене TERT / Without TERT gene mutation С мутацией в гене TERT/ With TERT gene mutation
в
Без мутации в гене EGFR / Without EGFR gene mutation С мутацией в гене EGFR / With EGFR gene mutation
50
Без мутации в гене TP53 / Without TP53 gene mutation
С мутацией в гене TP53 / With TP53 gene mutation
д
Без мутации в гене NF1 / Without NF1 gene mutation
С мутацией в гене NF1 / With NF1 gene mutation
Без делеции в гене CDKN2A / Without CDKN2A gene deletion С делецией в гене CDKN2A / With CDKN2A gene deletion
ж
Без мутации в гене NF1 / Without NF1 gene mutation С мутацией в гене NF1 / With NF1 gene mutation
50 100 150 0 50 100 Безрецидивная выживаемость, мес / Recurrence-free survival, months
150
50 100 150 0 50 100 Общая выживаемость, мес / Overall survival, months
150
200
Рис. 5. Безрецидивная (а, б, д, е) и общая (в, г, ж, з) выживаемость пациентов с анапластическими астроцитомами в зависимости от значимых молекулярных факторов, в том числе от мутации гена TERT (а, б), амплификации и мутации гена EGFR (в, г), мутации генов TP53 (д), NF1 (е, ж), делеции гена CDKN2A (з). Кривые Каплана—Майера
Fig. 5. Recurrence-free (а, б, д, е) and overall (в, г, ж, з) survival in patients with anaplastic astrocytomas depending on significant molecularfactors including TERT gene mutations (а, б), EGFR gene amplifications and mutations (в, г), TP53 (д), NF1 (е, ж) genes' mutations, CDKN2A gene deletions (з). KaplanMeier curves
100
50
Без делеции в гене CDKN2A / Without CDKN2A gene deletion — С делецией в гене CDKN2A / With CDKN2A gene deletion
а
Без мутации в гене PIK3CA / Without PIK3CA gene mutation
С мутацией в гене PIK3CA / With PIK3CA gene mutation
Без делеции в гене CDKN2A / Without CDKN2A gene deletion С делецией в гене CDKN2A / With CDKN2A gene deletion
Без мутации в гене PIK3CA / Without PIK3CA gene mutation
С мутацией в гене PIK3CA / With PIK3CA gene mutation
о
50 100 150 0 50 100 Безрецидивная выживаемость, мес / Recurrence-free survival, months
150
50 100 150 0 50 100 Общая выживаемость, мес / Overall survival, months
150
200
Рис. 6. Безрецидивная (а, б) и общая (в, г) выживаемость пациентов с анапластическими олигодендроглиомами в зависимости от значимых молекулярных факторов, в том числе делеции гена CDKN2A (а, б) и мутации гена PIK3CA (в, г). Кривые Каплана—Майера Fig. 6. Recurrence-free (а, б) and overall (в, г) survival in patients with anaplastic oligodendrogliomas depending on significant molecularfactors including CDKN2A gene deletions (а, б) and PIK3CA gene mutations (в, г). Kaplan—Meier curves
увеличению числа PGSC. В то же время в большом количестве стала выявляться принципиально новая клеточная популяция — мезенхимальноподобных (MES-подобных) клеток, ранее в диффузных глиомах Шй-мут не наблюдавшаяся. При этом преимущественно определялось наличие клеток подтипа MES2 и лишь небольшое количество клеток подтипа MES1 (рис. 8).
Среднее значение активности экспрессии NMDA-рецепторов в опухолевых образцах составило 53,46 ± 17,20 (от 16,24 до 94,24). При сравнении этого показателя в группах ТДй-положительных и ТДй-отрицательных АА стало очевидно, что для /ОН+-опухолей значение NMDA достоверно ниже, чем для ГОН-отрицательных опухолей: 44,49 ± 15,50 против 62,42 ± 13,90 (р <0,001).
б
е
0
0
0
б
г
0
0
0
rs m CD с
0 и — ^
1 гм
т í á.
í5 ^
О
И р
о а
го
и
S .SS
.О СС
ОРС-подобные / OPC-like
ОРС-подобные / OPC-like
АС-подобные / AC-like Диффузные глиомы, grade 2 / Diffuse gliomas, grade 2
•íWfcsi.."
Процент пролиферирующих клеток / Percentage of proliferating cells
АС-подобные / AC-like Диффузные глиомы, grade 3 / Diffuse gliomas, grade 3
2
2
2 1 1 2 Относительное метамодульное значение [log2 (генный модуль 2)] / Relative metamodule value [log2 (gene module 2)]
Рис. 7. Результаты single-cell секвенирования РНК астроцитом и олигодендроглиом с мутацией в генах IDH1 и IDH2. На диаграмме каждая точка соответствует одной клетке, цвет точки демонстрирует пролиферативную активность клетки, положение по осям показывает степень дифференцировки клеточных элементов по суммарным молекулярным параметрам в виде относительных метамодульных значений, отражающих выраженность астроцитоподобной (AC-подобной) или олигодендроглиально-подобной (OPC-подобной) клеточной дифференцировки Fig. 7. Results of single-cell RNA sequencing of astrocytomas and oligodendrogliomas with mutations in IDH1 and IDH2 genes. Each dot on the diagram corresponds to a single cell, the color of the dot demonstrates the proliferative activity of the cell, and the position on the axes indicates the degree of differentiation of the cellular elements based on the overall molecular parameters in the form of relative meta-module values reflecting the expression of astrocyte-like (AC-like) or oligodendroglial-like (OPC-like) cellular differentiation
Распределение мРНК NMDA также было достоверно выше в группе опухолей без мутации IDH1 (6,81 (6,14— 8,46) против 4,54 (3,20-5,43);p <0,001), что вполне ожидаемо.
Анализ зависимости распространенности опухолевого процесса (косвенного показателя объема опухоли) не продемонстрировал взаимосвязи между вовлечением в опухолевый процесс нескольких долей мозга и значением активности экспрессии NMDA в опухолевых клетках: 50,05 (37,79; 62,78) для пациентов с поражением 1 доли против 55,16 (44,62; 68,47) для больных с поражением 2 и более долей (р = 0,235).
Корреляционный анализ показал, что взаимосвязь между экспрессией NMDA-рецепторов и значением ИМ Ю-67 была статистически значима (р = <0,001; коэффициент корреляции — 0,8829519). Ожидаемо, что распределение мРНК NMDA также продемонстрировало статистически достоверную взаимосвязь с ИМ Ю67 (р <0,001; коэффициент корреляции — 0,8133192).
При сравнении показателей общей выживаемости в зависимости от распределения активности экспрессии NMDA-рецепторов, а также интенсивности экспрессии
мРНК этих рецепторов не было выявлено статистически достоверных различий при использовании какого-либо из 3 вышеназванных тестов (р = 0,13). Также не обнаружено взаимосвязи показателей общей выживаемости и наличия /ДШ-мутации в опухоли (р = 0,18). В ходе использования регрессии Кокса выяснилось, что высокий уровень мРНК NMDA-рецепторов является одним из наиболее значимых неблагоприятных предикторов выживаемости (рис. 9).
Любопытно, что экспрессия NMDA-рецепторов (и, соответственно, мРНК NMDA) четко коррелировала с показателями безрецидивной выживаемости, хотя, как сказано выше, не была ассоциирована с показателями общей выживаемости (р = 0,0333 по 3 различным тестам). При этом высокий уровень экспрессии NMDA-рецепторов выступал неблагоприятным предиктором, влияющим на риск развития рецидива.
Обсуждение
Полученные результаты представляют определенную фундаментальную и практическую научную ценность. В фундаментальной плоскости впервые подробно
АС-подобные / AC-like Относительное метамодульное значение / Relative metamodule, value
MES-подобные / MES-like
MES2
Процент пролиферирующих клеток / Percentage of proliferating cells
ОРС-подобные / OPC-like
Рис. 8. Результаты single-cell секвенирования РНКастроцитом и оли-годендроглиом без мутаций в генах IDH1 и IDH2. На диаграмме каждая точка соответствует одной клетке, цвет точки демонстрирует пролиферативную активность клетки, положение по осям, в том числе дуговым секторальным, показывает степень дифференцировки клеточных элементов по суммарным молекулярным параметрам в виде относительныхметамодульных значений, отражающих выраженность астроцитоподобной, олигодендроглиальноподобной или мезенхимально-подобной (MES-подобной) клеточной дифференцировки с подразделением на 2 субтипа клеточных субпопуляций (MES1 и MES2) Fig. 8. Results of single-cell RNA sequencing of astrocytomas and oligodendrogliomas without mutations in the IDH1 and IDH2genes. Each dot on the diagram represents a single cell, the color of the dot demonstrates the proliferative activity of the cell, and the position on the axes, including the sectorial arc, shows the degree of differentiation of the cellular elements based on the overall molecular parameters in the form of relative meta-module values, reflecting the expression of astrocyte-like, oligodendrocyte-like, or mesenchy-mal-like (MES-like) cellular differentiation, with division into two subtypes as MES1 and MES2 cellular subpopulations
24 36 48
Время, мес / Time, months
Рис. 9. Кривые Каплана—Майера, отражающие общую (а) и безрецидивную (б) выживаемость пациентов с анапластическими глиомами в зависимости от активности NMDA-рецепторов глутамата Fig. 9. Kaplan—Meier curves showing overall (а) and recurrence-free (б) survival of patients with anaplastic gliomas depending on glutamate NMDA receptor activity
изучены различия между диффузными глиомами grade 3 астроцитарного и олигодендроглиального гистогенеза. Морфологические данные подтверждают ранее выявленные молекулярные закономерности, в том числе убедительно демонстрируют, что АА IDH-мут характеризуются более медленным и менее злокачественным течением по сравнению с АА IDH-дт [5]. В частности, наличие большего количества крупных уродливых ядер в АА IDH-мут служит признаком дегенеративных изменений, которые являются следствием регионарного регресса новообразования — классической патогенетической проекции относительно медленно растущих опухолей.
В то же время впервые показана значимость такого тонкого морфологического признака, как маргинация хроматина в ядре, зачастую остающегося вне подробного рассмотрения при проведении патогистологиче-ского анализа. Было продемонстрировано наличие
фундаментальных различий по данному параметру между двумя принципиальными генетическими типами анапластических глиом, при этом преимущество по степени выраженности оказалось у АА ШН- дт, что, вероятнее всего, связано с более высокой активностью продукции РНК и метаболизма опухолевых клеток в данных новообразованиях и служит отражением их злокачественного характера. Более высокий потенциал малигнизации важен и для формирования многоядерных клеток: набирая слишком высокие темпы пролиферации, они успевают разделить лишь ядра, не подвергая демаркации цитоплазму. Морфологически это реализуется в формировании многоядерных клеток, согласно представленным в данной работе результатам, статистически значимо чаще встречающихся в более злокачественных АА ЮН-дт. Данная закономерность ранее не была изучена и является морфологической новинкой. Та же причина, а именно высокая скорость
клеточного деления, обусловливает и большую частоту встречаемости в АА ШН-дт патологических митозов.
Анализ морфологических признаков клеток оли-годендроглиом grade 3 также довольно определенно демонстрирует, что между АО ШН-мут и нозологически соседствующими им АО ЮН-дт существует принципиальная разница не только в молекулярной плоскости. Патогистологическое исследование позволяет различить опухоли с мутациями в генах ШН1 и ШН2 и без них, но для точной диагностики требуется детальный морфологический анализ. Самым понятным и очевидным различием в данном случае выступает количество митозов, которое выше в АО ШН-дт по сравнению с АО ТДН-мут, что характеризует более злокачественное их течение и более быстрое прогрессирование. В то же время подобно астроцитарным аналогам более доброкачественные АО ШН-мут содержат существенно больше полиморфноклеточных фрагментов, что также служит отражением процесса регионарной регрессии. Этого нельзя сказать о фрагментах новообразования с саркомоподобными свойствами, поскольку их присутствие говорит о таком патогенетическом процессе, как метаплазия, служащем проявлением высокой степени внутренней молекулярной пластичности опухоли, позволяющей ей трансформироваться в ткани другого гистогенеза. Это невозможно без глубоких внутренних перестроек генетического аппарата в векторе малигни-зации. Хорошо демонстрирует меньший злокачественный потенциал АО ШН-мут по сравнению с АО ШН-дт, и более низкая выраженность сосудистой пролиферации, которая напрямую связана с важнейшими метаболическими факторами, является краеугольным камнем на путях патогенеза диффузных глиом и выступает принципиальным, а в нозологическом смысле нередко и основным критерием злокачественности процесса [6, 7]. Это можно сказать и о палисадных некрозах, которые характеризуются лишь тем, что находятся на более поздней морфологической стадии того же патогенетического пути.
Полученные в этом исследовании данные по морфологической картине новообразований уникальны и практически не имеют аналогов в мировой литературе. К тому же значимость результатов работы подтверждается тем, что большая часть рассмотренных выше морфологических параметров в определенной степени влияет на показатели выживаемости пациентов. На первый взгляд, этого нельзя сказать о молекулярно-генетических данных, они в целом скорее демонстри-
руют соответствие исследуемой когорты мировому литературному опыту [8, 9]. В данном исследовании на локальной группе пациентов подтверждена современная концепция гисто-молекулярной классификации диффузных глиом. Глиомы без мутаций в генах IDH1 и IDH2 близки по свойствам и прогнозу к глио-бластомам [9—12]. Однако стройная молекулярная теория начинает претерпевать существенные искажения и в конечном счете обретает новое патогенетическое измерение при изучении данных single-cell секвениро-вания.
В ходе клеточно-популяционного анализа мы получили данные, соответствующие результатам предшествующих научных работ. При этом была выявлена не описанная ранее особенность опухолей: АА IDH-дт и АО IDH-дт по своей популяционной структуре не аналогичны глиобластомам. В то же время в соответствии с высказанной ранее концепцией они должны быть как минимум очень близки к глиобластомам по данному параметру. Все дело в том, что, несмотря на схожесть мутационных профилей новообразований, наряду с близостью клинических аспектов в патогенетическом отношении АА IDH-дт и АО IDH-дт по сравнению с глиобластомами представляют собой отдельные новообразования, для которых характерен свой уникальный патогенетический путь. Дополнительным фактором прогрессирования рассматриваемых новообразований и обеспечения повышения их злокачественного потенциала выступают глутаматэргические рецепторные системы, способствующие распространению глиом в ткани головного мозга. К тому же согласно результатам нашего исследования существенную роль в данном процессе играют NMDA-рецепторы глутамата. В таком случае логично заключить, что для этих новообразований необходим свой собственный не только диагностический, но и лечебный подход, и это непременно должно приниматься в расчет при дальнейшей глубокой персонализации разработок в данной сфере.
Заключение
В ходе исследования были выявлены ключевые различия между диффузными глиомами grade 3 астроци-тарного и олигодендроглиального типов. Морфологические данные согласуются с молекулярными данными и подтверждают более медленное и менее агрессивное течение АА с IDH-мутацией по сравнению с АА без нее. Эти результаты имеют как фундаментальную, так и практическую значимость.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Louis D.N., Perry A., Reifenberger G., von Deimling A. et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: a summary. Acta Neuropathologica 2016;131(6):803-20. DOI: 10.1007/s00401-016-1545-1
2. Cardiff R.D., Miller C.H., Munn R.J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols 2014;2014(6):655-8. DOI: 10.1101/pdb.prot073411
3. Nikitin P.V., Musina G.R., Pekov S.I. et al. Cell-population dynamics in diffuse gliomas during gliomagenesis and its impact on patient survival. Cancers 2022;15(1):145-64.
DOI: 10.3390/cancers15010145
4. Ravi R.K., Walton K., Khosroheidari M. MiSeq: a next generation sequencing platform for genomic analysis. Methods Mol Biol 2018;1706:223-32. DOI: 10.1007/978-1-4939-7471-9_12
5. Ceccarelli M., Barthel F.P., Malta T.M. et al. Molecular profiling reveals biologically discrete subsets and pathways of progression in diffuse glioma. Cell 2016;164(3):550-63.
DOI: 10.1016/j.cell.2015.12.028
6. Griveau A., Seano G., Shelton S.J. et al. A Glial signature and Wnt7 signaling regulate glioma-vascular interactions and tumor microenvironment. Cancer Cell 2018;33(5):874-89.e7.
DOI: 10.1016/j.ccell.2018.03.020
7. Venteicher A.S., Tirosh I., Hebert C. et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science 2017;355(6332):eaai8478.
DOI: 10.1126/science.aai8478
8. Inoue S., Li W.Y., Tseng A. et al. Mutant IDH1 downregulates ATM and alters DNA repair and sensitivity to DNA damage independent of TET2. Cancer Cell 2016;30(2):337-48.
DOI: 10.1016/j.ccell.2016.05.018
9. Berzero G., Di Stefano A.L., Ronchi S. et al. IDH-wildtype lower-grade diffuse gliomas: the importance of histological grade and molecular assessment for prognostic stratification. Neuro-Oncology 2021;23(6):955-66. DOI: 10.1093/neuonc/noaa258
10. Shirahata M., Ono T., Stichel Det al. Novel, improved grading system(s) for IDH-mutant astrocytic gliomas. Acta Neuropathologica 2018;136(1):153-66.
DOI: 10.1007/s00401-018-1849-4
11. Galbraith K., Snuderl M. Molecular pathology of gliomas. Surg Pathol Clin 2021;14(3):379-86. DOI: 10.1016/j.path.2021.05.003
12. Xu W., Yang X., Hu X., Li S. Fifty-four novel mutations
in the NF1 gene and integrated analyses of the mutations that modulate splicing. Int J Mol Med 2014;34(1):53-60. DOI: 10.3892/ijmm.2014.1756
Вклад авторов
П.В. Никитин: разработка дизайна и концепции исследования, получение данных для анализа, анализ полученных данных, написание текста статьи, обзор публикаций по теме статьи;
А.Ю. Беляев: получение данных для анализа, анализ полученных данных, написание текста статьи, обзор публикаций по теме статьи;
Г.Р. Мусина: получение данных для анализа, анализ полученных данных;
Г.Л. Кобяков: разработка дизайна и концепции исследования;
И.Н. Пронин, Д.Ю. Усачев: редактирование.
Authors' contribution
P.V. Nikitin: development of the design and concept of the study, obtaining data for analysis, analysis of the data obtained, article writing, review of publications on the topic of the article;
A.Yu. Belyaev: obtaining data for analysis, analyzing the data obtained, writing the text of the article, reviewing publications on the topic of the article; G.R. Musina: obtaining data for analysis, analysis of the data obtained; G.L. Kobyakov: development of design and research concept; I.N. Pronin, D.Yu. Usachev: editing.
ORCID авторов / ORCID of authors
П.В. Никитин / P.V. Nikitin: https://orcid.org/0000-0003-3223-4584 А.Ю. Беляев / A.Yu. Belyaev: https://orcid.org/0000-0002-2337-6495 Г.Р. Мусина / G.R. Musina: https://orcid.org/0000-0002-9962-0909 Г.Л. Кобяков / G.L. Kobyakov: https://orcid.org/0000-0002-7651-4214 И.Н. Пронин / I.N. Pronin: https://orcid.org/0000-0002-4480-0275 Д.Ю. Усачев / D.Yu. Usachev: https://orcid.org/0000-0002-8924-7346
Конфликт интересов. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа выполнена без спонсорской поддержки. Funding. The work was performed without external funding.
Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики. Протокол исследования одобрен комитетом по биомедицинской этике ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко» Минздрава России. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании.
Compliance with patient rights and principles of bioethics. The study protocol was approved by the biomedical ethics committee of N.N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery, of the Ministry of Health of Russia. All patients gave written informed consent to participate in the study.
Статья поступила: 10.05.2023. Принята к публикации: 17.07.2023. Article submitted: 10.05.2023. Accepted for publication: 17.07.2023.
