CC BY
50
ВЛИЯНИЕ ЖИДКОФАЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ ТОРФА НА ЗАЖИВЛЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОЖОГОВ КОЖИ У КРЫС
Холмогорская О.В.1, кандидат биологических наук,
\ доктор биологических наук,
Ратыни А.И *2, кандидат биологических наук,
Калинников Ю.А.3, доктор технических наук,
Батурина И.Ю.4, кандидат технических наук
1 Кафедра биологии с экологией ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия Росздрава», 153012, Иваново, Ф. Энгельса, 8
2 Кафедра физики, математики и информатики ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия Росздрава»
3 Учебно-научный производственный центр «Недра» ГОУ ВПО «Ивановский государственный химикотехнологический университет», 153000, Иваново, Ф. Энгельса, 7
4 Кафедра химической технологии высокомолекулярных соединений ГОУ ВПО «Ивановский государственный химико-технологический университет»
РЕЗЮМЕ Изучено влияние различных форм, концентраций и сроков аппликации препаратов торфа на заживление ожоговых ран. Эксперимент выполнялся на 42 беспородных крысах. Ожоговая рана у опытных групп подвергалась воздействию препаратов торфа ТОМЕД НПФ “Недра” (1 или 3%-ных растворов, 1%-ной мази-гидрогеля), активным компонентом которых являлись гумусовые кислоты. Выявлено, что аппликация на ожоговую поверхность всех препаратов ускоряет эпителизацию. На основе анализа морфометрических параметров толщины и площади регенерата и эпидермиса над дефектом установлено, что растворы и гидрогели гумусовых кислот оказывают тканесохраняющий эффект и способствуют формированию более полноценного регенерата по сравнению с сухим заживлением.
Ключевые слова: регенерация, жидкая среда, гумусовые кислоты, препараты торфа, ожоговые раны.
* Ответственный за переписку (corresponding author): e-mail: [email protected]
Иванищук П.П
При разработке новых методов лечения ран и ожогов большое внимание уделяется условиям микроокружения раневой поверхности, в частности, доказана высокая эффективность методов лечения ожогов II и III степени во влажной среде [5, 6, 9, 13, 15]. В исследованиях, выполненных на кафедре биологии с экологией ИвГМА, было доказано положительное влияние 0,9%-ного раствора хлорида натрия на скорость и полноту регенерации кожи у крыс после ожогов ША степени, заключающееся в тканесохраняющем эффекте, ускорении эпители-зации, уменьшении грануляций и формировании регенерата, приближающегося по своему строению к неповреждённой коже [10, 11, 12].
В настоящем исследовании для лечения ожогов IIIA степени у крыс в качестве жидкой среды использовали жидкофазные препараты гумусовых кислот торфа, выделенных из сырья по оригинальной методике [8]. Гумусовые препараты готовили в трёх выпускных формах: в виде 1- или 3%-ных водных растворов, а также в виде гидрогеля на основе хлорида алюминия, в котором содержание гумусовых кислот составляло 1%. Препараты имеют бальнеологическое заключение, которым разрешено их практическое применение как наружного средства под общим названием «ТОМЕД».
Kholmogorskaya O.V., Ivanishchuk P.P., Ratyni A.I., Kalinnikov Yu.A., Vashurina I.Yu.
INFLUENCE OF LIQUID PHASE PEAT PREPARATIONS ON HEALING OF EXPERIMENTAL SKIN BURNS IN RATS
ABSTRACT Influence of various forms, concentrations and terms of peat preparations’ application on healing of burn wounds was studied. 42 rats were enrolled in the experiment. Burn wound in test groups was exposed to TOMED NPF “Nedra” peat preparations (1 or 3% solutions, 1% ointment-hydrogel); humic acids were their active components. It was revealed that the application of these preparations on the burn surface accelerated the epithelium restoration. Analysis of morphometric parameters of thickness and epidermis of regenerate and epidermis above the defect allowed to determine that solutions and hydrogels of humic acids exerted tissue preventive effect and was conducive to the formation of more valuable regenerate in comparison with dry healing.
Kev words: regeneration, liquid medium, humic acids, peat preparations, burn wounds.
Исследование торфяных гумусовых кислот весьма актуально, поскольку известно, что они придают жидкой среде ряд ценных при лечении поверхностных и пограничных ожогов свойств: бактерицидность, антиоксидантную активность, снижение болевого синдрома [14, 16].
Цель настоящей работы - выявление у препаратов на основе торфяных гумусовых кислот стимулирующего регенерацию эффекта, а также оценка влияния выпускных форм препаратов и сроков их аппликации на заживление ожоговых ран у крыс. Исследования поддержаны грантом РФФИ № 06-04-08048.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперимент выполняли на 42 животных - белых беспородных половозрелых крысах-самцах исходной массой 200-250 г. Содержание животных и все экспериментальные манипуляции осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минвуза от 13.11.1984 г. № 724). Ожог диаметром 1 см наносился с помощью специально разработанного устройства под эфирным наркозом в струе проходящего пара, на боковой поверхности туловища, с экспозицией 5 секунд. После этого ожоговую рану помещали в капсулу из прозрачного полимерного материала. Капсулу крепили на кожу крысы с помощью тонкой пленки, смазанной специальным жидким клеем «New-skin liquid bandage». Для предохранения капсулы от повреждения животным использовали жестяной кожух, который фиксировали на спине и боках с помощью лейкопластыря. Животные были разделены на 7 групп (по 4 особи в каждой): контрольную (К) и 6 опытных (с I по VI). Животным I-III групп в капсулу вводили по 1 мл 1%-ного раствора гумусовых кислот, IV группы -3%-ного раствора, V и VI - 1%-ной мази-гидрогеля (табл. 1). Во всех группах, кроме II, препараты вводили в капсулу непосредственно после ожога. Во II группе - через трое суток предварительного сухого заживления. Длительность аппликации препаратов в I, II, IV и V группах составила 5 суток, в III - 3 суток, в VI - 7 суток. Смена содержимого капсулы производилась один раз в сутки, перед новым заполнением раневую поверхность промывали 0,9%-ным раствором хлорида натрия. У крыс контрольной группы капсула ничем не заполнялась, и заживление раны происходило в «сухих» условиях.
По истечении срока воздействия препаратов капсулы снимали. Всех животных содержали в одинаковых условиях, отмечая время полной эпите-лизации дефекта. На 21-е сутки эксперимента, в
утренние часы, проводили эвтаназию путем передозировки эфирного наркоза. Из центральной части регенерата иссекали кусочки ткани и фиксировали их в 10%-ном нейтральном формалине, готовили парафиновые срезы и производили окраску гематоксилином и эозином, а также пик-рофуксином по Ван-Гизону. В центральной части среза определяли толщину и площадь эпидермиса над дефектом и в регенерате. Морфометрические исследования проводили на анализаторе изображений с помощью программы «ВидеоТест-Мастер» (ООО «Иста-ВидеоТесТ», Санкт-Петер-бург). Достоверность различий средних оценивали по критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Во всех опытных группах эпителизация ожоговой раны происходила быстрее, чем в контроле. Наибольшая скорость эпителизации дефектов отмечена в I опытной группе. Разница с контролем статистически достоверна (р < 0,05). Средние сроки эпителизации ожоговой поверхности в различных группах животных представлены в таблице 2.
При измерении толщины и площади эпидермиса над дефектом отмечена гипертрофия эпидермиса в зоне повреждения у животных всех групп. Наибольшая степень гипертрофии наблюдается у животных контрольной группы (табл. 2). Наименьшие значения толщины и площади эпидермиса над рубцом - у животных IV группы, различия с контролем статистически достоверны (р < 0,05); у животных I группы статистическое различие с контролем по толщине эпидермиса отсутствует. Группы II, III, V и VI по этим показателям друг от друга практически не отличаются (различие с контролем достоверно - р < 0,05, за исключением III группы). В опытных группах эпидермис формирует разрастания в дерме.
В подлежащей дерме у всех животных наблюдается замещение грануляций фиброзной тканью, что соответствует третьей фазе раневого процесса. У животных контрольной группы фиброзная ткань располагается вплоть до внутрикож-ной мышцы, что говорит о значительной глубине дефекта. Толщина и площадь регенерата в этой группе максимальны (табл. 2). У контрольных животных образуется неполноценный регенерат рубцового типа, основным компонентом которого являются бледно окрашенные коллагеновые волокна, между ними выявляются незначительные участки аморфного вещества. Архитектоника коллагеновых волокон отличается от таковой в нормальной коже, они направлены в основном параллельно поверхности регенерата. Во всех опытных группах, кроме II, формируются полно-
Таблица 1. Варианты воздействия препаратов в опытных группах животных
Показатель Группа
I II III IV V VI
Содержимое капсулы Растворы гумусовых кислот 1%-ный гидрогель
1%-ный 1%-ный 1%-ный 3%-ный
Длительность аппликации 5 суток 5 суток 3 суток 5 суток 5 суток 7 суток
Начало применения препарата Сразу после ожога Через 3 суток после ожога Сразу после ожога Сразу после ожога Сразу после ожога Сразу после ожога
Таблица 2. Параметры регенерата у крыс после воздействия на ожоговую поверхность различных препаратов торфа
Параметр Группы
Контроль Опыт
I II III IV V VI
Сроки эпителизации, сут. 18,0 + 2,1 14,5 ± 1,7* 15,8 + 0,9* 15,6 + 1,8 15,3 ±0,7* 16,0 ±2,1 16,8 ±1,7
Толщина эпидермиса, мкм 117, 44 ± 19,25 97,56 ± 15,56 86,79 ± 8,26* 84,83 ± 20,31 73,08 ±6,60* 83,21 ± 17,9* 84,92 ± 10,56*
Площадь эпидермиса, мм2 0,32 ± 0,04 0,23 ± 0,05* 0,23 ± 0,06* 0,22 ± 0,07 0,19 ± 0,09 0,22 ±0,01 0,21 ±0,04*
Толщина регенерата, мм 1,12 ± 0,25 0,85 ±0,28 1,11 ± 0,12 0,64 ±0,08* 0,71 ±0,23* 0,92 ±0,05 0,61 ±0,13*
Площадь регенерата, мм2 2,25 ± 0,41 1,49 ± 0,37* 1,81 ± 0,58 1,54 ± 0,27* 1,38 ± 0,50* 1,54 ±0,45* 1,44 ±0,27*
Примечание. *- разница с контролем статистически достоверна, р < 0,05.
ценные регенераты в отличие от контроля. Дефект неглубок - фиброзная ткань располагается поверхностно, занимая приблизительно 1/3 толщины дермы. У животных III, IV и VI групп (табл. 2) площадь и толщина регенерата достоверно меньше, чем в контроле (р < 0,05). В I группе достоверные различия с контролем наблюдаются лишь по площади регенерата, а в V - по его толщине (р < 0,05). Между коллагеновыми волокнами имеются большие промежутки. В регенератах выявляются волосяные фолликулы, сохранившие жизнеспособность под действием препаратов торфа. Таким образом, восстанавливается струк-
тура, приближающаяся к нормальной коже. У животных II опытной группы, где препарат наносился после 3 суток сухого заживления, результаты значительно отличаются от таковых других опытных группах. Наблюдается формирование глубокого и обширного дефекта, затрагивающего внутрикожную мышцу, достоверные различия с контролем по площади и толщине регенерата отсутствуют (табл. 2). В фиброзной ткани выявляются массивные разрастания грануляционной ткани с большим количеством сосудов, коллагеновые волокна располагаются плотно. Волосяные фолликулы отсутствуют.
Известно, что в эпителизации регенерата основная роль принадлежит эпидермису кожи, окружающей дефект. По краям ожоговой раны происходит мобилизация клеток неповрежденного эпидермиса, они начинают мигрировать на грануляционную ткань. Вначале мигрируют нижележащие клетки, которые затем устанавливают тесный контакт с субстратом и начинают формировать материал базальной мембраны. Одновременно клетки, лежащие сверху, вытягивают свои мембраны, «переползают» через клетки первого слоя и прикрепляются к субстрату впереди них [7]. Доказано, что влажная среда способствует эпителизации ран [6, 13, 15] за счёт облегчения миграции эпителиоцитов по раневой поверхности [11]. Аппликация на ожоговую поверхность всех использованных препаратов на основе гумусовых кислот торфа ускоряет эпителизацию. Было выяснено, что для ускорения процесса эпителизации ожоговой поверхности препараты торфа необходимо наносить сразу после ожога и время их воздействия должно составлять не менее 5 суток. Наиболее значительно облегчается миграция эпителиоцитов по раневой поверхности в водных растворах гумусовых кислот. Эпителизация несколько задерживается под действием гелей, которые имеют большую вязкость по сравнению с водными растворами.
Важной отличительной особенностью заживления ожогов в жидкой среде является уменьшение степени вторичного некроза [10] за счёт тканесохраняющего и противовоспалительного эффектов. Известно, что зона первичного некроза, возникшая в результате термического воздействия, становится источником свободных радикалов, разрушающих мембранные структуры клеток. Разрушение мембран приводит к накоплению кислых метаболитов, которые вызывают вторичную альтерацию, усугубляя некротические изменения. Таким образом, альтеративная фаза воспаления при ожогах становится пролонгированной за счет прогрессирующего некроза [4]. Ожоговые раны могут «углубляться» также за счет инфицирования [1].
Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что как растворы, так и гидрогели гумусовых кислот оказывают выраженный тканесохраняющий и противовоспалительный эффекты и в дальнейшем способствуют формированию более полноценного регенерата по сравнению с сухим заживлением. Под влиянием этих препаратов сохраняется жизнеспособность тканей, прилежащих к первичному ожоговому поврежде-
нию. За счёт антиоксидантных свойств гумусовых кислот и благодаря обезвреживанию кислых метаболитов в слабощелочной среде препаратов торфа уменьшается степень вторичной альтерации, не происходит углубления ожога. Бактерицидность препаратов предотвращает инфицирование ожоговых ран, при этом не оказывается цитотоксическое действие, замедляющее процессы регенерации, которое характерно для большинства антибиотиков [1]. Положительные эффекты изученных препаратов торфа проявляются при нанесении их непосредственно после ожога, то есть во время воспалительной фазы раневого процесса. Предварительное сухое заживление приводит к значительному углублению некроза и формированию на месте повреждения грубого рубца.
Аналогичные результаты были получены Б.А. Парамоновым с соавторами при заживлении ожогов дистальных отделов конечностей во влажной среде [5]. При осуществлении данного способа лечения через раневые поверхности (в том числе через зону «паранекроза», где клетки повреждены, но еще не потеряли окончательно своей жизнеспособности) протекало большое количество жидкости, близкой по составу к плазме крови. В результате не происходило высыхания тканей паранекротической зоны, а клетки (пораженные, но не погибшие) получали лучшее питание и частично «реанимировались», при этом у пострадавших не развивались грубые рубцовые деформации.
ВЫВОДЫ
1. Изученные препараты на основе гумусовых кислот торфа, выделенных из сырья по оригинальной методике, ускоряют процесс эпителизации ожоговой поверхности по сравнению с “сухим” заживлением.
2. Исследованные водные растворы гумусовых кислот торфа и гели на их основе оказывают тканесохраняющий и противовоспалительный эффекты, препятствуя углублению некроза, и способствуют формированию регенерата, приближающегося по своему строению к нормальной коже.
3. Положительные эффекты препаратов торфа проявляются при их нанесении сразу после ожога, в первую фазу раневого процесса -фазу воспаления. Предварительное «сухое» заживление приводит к углублению некроза и формированию регенерата рубцового типа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеев А. А, Бобровников А. Э., Терехова Р. П., Крутиков М. Г. Микробиологическая оценка эффективности антимикробных препаратов для местного лечения ожоговых ран // Комбустиология. - 2009. -№ 37.
2. Иванищук П. П., Ковалев А. В. Влияние жидкой среды на полноту восстановления кожи у крыс // Мор-
3. Иванищук П. П., Ковалев А. В. Заживление экспериментальных ран кожи у крыс в условиях постоянного воздействия физиологического раствора : рукопись деп. в ВИНИТИ 22.10.90 № 5436-В90. - 1990. - 8 с.
4. Каем Р. И. Ожоги // Воспаление : рук-во для врачей. -М. : Медицина, 1995. - С. 457-468.
5. Лечение ожогов дистальных отделов конечностей во влажной среде серебросодержащими препаратами / Б. А. Парамонов [и др.] // Комбустиология. -2000. - № 2.
6. Мензул В. А., Брейтман Р. Ш. Новые технологии и средства для лечения ожоговых ран у детей // Материалы научной конференции «Актуальные проблемы травматологии и ортопедии». Часть 2. Термическая травма. - Нижний Новгород, 2001. - С. 174-175.
7. МяделецО. Д., Адаскевич В. П. Функциональная морфология и общая патология кожи. - Витебск: Изд-во Витебского медицинского института, 1997. -269 с.
8. Пат. 2310633 РФ МПК С 05Р11/02 Способ получения жидких торфяных гуматов.
9. Простой, эффективный и экономичный метод лечения обожжённых / Н. Н. Озяков [и др.] // Материалы научной конференции «Актуальные проблемы травматологии и ортопедии». Часть 2. Термическая травма. - Нижний Новгород, 2001. - С. 177-178.
10. Холмогорская О. В., Иванищук П. П. Морфологические особенности заживления ожогов у крыс в 0,9% растворе хлорида натрия // Актуальные проблемы медицинской биологии : сб. науч. работ, посвящённый 65-летию открытия кафедры биологии в Сибирском медицинском университете. - Томск, 2002. - С. 36-39.
11. Холмогорская О. В., Иванищук П. П. Морфологические особенности эпителизации термических повреждений кожи у крыс при заживлении в 0,9% растворе хлорида натрия // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии. -Вып. 2 : сб. науч. тр. - Томск, 2002. - С. 184-185.
12. Холмогорская О. В., Иванищук П. П., Суракова Т. В. Изменение синтетической активности эпителиоци-тов кожи у крыс в процессе заживления ожоговых ран под струпом и в жидкой среде // Цитология. -2005. - Т. 47, № 5. - С. 388-392.
13. Burn wounds: infection and healing / D. J. Smith [et al.] //Am. J. Surg. - 1994. - Vol. 167, № 1A. - P. 46-48.
14. Development and disappearance oftoleranceto induction of interferon and tumor necrosis factor response in athletes treated with natural immunostimulant / A. D. lnglot[etal.]//Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). -1999. - Vol. 47 (4). - P. 237-244.
15. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment / K. Breuing [et al.] // J. Surg. Res. -1992. - Vol. 52, № 1. - P. 50-58.
16. Pempkowiak Janusz. Special and anti-bacterial properties of fulvic acids isolated from peat. PEAT 90-Versatile Peat: Int. Conf. Peat Prod. And Use // Jyvaskyla. - 1990. - Vol. 1. - P. 341.
Поступила 18.10.2009 г.
