CC BY
35
микробиология
Единых требований к выбору стандартов нет; более того, для целого ряда аналитов стандартов нет вообще.
Производитель, однако, должен указывать в инструкции к набору и паспорте к серии стандарт (эталон) более высокого уровня, по которому аттестуются калибровочные пробы, и обеспечивать метрологическую прослеживаемость и межсерийную воспроизводимость. Другими словами, калибраторы каждой серии препарата должны быть аттестованы относительно одного стандарта и этот стандарт должен быть указан.
Результаты постоянного мониторинга тест-систем, представленных на рынке, показали, что не всегда производителям удается постоянно, от серии к серии, обеспечивать номинацию калибраторов в соответствии с заявленным стандартом (рис. 2).
Подобные факты, к сожалению, не только делают невозможным сравнение результатов двух тестов и более, но и подвергают сомнению ценность подобной лабораторной информации для клиницистов.
Исследование, проведенное С. Stephan и соавт. [15], выявило значительные различия результатов исследования ПСА (общий и свободный), полученных с использованием пяти наиболее известных зарубежных наборов для автоматических анализаторов. Одним из объяснений такой ситуации, по мнению авторов, является то, что наборы лишь трех производителей калиброваны по международному стандарту. Ряд работ, проведенных за последние годы, подтверждает значимость указанной проблемы [4, 9-11, 13].
Заключение. Современные рыночные условия предоставляют возможность широкого выбора диагностикумов как отечественных, так и зарубежных производителей с открытым и закрытым форматом анализа. Клинико-диагностические лаборатории должны использовать регламентированные методы для оценки и сравнения, учитывая ограничения в применении метода, особенности аналита и используемых методик.
ЛИТЕРАТУРА
1. ГОСТ Р ИСО 15189-2006 "Лаборатории медицинские. Частные требования к качеству и компетентности. - М., 2007.
2. ГОСТ Р 51352-99. Наборы реагентов для клинической лабораторной диагностики. Методы испытаний. - М., 1999.
3. ГОСТ Р 53022.2-2008. Технологии лабораторные клинические. Требования к качеству лабораторных исследований. Ч. 2. Оценка аналитической надежности методов исследования (точность, чувствительность, специфичность). - М., 2009.
4. BlijenbergE. G., Yurdakul G., Van ZelstB. D. et al. // Br. J. Urol. Int.
- 2001. - Vol. 88. - P. 545-550.
5. Brooks Z. Performance-Driven Quality control. - 2001.
6. Browning M. C., Bennet W. M., Kirkaldy A. J., Jung R. T. // Clin. Chem. - 1988. - Vol. 34, № 4. - P. 696-699.
7. Erden G., Barazi A. O., Tezcan G., Yildirimkaya M. M. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. - 2008. - Vol. 68, № 3. - P. 212-218.
8. Jensen E., Petersen P. H., Blaabjerg O., Hegedus L. // Clin. Chem Lab. Med. - 2007. - Vol. 45, № 8. - P. 1058-1064.
9. Kort S. A., Martens F., Vanpoucke H. et al. // Clin. Chem. - 2006. -Vol. 52. - P. 1568-15740.
10. LinkR. E., Shariat S. F, Nguyen C. V. et al. // J. Urol. (Baltimore). -2004. - Vol. 171. - P. 2234-2238.
11. PatelD., White P. A., Milford W. A. // Br. J. Urol. Int. - 2000. - Vol. 85. - P. 686-689.
12. Ricos C., Alvarez V., Cava F. et al. // http:/www.westgard.com/ guest17.htm
13. Roddam A. W., Rimmer J., Nickerson C., Ward A. M. // Ann. Clin. Biochem. - 2006. - Vol. 43. - P. 35-48.
14. Soletormos G., Semjonow A., Sibley P. E. et al. // Clin. Chem. - 2005.
- Vol. 51. - P. 1342-1351.
15. Stephan C., Kramer J., Meyer H. A., Kristiansen G. // Br. J. Urol. Int. - 2007. - Vol. 99. - P. 1427-1431.
Поступила 22.03.11
МИКРОБИОЛОГИЯ
© коллектив авторов, 2012
УДК 615.281.8:578.828.61.015.8
А. И. мызникова, Д. А. Куевда, Г. А. Шипулин, Н. Н. Ладная, в. в. Покровский
ВНЕШНИЙ Контроль КАЧЕСТВА ИДЕНТИФИКАЦИИ МУТАЦИЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ВИЧ К АНТИРЕТРОВИРУСНЫМ ПРЕПАРАТАМ: РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОГРАММЫ "РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ВИЧ 2009"
ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, москва
Разработана панель контрольных образцов для внешней оценки качества работы лабораторий, выполняющих исследование лекарственной устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам. Проведен первый цикл внешнего контроля качества идентификации мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам. Результаты цикла выявили ряд существующих проблем и определили необходимость регулярного проведения такого рода исследований в будущем.
Ключевые слова: внешний контроль качества, лекарственная устойчивость ВИЧ к антиретровирусным препаратам, секвенирование
A.I. Myznikova, D.A. Kuyevda, G.A. Shipulin, N.N. Ladnaya, V.V. Pokrovsky THE OUTER QUALITY CONTROL OF IDENTIFICATION OF MUTATIONS OF HIV DRUG RESISTANCE TO ANTI-RETROVIRUS PREPARATIONS: THE RESULTS OF "HIV RESISTANCE-2009" PROGRAM The panel of control samples for outer quality control of laboratories functioning was developed to be implemented in the research of HIV drug resistance to anti-retrovirus preparations. The first cycle of outer quality control was applied to identify mutations of HIV drug resistance to anti-retrovirus preparations. The results of cycle revealed certain significant issues and determined the need in regular implementation of studies of this kind in future.
Key words: outer quality control, drug resistance, anti-retrovirus preparation
Таблица 1
Характеристика образцов панели "Резистентность ВИЧ 2009"
Образец Первоисточник Субтип Вирусная нагрузка, копий/мл
БД Стэндфордского университета БД "Рега" Бельгийского Католического университета Леувена (ПР и ОТ) БД "Комет" Люксембургской лаборатории ретро-вирусов (ПР и ОТ)
ПР ОТ
А Клинический изолят А А А1 А1 2,4 • 104
В То же А CRF01_AE А1 А1 5,35 • 104
С " " А CRF01_AE А1 А1 1 • 104
D " " K CRF01_AE А1 А1 5,62 • 104
E Клинический образец - - - - 0
Примечание. ПР - протеаза; ОТ - обратная транскриптаза; БД - база данных..
Введение. Возникновение лекарственной устойчивости ВИЧ является наиболее частой причиной неэффективности применяемой терапии ВИЧ-инфекции. В связи с этим осуществление мониторинга возникновения мутаций резистентности ВИЧ к антиретровирусным препаратам (АРВП) является общепризнанным подходом к своевременному выявлению неэффективных схем терапии и подбору лекарственных препаратов с учетом полученных данных.
Для обнаружения мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ используют тесты на основе секвенирования фрагментов нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих белки - мишени АРВТ, с последующим проведением виртуального фенотипирования [1]. Понятно, что точность проведения анализа во многом определяет эффективность назначаемой в дальнейшем терапии. За рубежом разработаны рекомендации по работе лабораторий, проводящих анализ резистентности ВИЧ к АРВП. Рекомендации включают в себя обязательное регулярное участие лабораторий в циклах внешнего контроля качества [2].
В настоящее время в мире производятся профессиональные панели для проведения внешней оценки качества идентификации мутаций резистентности ВИЧ к АРВП: ЕПУА [7], УРА [5], TАQАS [6], АШЗ [3] и др. [4]. Эти панели широко используются лабораториями в различных странах, однако ввоз этих панелей на территорию РФ затруднен вследствие существующих административных ограничений. Кроме того, состав таких панелей не учитывает особенностей распространения субтипов ВИЧ на территории РФ.
Несмотря на то что с 1995 г. в РФ функционирует федеральная система внешней оценки качества клинических лабораторных исследований (ФСВОК) [8], в циклах не предусмотрено проведение внешнего контроля качества идентификации мутаций устойчивости ВИЧ к АРВП, хотя исследование лекарственной устойчивости ВИЧ на территории РФ осуществляется с 2006 г.
Исходя из сказанного выше проведение первого цикла внешнего контроля качества идентификации мутаций резистентности ВИЧ к АРВП на территории РФ является важной задачей.
В соответствии с приказом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Роспотребнадзора от 17. 03. 08 № 88 "О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных заболеваний" на базе ФГУН ЦНИИ
Для корреспонденции:
Мызникова Анна Игоревна, канд. биол. наук, науч. сотр. отд. молекулярной диагностики и эпидемиологии Адрес: 111123, Москва, ул. Новогиреевская, 3а Телефон: (495) 974-96-46 E-mail: [email protected]
эпидемиологии Роспотребнадзора был создан референс-центр по мониторингу ВИЧ и ВИЧ-ассоциированных инфекций. Согласно номинированным функциям, в 2009 г. референс-центром по мониторингу ВИЧ и ВИЧ-ассоциированных инфекций проводилось исследование внешней оценки качества идентификации мутаций резистентности ВИЧ к АРВП на территории РФ - "Резистентность ВИЧ 2009". В настоящей статье отражены результаты указанной работы.
Материалы и методы. 1. Описание панели. Панель "Резистентность ВИЧ 2009" содержала 5 образцов ВИЧ-1 (табл. 1). Образцы панели были приготовлены разведением предварительно охарактеризованных клинических образцов на не содержащей ВИЧ, вирусов гепатита В и С, криопреципити-рованной плазме, далее расфасованы по 250 мкл в пробирки и лиофилизованы. Панель "Резистентность ВИЧ 2009" содержала по 2 пробирки каждого образца. Для работы с образцами панели в каждую пробирку вносили по 0,25 мл стерильной деионизованной (бидистиллированной) воды комнатной температуры, затем 2 пробирки одного образца панели объединили в одну.
Концентрация вирусных частиц в образцах панели, содержащих ВИЧ, варьировала от 104 до 5,62 • 104 копий/мл. Образец Е не содержал вирусных частиц и являлся отрицательным контролем (см. табл. 1).
Образцы А-D были подобраны таким образом, что содержали различный набор мутаций резистентности ВИЧ к АРВП как в гене протеазы, так и в гене ревертазы (табл. 2, 3).
2. Описание системы сбора результатов анализа панели "Резистентность ВИЧ2009" от лабораторий-участников. Результаты тестирования панели "Резистентность ВИЧ 2009" получали в виде результирующих нуклеотидных последовательностей, загружаемых на сайт "Российская база данных устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам" (http://hivresist.pcr.ru/), созданный референс-центром по мониторингу ВИЧ и ВИЧ-ассоциированных инфекций.
Выгрузка результирующих нуклеотидных последовательностей на сайт производилась в формате FASTA.
В случае необходимости участники имели возможность редактирования результирующей нуклеотидной последовательности до авторизации загруженных данных. После авторизации данные учитывались в исследовании.
3. Анализ результатов программы "Резистентность ВИЧ 2009". Для каждого образца панели была сформирована референс-нуклеотидная последовательность на основе данных, полученных от всех лабораторий, принимающих участие в программе "Резистентность ВИЧ 2009", и данных, полученных референс-центром по мониторингу ВИЧ и ВИЧ-ассоциированных инфекций.
Референсная нуклеотидная последовательность образца панели - это нуклеотидная последовательность гена про-теазы и фрагмента гена обратной транскриптазы, которая
мИКРОБИОЛОГИЯ
Таблица 2
различия в нуклеотидной последовательности гена протеазы у образцов А-О панели "резистентность ВиЧ 2009" в позициях аминокислот из списка значимых мутаций, представленного Международным обществом борьбы со СПИДом (IAS) [9]
Таблица 3
Различия в нуклеотидном составе гена обратной транскрипта-зы у образцов А-О панели "Резистентность ВИЧ 2009" в позициях аминокислот из списка значимых мутаций, представленного Международным обществом борьбы со СПИДом (IAS) [9]
Позиция Дикий Панель "Резистентность ВИЧ"
AК тип A В C D
ПР-10 СТС STT MTT CTT STT
ПР-11 GTC GTT
ПР-13 АТА GTA GTA
ПР-16 GGG GAA GGA GGA GAA
ПР-20 ААG ARA* AAA AAA AGA
ПР-24 ТТА
ПР-30 GАТ
ПР-32 GТА
ПР-33 ТТА
ПР-34 GАА
ПР-35 GАА GAC GAC GAC
ПР-36 АТG ATA ATA ATA ATA
ПР-43 ААА
ПР-46 АТG
ПР-47 АТА
ПР-48 GGG
ПР-50 АТТ
ПР-53 ТТТ
ПР-54 АТС
ПР-58 САG CAA
ПР-60 GАТ
ПР-62 АТА
ПР-63 СТС CTT CTT CTT CTT
ПР-64 АТА
ПР-69 САТ AAA AAA AAA AAA
ПР-71 GCT
ПР-73 GGТ
ПР-74 АСА ACR ACG
ПР-76 ТТА
ПР-77 GТА ATA ATA
ПР-82 GТС GTC
ПР-83 ААС
ПР-84 АТА
ПР-85 АТТ
ПР-88 ААТ AAY AAC
ПР-89 СТG ATG ATG ATG ATG
ПР-90 ТТG
ПР-93 АТТ CTT CTT
Позиция Дикий Панель "Резистентность ВИЧ"
AК тип A В С D
РТ-41 ATG
РТ-62 Gcc GTY GTT GТY GTT
РТ-65 AAA AAC
РТ-67 GAC GAT GAT GАТ GAT
РТ-69 ACT
РТ-70 AAA AAG AAG ААГ AAG
РТ-74 TTA GTA
РТ-75 GTA
РТ-77 TTC
РТ-90 GTT ATT GTG
РТ-98 GCA GCG GCG GCG
РТ-100 TTA СТА
РТ-101 AAA GAA SAM
РТ-103 AAA
РТ-106 GTA
РТ-108 GTA
РТ-115 TAT
РТ-116 ТТТ TTY
РТ-151 CAG
РТ-179 GTC GTT GTT Grr VCT
РТ-181 TAC TAT TAT ТАТ TGT
РТ-184 ATG GTG GTG
РТ-188 TAT
РТ-190 GGA GGC AGT GGM AGC
РТ-210 TTG
РТ-215 ACC ACT ACT АСТ ACT
РТ-219 AAA
РТ-225 CCT
Примечание. Здесь и в табл. 3 пустые ячейки обозначают полное соответствие указанного кодона последовательности дикого типа. Дикий тип - последовательность дикого типа рМЬ4-3; * - данная позиция АК была исключена из анализа.
была выявлена более чем в 60% случаев анализа этого образца панели.
В табл. 2 и 3 представлен генотипический состав рефе-ренсных последовательностей в аминокислотных позициях возможного возникновения мутаций резистентности ВИЧ к АРВП в гене протеазы и фрагмента гена обратной транс-криптазы для образцов панели А-О.
Для того чтобы оценить и сравнить результаты тестирования панели «Резистентность ВИЧ 2009», полученные участниками цикла внешнего контроля качества, использовали следующую систему присвоения баллов. Каждая позиция возможного возникновения мутации резистентности ВИЧ к АРВП для каждого образца панели была оценена сопостав-
лением нуклеотидной последовательности, предоставленной лабораторией-участником, в сравнении с референсной последовательностью. В случае правильного определения аминокислоты в заданной позиции присваивали 1 балл, в случае неправильного определения - 0. Для кодонов, в которых лабораторией-участником была выявлена смесь из двух или трех нуклеотидов, 1 балл присваивали в том случае, если правильная мутация была частью выявленной смеси.
Для оценки работы лаборатории подсчитывали количество баллов, набранных по каждому образцу панели, и сумму баллов, набранных лабораторией-участником по всем образцам панели, соотносили с максимально возможным количеством баллов по всем образцам панели.
Результаты и обсуждение. В программе «Резистентность ВИЧ 2009» принимали участие 14 лабораторий. Все лаборатории проводили тестирование панели «Резистентность ВИЧ 2009» на тест-системе Viroseq (АЬЬой Molecular, США). Результаты тестирования панели были получены от 11 (78,6%) участников, 3 участника не проводили анализ или не представили результатов тестирования.
Рассылка панелей "Резистентность ВИЧ 2009" проводилась с 05.10.09 по 19.10.09. Участвовали 14 лабораторий. Данные получены от 11 (78,6%) лабораторий. Дата подведения итогов исследования - 01.02.10.
Ни одной лабораторией не был представлен результат по отрицательному контрольному образцу Е, и, следовательно, случаев контаминации образцов нуклеиновыми кислотами идентифицировано не было.
Таблица 4
результирующие баллы определения генотипического состава образцов панели "резистентность ВиЧ 2009"
№ лаборатории А (63) В (66) С (66) D (63) Итого (262)
абс. %
1 63 66 66 63 262 100
2 64 66 66 63 261 99,6
3 63 63 66 63 261 99,6
4 63 66 66 63 260 99,2
3 63 66 64 63 260 99,2
6 63 64 64 63 238 98,3
7 64 63 64 63 238 98,3
8 63 63 66 39 233 97,3
9 63 63 0 63 193 73,6
10 0 63 39 0 104 39,7
11 0 66 0 0 66 23,2
При формировании референсных последовательностей позиции ПР-20 образца А в протеазе и РТ-179 образца Д в обратной транскриптазе были исключены из анализа в связи с наличием высокого уровня вариабельности в этих позициях (см. табл. 2 и 3).
Три лаборатории набрали ноль баллов по одному или нескольким из образцов панели А-0 в связи с тем, что не представили результатов анализа указанных образцов (см. табл. 4).
Один участник при анализе образца С набрал 39 из 66 максимально возможных баллов в связи с тем, что представленная им нуклеотидная последовательность полностью не покрывала исследуемый фрагмент и, таким образом, позволяла проводить анализ, начиная лишь с кодона 66 гена про-теазы, а также содержала в себе данные о наличии ложных смесей нуклеотидов во многих анализируемых позициях, не подтвержденные при тестировании другими участниками.
При определении генотипического состава образцов в основном ошибки были связаны с тем, что участники не идентифицировали наличие смеси нуклеотидов или идентифицировали наличие ложных смесей нуклеотидов в анализируемых позициях.
Максимальное количество баллов по всем образцам панели 262 (100%) балла набрал один участник, более 97% - 7, и менее 75% - 3 участника (см. табл. 4).
Программа «Резистентность ВИЧ 2009» является первым циклом внешнего контроля качества работы лабораторий, осуществляющих анализ резистентности ВИЧ к АРВП на территории РФ. Указанная программа была организована референс-центром по мониторингу ВИЧ и ВИЧ-ассоциированных инфекций на некоммерческой основе с целью оказания помощи лабораториям в оценке качества их работы.
Результаты программы «Резистентность ВИЧ 2009» выявили ряд проблем. У некоторых участников возникли трудности с представлением результатов анализа, которые могут быть связаны с ошибками как на этапе выделения, проведения полимеразной цепной реакции с обратной транскрипта-зой, так и на этапе секвенирования. Несмотря на то что па-
нель «Резистентность ВИЧ 2009» не содержала сложных для интерпретации образцов - штаммов, содержащих позиции с делециями и инсерциями, возникали проблемы при определении генотипического состава панельных образцов. Эти проблемы, вероятно, связаны с ошибками в ходе экспертного пересмотра данных секвенирования и редактирования полиморфных позиций. В процессе исследования был выявлен случай представления нуклеотидной последовательности, полностью не покрывающей анализируемый фрагмент. Сек-венирование неполного фрагмента не позволяет проводить анализ лекарственной устойчивости ВИЧ к части АРВП, что является серьезным недостатком.
За рубежом циклы внешнего контроля качества проводятся регулярно, начиная с 1996 г., и каждый раз выявляют различного рода проблемы. По данным программы ENVA7, полный набор данных при анализе панели на тест-cистеме Viroseq (Abbott Molecular, США), т. е. данные по гену про-теазы и обратной транскриптазы для всех образцов панели, предоставили 89% участников, тогда как в программе "Резистентность ВИЧ 2009" - 72,7% (8 из 11 участников) [7]. В программе ENVA7, как и в программе "Резистентность ВИЧ 2009", выявлялись ошибки с определением генотипи-ческого состава образцов панели, которые были связаны с редактированием полиморфных позиций. В результате программы ENVA7 30% (18 из 36) участников набрали более 99% от максимально возможного количества балов, 38,9% (14 из 36) - более 80%, но менее 99%, и 11,1% (4 из 36) - менее 80%, тогда как результаты программы "Резистентность В1Ч 2009" показали, что 43% (3 из 11) участников набрали более 99% от максимально возможного количества балов, 27,3% (3 из 11) - более 80%, но менее 99%, 27,3% (3 из 11) участников - менее 80%.
Заключение. Результаты программы "Резистентность ВИЧ 2009" выявили существующий разрыв в качестве анализа у различных лабораторий на территории РФ, что свидетельствует о необходимости повышения уровня экспертных знаний специалистов и необходимости регулярного проведения циклов внешнего контроля качества идентификации мутаций резистентности ВИЧ к АРВП на территории РФ в будущем.
ЛИТЕРАТУРА
1. Малдарелли Ф. Резистентность ВИЧ к лекарственным препаратам. Москва, 2006. - Документы Евразии.
2. Bertagnolio S., Derdelinckx L, Parker M. et al. // Antiviral Ther. -2007. - Vol. 13, № 2. - P. 49-37.
3. Descamps D., Delaugerre C., Masquelier B. et al. // J. Med. Virol. -2003. - Vol. 78, № 2. - P. 133-160.
4. Hirsch M. S., GunthardH. F., Schapiro J. M. et al. // Clin. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 47, № 2. - P. 266-283.
3. Huang D. D., Bremer J. W., Brambilla D. J. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 43, № 8. - P. 3963-3970.
6. Land S., Cunningham P., Zhou J. et al. // J. Virol. Meth. - 2009. -Vol. 139, № 2. - P. 183-193.
7. Pandit A., Mackay W. G., Steel C. et al. // J. Clin. Virol. - 2008. - Vol. 43. - P. 401-406.
8. http://www.fsvok.ru
9. http://www.iasociety.org/
Поступила 16.03.11
