CC BY
39
УДК 616-001.17.616.1.577.4
Н.П. Бгатова, А.М. Паничев, В.П. Кокшарова, С.Н. Силкин, О.И. Долгова, А.Н. Гульков, В.С. Садыкова
СТРУКТУРА ЭНДОТЕЛИОЦИТОВ ЛИМФАТИЧЕСКИХ КАПИЛЛЯРОВ КОЖИ В УСЛОВИЯХ КОРРЕКЦИИ РАНЕВОГО ПРОЦЕССА ПРИ ТЕРМИЧЕСКОМ ОЖОГЕ
ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск Тихоокеанский институт географии ДВО РАН, Владивосток Главный госпиталь Тихоокеанского флота РФ, Владивосток Дальневосточный государственный университет, Владивосток
Термический ожог кожи ША степени моделировали на крысах линии Вистар. Использовали средства, стимулирующие и подавляющие лимфатический дренаж в ожоговой ране. Было показано, что использование аппликаций контейнеров с природным сорбентом цеолитом для коррекции лимфатического дренажа ожоговой раны оказывает протективное действие на структурную организацию эндотелиоцитов лимфатических капилляров кожи, обусловливая большую эффективность дренажной функции лимфатической системы органа, удаление токсичных метаболитов, создавая благоприятные условия микроокружения и ускоряя развитие всех фаз раневого процесса.
Ключевые слова: термический эндотелиоцитов
Эффективность лимфатического дренажа является определяющим условием оптимального функционирования компонентов тканевого микрорайона органа [1]. В условиях ожоговой травмы возрастает функциональная нагрузка на лимфатическую систему кожи [2]. Актуальным является поиск и использование препаратов, оказывающих протективное, стимулирующее действие на лимфатический дренаж ожоговой раны и, следовательно, эффективность развития процессов воспаления и регенерации органа.
В статье приведены результаты изучения структурной организации эндотелиоцитов лимфатических капилляров кожи при коррекции лимфатического дренажа ожоговой раны.
Методика. В эксперименте использовали 120 крыс-самцов линии Вистар питомника «Рассвет» г. Томска. Работу с животными проводили в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных. Под эфирным наркозом крысам выбривали участок кожи в поясничной области и наносили ожог диаметром 2 см с помощью специально разработанного устройства, путем подачи водяного пара в течение 5 сек.
Животные были разделены на 4 группы. Первая группа — интактные животные, не подвергавшиеся термическому ожогу. Вторая группа
ожог, кожа, лимфатические капилляры, ультраструктура
— животные со спонтанным развитием раневого процесса. Третья группа — животные, которым в качестве корректора лимфатического дренажа ожоговой раны в течение 7 дней после ожога накладывали на раневую поверхность контейнеры с природным минеральным сорбентом — цеолитом. Смену контейнеров производили ежедневно. Нами был применен контейнер из полупроницаемой целлофановой оболочки (с диаметром пор не менее 10 нм), который заполняли тонко измельченной цеолитсодержащей горной породой (фракция помола 0,01 мм). В качестве сырья использовали цеолитизированный вулканический туф Милоградовского месторождения (Приморский край). Четвертая группа — животные, которым моделировали ситуацию подавления, супрессии лимфатического дренажа ожоговой раны. С этой целью на ожоговую поверхность ежедневно наносили мазь «Олазоль». «Олазоль» использовали в качестве альтернативы цеолитам, так как известно, что мази на жировой основе не способны сорбировать раневое отделяемое и создают «парниковый эффект» [3].
Животных декапитировали под эфирным наркозом через 1, 3, 7, 15, 30 и 42 суток после нанесения ожога. В качестве объектов для свето-оптического и электронно-микроскопического исследования использовали образцы кожи из ра-
невой поверхности, которые исследовали с помощью светового и электронного микроскопов.
Для изучения в просвечивающем режиме электронного микроскопа образцы органов фиксировали в 1% растворе ОsО4 на фосфатном буфере (рН=7,4), дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в эпон. Из полученных блоков готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм, окрашивали толуидиновым голубым, изучали под световым микроскопом и выбирали необходимые участки тканей для исследования в электронном микроскопе. Из отобранного материала получали ультратонкие срезы толщиной 35-45 нм на ультратоме LKB-8800, контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата, цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе ^М 1010.
Результаты. Морфологическое исследование ожоговой раны при спонтанном развитии раневого процесса через 1 сутки после ожога выявило образовавшийся коагуляционный некроз эпидермиса и дермы. Коллагеновые волокна были склеены в грубые плотные тяжи. Структура волосяных фолликулов была нарушена. Через 3 суток после ожога образовывался плотный ожоговый струп, отмечали отек гиподермы, изменение ориентации коллагеновых волокон, наличие воспалительной инфильтрации, стаз эритроцитов в кровеносных капиллярах. Морфологические изменения наблюдали не только в глубоких слоях кожи, но и
в мышечных волокнах, не подвергавшихся гипертермии при моделировании ожога. Эти изменения выражались в нарушении структуры миофибрил, возрастании размеров пространств между волокнами поперечно-полосатой скелетной мышечной ткани.
При исследовании структуры лимфатических капилляров кожи было отмечено, что в условиях нормы они имели узкие просветы, эндотелиоци-ты содержали небольшое количество органоидов и мелких микропиноцитозных везикул, которые определялись как базальные, люминальные и ци-топлазматические (таблица 1, рис. 1а). Выявляли контакты эндотелиоцитов типа интердигитаций, наложений и «конец в конец».
При термическом ожоге кожи лимфатические капилляры образовывали петли, их просветы были значительно расширены (рис. 1б). В цитоплазме клеток отмечали структурные изменения, свидетельствующие о снижении энергетической, синтетической и транспортной функций эндотелиоцитов. Происходило набухание органоидов. При морфометрическом анализе эндотелиоцитов лимфатических капилляров ожоговой раны через 7 суток после ожога кожи было выявлено, что концентрация крист митохондрий уменьшилась на 40%. Численные плотности прикрепленных рибосом снизились на 36%. Меньшими стали объемные плотности люминальных микропиноцитоз-ных везикул на 44%, базальных — на 46% и цитоп-
Таблица 1
Результаты морфометрического анализа эндотелиоцитов лимфатических капилляров кожи через 7 суток после термического ожога органа (M±m)
Исследованные параметры Контроль Спонтанное заживление ожоговой раны Применение контейнеров с цеолитом Использование мази «Олазоль»
Митохондрии ^у) 7,6±0,42 8,2±0,16 8,0±0,29 7,9±0,31
Митохондрии Sv внутр. мембрана / Sv наружн. мембрана 3,3±0,06 2,0±0,04* 2,6±0,02* 1,8±0,06*
Митохондрии ^А) 3,2±0,15 3,0±0,18 3,5±0,64 3,1±0,72
Гранулярный эндоплазматический ретикулум ^у) 10,2±0,14 12,8±0,29 12,1±0,15 13,4±0,09*
Рибосомы прикрепленные ^А) 22,5±2,15 14,3±2,41* 15,8±2,54* 11,7±2,86*
Рибосомы свободные полисомальные ^А) 18,1±2,24 13,6±2,18 16,4±2,19 10,5±2,03*
Лизосомы ^у) 1,3±0,08 2,5±0,13 2,4±0,47 6,8±1,35*
Лизосомы ^А) 2,0±0,11 2,2±0,05 2,4±0,08 5,2±1,12*
Люминальные МПВ ^у) 27,6±1,22 18,3±1,16* 20,1±1,45* 8,2±1,36*
Цитоплазматические МПВ ^у) 31,5±2,16 20,2±2,28* 22,4±2,42* 12,5±2,18*
Базальные МПВ ^у) 23,8±2,12 14,5±2,34* 17,2±3,17 10,4±3,55*
Примечание: Уь — объемная плотность структур (% от объема цитоплазмы); ЫА — численная плотность структур (количество в тестовой площади); МПВ — микропиноцитозные везикулы, * — обозначены величины, достоверно отличающиеся от соответствующих показателей интактных крыс контрольной группы.
лазматических — на 49% (таблица 1). Появились межэндотелиальные контакты открытого типа. Электронная плотность интерстиция была меньшей, чем плотность просветов лимфатических капилляров, что, по-видимому, являлось отражением отека тканей и нарушения оттока лимфы.
Недостаточность лимфообращения при ожоговой травме кожи является известным фактом [2]. В условиях глубокого ожога лимфатические сосуды не в состоянии дренировать и отводить из тканей региона жидкость, белки и клеточные элементы, появляющиеся при воспалении за счет увеличения проницаемости кровеносных капилляров и повреждения тканей [6]. Это объясняется закупоркой просвета сосудов, тромбозом, спазмом, блокадой синусов лимфатических узлов и
крупных лимфатических коллекторов.
Одним из возможных способов коррекции лимфатического дренажа при термическом ожоге кожи является использование сорбционных технологий. Показано, что нанесенный на поверхность ожоговой раны сорбент, принимая на себя часть жидкости и токсинов, способствует созданию оптимальной дренажной функции в регионе, своевременному «разблокированию» регионарного лимфатического узла и морфо-функцио-нальной компенсации лимфатического русла [2].
Для коррекции лимфатического дренажа кожи при ожоговой травме нами были применены аппликации на ожоговую рану природного минерального комплекса с сорбционными и ионообменными свойствами — цеолита.
Рис. 1. Ультраструктурная организация эндотелиоцитов лимфатических капилляров кожи
Увеличение х8000 А — лимфатический капилляр кожи интактного животного; Б — эндотелиоцит лимфатического капилляра кожи через 3-е суток после термического ожога при спонтанном заживлении ожоговой раны; В — лимфатический капилляр кожи при применении контейнеров с цеолитом после термического ожога органа; Г — лимфатический капилляр кожи при использовании мази «Олазоль» после термического ожога органа
Нами было выявлено, что в структуре эндо-телиоцитов лимфатических капилляров ожоговой раны животных, которым делали аппликации с использованием цеолитовых контейнеров, несмотря на некоторый отек клеток, отмечали большую сохранность цитоплазматических органоидов и микропиноцитозных везикул, ультраструктурная организация клеток претерпевала меньшие дистрофические изменения (рис. 1в). Объемная плотность люминальных микропино-цитозных везикул снизилась на 27%, цитоплазматических — на 27%, а базальных — достоверно не отличалась от показателя в контроле (таблица 1). Концентрация крист митохондрий была снижена на 21%. Это снижение было на 30% меньшим, чем значение соответствующего параметра у животных со спонтанным заживлением ожоговой раны. Уменьшение численной плотности прикреплен-
ных рибосом составило 30%. Использование аппликаций цеолитовых контейнеров оказывало протективное действие на структуру эндоте-лиоцитов лимфатических капилляров, способствуя меньшему повреждению и поддержанию их структурной целостности.
При моделировании ситуации нарушения лимфатического дренажа кожи при термическом ожоге путем использования аппликаций мази на жировой основе «Олазоль» были выявлены наибольшие ультраструктурные изменения эндоте-лиоцитов лимфатических капилляров. Наблюдали истончение эндотелия, нарушение целостности мембран, наличие контактов открытого типа между эндотелиальными клетками. Эндотелиоциты были отечны, образовывали спирально закрученные структуры. Просветы лимфатических капилляров были заполнены электронно-плотным
Рис. 2. Ультраструктура макрофагов (а, б) и фибробластов (в, г) кожи при использовании контейнеров с цеолитом (а, в) и мази «Олазоль» (б, г) в качестве корректоров раневого процесса
Увеличение х6000
содержимым (рис. 1г, таблица 1). Плотность ин-терстиция была значительно снижена, перивас-кулярные пространства расширены.
Было выявлено уменьшение концентрации крист митохондрий на 45%. Следствием набухания клеток явилось возрастание объемной плотности мембран гранулярной эндоплазматической сети на 31%. Цистерны гранулярной эндоплазма-тической сети были значительно расширены и содержали небольшое количество прикрепленных рибосом. Снижение численных плотностей прикрепленных и свободных полисомальных рибосом составило 48 и 42% соответственно (таблица 1). В эндотелиоцитах животных этой группы значительно возросли величины объемной и численной плотностей вторичных лизосом, превосходящие уровень в контроле в 5 и 2 раза соответственно (таблица 1, рис. 1г). Объемная плотность люминальных микропиноцитозных везикул снизилась на 70%, а цитоплазматических и базальных — на 60% (таблица 1).
В условиях моделирования нарушения лимфатического дренажа ожоговой раны использованием мази на жировой основе, вероятно, происходит избыточное накопление токсинов, возрастает функциональная нагрузка на лимфатические капилляры, приводящая к нарушению структурной целостности эндотелиоцитов, снижению эвакуа-торной способности лимфатического русла и затруднению оттока интерстициальной жидкости.
Состояние интерстиция является определяющим для создания микроокружения, оптимального для функционирования клеток тканевого региона [1].
Нами были выявлены различия в ультраструктурной организации клеток эффекторов воспаления — макрофагов и клеток, являющихся основными клеточными элементами, участвующими в восстановлении ожоговой травмы, — фиброблас-тов в зависимости от воздействия на лимфатический дренаж ожоговой раны.
В условиях подавления, супрессии лимфатического дренажа кожи при ожоге путем использования мази на жировой основе в структуре макрофагов отмечали значительное накопление лизосомальных структур (рис. 2а, б), что, вероятно, было связано с незавершенностью фагоцитоза, отмечаемой при ожоговой травме [4]. Структура фибробластов в данном случае отличалась значительно расширенными цистернами гранулярного эндоплазматического ретикулума, снижением содержания прикрепленных, и особенно свободных полисомальных рибосом, набуханием митохондрий и снижением содержания в них крист (рис. 2 в, г). Все наблюдаемые структурные изменения макрофагов и фибробластов косвенно
свидетельствуют о снижении их функциональной активности.
Кроме того, было показано, что снижение интенсивности воспалительного процесса и развитие грануляционной ткани у животных со спонтанным заживлением ожоговой раны и при моделировании нарушения лимфатического дренажа ожоговой раны развивалось на 15-20-е сутки после ожога. Полная эпителизация раневой поверхности наступала к 42-м суткам эксперимента.
В условиях коррекции лимфатического дренажа ожоговой раны в виде аппликаций на ожоговую поверхность цеолитовых контейнеров через 3 суток после ожога при наличии некроза эпидермиса и дермы не отмечали дистрофических изменений в мышечных волокнах. В гиподерме наблюдали юные и зрелые формы фибробластов с признаками активации цитоплазмы, а в интер-стиции возросло содержание коллагеновых волокон. Активное развитие грануляционной ткани у животных этой группы отмечали на 7-е сутки эксперимента. Полная эпителизация раневой поверхности наступала к 30-м суткам после ожога.
В дополнение к сказанному следует отметить, что, исходя из данных литературы, эндотелио-циты микрососудов кожи являются ключевыми элементами для привлечения клеток-эффекторов воспаления. В условиях патологии они способны к высвобождению и продукции провоспалитель-ных цитокинов, которые необходимы для активации и миграции лейкоцитов в очаг воспаления [5]. По-видимому, ускорение развития раневого процесса при использовании аппликаций на ожоговую рану контейнеров с цеолитом связано с сохранением структурно-функциональной целостности эндотелиоцитов лимфатических капилляров.
Следовательно, применение технологий, оказывающих протективное действие на структурную целостность эндотелиоцитов лимфатических капилляров и лимфатический дренаж ожоговой раны, способствует ускорению восстановления поврежденных тканей.
Заключение
Использование аппликаций контейнеров с природным сорбентом цеолитом для коррекции лимфатического дренажа ожоговой раны оказывает протективное действие на структурную организацию эндотелиоцитов лимфатических капилляров кожи, обусловливая большую эффективность дренажной функции лимфатической системы органа, удаление токсичных метаболитов, создавая благоприятные условия микроокружения и ускоряя развитие всех фаз раневого процесса.
Structure of the lympfatic endotelium at skin injury correction of burn trauma
N.P. Bgatova, A.M. Panichev, V.P. Koksharova, S.N. Silkin, O.I.Dolgova, A.N Gulkov, V.S. Sadykova
The thermal third A-degree burn injury was used on rats. Stimulation and suppression of lymphatic drainage was investigated. Application of natural mineral zeolite on burn wound gave protection effect on structural organization skin lymphatic endothelium,causing great stimulation of skin lymphatic drainage. This results show that use of zeolite application on skin thermal injury led to absorbtion of toxic metabolites and promoted structural basis for increased processes of inflammation and regeneration of the burn wound.
Литература
1. Общая анатомия лимфатической системы / Ю.И. Бородин, М.Р. Сапин, Л.Е. Этиген и др. — Новосибирск, 1990. — 243 с.
2. Сорбционно-апликационные и лимфотроп-
ные методы в комплексном лечении ожогов / Ю.И. Бородин, М.С. Любарский, А.Ю. Летягин и др. — Новосибирск. 1995. — 143 с.
3. Спиридонова Т.Г. Патогенетические аспекты лечения ожоговых ран / Т.Г. Спиридонова // РМЖ, Хирургия, 2002. — Т. 10. — № 8-9. — С. 88-92.
4. Effects of taurine on polymorphonuclear phagocytosis activity in burned patients / M. Farri-
01, Y. Venereo, J. Rossello et al. // Amino Acids, 2002. — Vol. 23. — № 4. — P. 441-445.
5. Ultraviolet light and interleukin-10 modulate expression of cytokines by transformed human dermal microvascular endothelial cells / T. Scholsen, M. Hartmeyer, M. Fastrich et al. // J. Invest Derma-tol.,1998. — Vol. 111. — № 1. — P. 50-56.
6. The zinc finger protein A20 protects endothelial cells from burns serum injury / C.H. Zhu, D.J. Ying, J.H. Mi et al. // Burns, 2004. — Vol. 30. — №
2. — P. 127-133.
