CC BY
87
УДК 577.152.17:547.414.2:577.27:616.2-002
ВЛИЯНИЕ 3-НИТРОТИРОЗИНА НА ФОРМИРОВАНИЕ СУБПОПУЛЯЦИИ Т-РЕГУЛЯТОРНЫХ КЛЕТОК ПРИ ВОСПАЛЕНИИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ
Аллергическое воспаление дыхательных путей представляет собой каскад процессов с участием многих клеток и медиаторов и является сложным по регуляции. Важное место среди медиаторов занимает NO и его метаболиты. В результате действия активных форм NO развивается либо окислительный стресс, либо нитрозилирующий стресс с образованием нитритов, нитро-зоаминов, 3-нитротирозина (3-НТ). В регуляции иммунного ответа и развитии аллергических реакций ключевую роль играют Т-регуляторные клетки, которые в условиях нитрозилирующего стресса созревают в присутствии высоких концентраций 3-нитротирозина. Цель исследования: установить влияние 3-нитротирозина на формирование иммунного ответа с участием Т-регуляторных клеток при аллергическом воспалении. В исследовании принимали участие больные легкой персистирующей и тяжелой астмой. Культивирование мононуклеаров проводили в присутствии 3-НТ и без него. Анализ субпопуляций T-reg клеток осуществляли методом проточной цитофлюориметрии. У пациентов с астмой количество регуляторных Т-клеток с фенотипом CD4+CD25+ достоверно ниже, чем у здоровых доноров. Количество CD4+/CD25+high при тяжелой астме составило в 1,5 раза больше, чем при легкой астме и у здоровых доноров. Высокая концентрация 3-НТ при тяжелой астме приводит к увеличению популяции регуляторных клеток с фенотипом CD4+FOXPз+ и снижение количества CD4+CD25+ Treg.
Ключевые слова: бронхиальная астма, дендритные клетки, 3-нитротирозин.
По современным представлениям воспаление дыхательных путей является основным морфологическим признаком бронхиальной астмы, определяющим ее клинико-функциональные проявления. Воспаление в бронхиальной стенке сопровождается интенсивным образованием токсических метаболитов NO и формированием нитрози-лирующего стресса. В предыдущих исследованиях нами установлено, что накопление 3-нитротирозина (3-НТ)в дыхательных путях при тяжелой астме ассоциировано с формированием особого морфологического паттерна воспаления, признаками которого является снижение плотности эозинофилов, снижение объемной плотности реснитчатых эпителиоцитов и увеличение плотности нейтрофилов [1].
В регуляции иммунного ответа и развитии аллергических реакций ключевую роль играют Т-регуляторные клетки (T-reg) [2]. Субпопуляция T-регуляторных клеток фенотипически и функционально является гетерогенной, что дает основания полагать, что морфологический паттерн воспаления связан с определенным типом T-регуляторных клеток. Созревание и дифференцировка субпопуляций T-регуляторных клеток происходит непосредственно в ткани. В условиях нитрозилирующего стресса Т-регуляторные клетки созревают в присутствии высоких концентраций 3-нитротирозина, который, возможно, влияет на реализацию супрессорного действия Т-регуляторных клеток на Th1 и Th2 лимфоциты либо путем прямой цитотоксичности, либо через формирование в очаге воспаления определенного цитокинового профиля.
Таким образом, важно установить влияние токсических метаболитов оксида азота, таких как 3-нитротирозин, на формирование фенотипа иммунного ответа при бронхиальной астме.
Материалы и методы. В исследовании участвовали больные легкой перси-стирующей (n=15) и тяжелой (n=15) бронхиальной астмой (мужчины и женщины, средний возраст 35,12±1,61 лет). Группу контроля составили практически здоровые доноры (средний возраст 34,25±2,33 лет). Диагноз и тяжесть заболевания определяли в соответствии с рекомендациями международного согласительного документа GINA.
Л.М. ОГОРОДОВА И.В. ПЕТРОВА К.Ю. РУКИН
Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
e-mail: [email protected]
Культивирование мононуклеаров проводили в присутствии 3-НТ и без него: на
2.5 мл раствора Фиколла наслаивали 5 мл цельной гепаринизированной крови, центрифугировали 7 мин при 3000 об/мин, собирали интерфазу в чистую пробирку, отмывали: 5-10 мл среды RPMI. Затем центрифугировали 7 мин при 3000 об/мин. Супернатант сливали, осадок тщательно ресуспендировали. Доводили объем клеточной суспензии до 1 мл средой RPMI (10% FCS/RPMI). Рабочая концентрация клеток составляла 2х10б/мл. Помещали клетки в рабочие лунки планшета, добавляли 3-НТ в концентрации 10 нг/мл, инкубировали при 37оС 72 часа. Часть клеток инкубировали без добавления 3-НТ. После инкубации собирали содержимое лунок и переносили в центрифужные пробирки. Центрифугировали 7 мин при 1000 об/мин, сливали надосадок, клетки ресуспедировали в 1 мл раствора (PBS+ЭДТА+азид Na+АВ) и переносили в ци-тометрические прбирки. Добавляли соответствующие поверхностные АТ (анти-CD25, анти-CD4) и инкубировали в темноте при комнатной температуре 15 мин. Затем клетки отмывали теплым раствором (PBS+ЭДТА+азид №), хорошо ресуспендировали и заливали 1% параформальдегидом, инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте, затем заливали 3 мл раствора (PBS+ЭДТА+азид №) и оставляли клетки на ночь в холодильнике. Затем клетки осаждали и заливали 1 мл 0,2% раствора Твин-20. Инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте. После этого отмывали (PBS+ЭДТА+азид №). Проводили инкубацию с внутриклеточными антителами (анти-FOXP3) при комнатной температуре в темноте в течение 20 мин, после чего клетки отмывали в 3 мл раствора (PBS+ЭДТА+азид №). Надосадок сливали и заливали клетки 0,5 мл фиксирующего раствора.
Анализ субпопуляций T-reg клеток (CD4+CD25+, CD4+CD25+(high), CD4+FOXP3+) осуществляли методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител на проточном цитофлуориметре BD FACS Calibur (США) в соответствии с протоколом. Статистический анализ данных проводили с использованием параметрических и непараметрических критериев, методов дискриминантного и лог-регрессионного анализа.
Результаты.Т-клетки модулируют иммунный ответ, способствуют развитию клеточного (Th1) и гуморального (Th2) иммунитета, также они могут подавлять иммунный ответ. Присутствующая естественная популяция CD4+CD25+ Т-клеток (T-reg) генерируется в тимусе, кроме того, на периферии может происходить индуцированная продукция CD4+ из нерегуляторных Т-клеток. T-reg не препятствуют клеточной активации, но супрессируют текущий иммунный ответ и предотвращают развитие хронической иммунопатологии. В настоящий момент выделяют три основные субпопуляции регуляторных клеток: CD4+CD25+(high)-Т-лимфоциты, или натуральные регуляторные клетки (Tnr), а также ^3 и Тг1, или индуцибельные регуляторные клетки (Tir).
В результате анализа субпопуляции Т-регуляторных клеток, полученных в отсутствии 3-НТ, установлено, что у пациентов с астмой количество регуляторных Т-клеток с фенотипом CD4+CD25+ было достоверно ниже, чем у здоровых доноров (31,0б±2,1% при легкой БА и 35,05±1,7% при тяжелой БА против 41,81±3,9% в группе контроля, р<0,05) (табл. 1). Т-регуляторные клетки выполняют протективную функцию при иммунопатологии, а их способность регулировать Th1 и Th2 ответ ослабляет проявление воспалительных реакций.
Количество CD4+/CD25+high при тяжелой астме составило 2,б4±0,52%, что в
1.5 раза больше, чем при легкой астме и у здоровых доноров (р<0,05) (табл. 1).
Характер воспаления у больных тяжелой БА, в отличие от пациентов, страдающих легкой формой заболевания, приобретает многие черты, присущие хронической обструктивной болезни легких, включая высокое содержание нейтрофилов в периб-ронхиальном инфильтрате, признаки оксидативного и нитрозилирующего стресса и резистентность к терапии кортикостероидами. Некоторые авторы связывают изменения в картине воспаления как раз с накоплением субпопуляций клеток, имеющих фенотип cD4+CD25+(high) и ^^-клеток [3]. Регуляторная функция CD4+CD25+(high)-^ клеток осуществляется посредством оказания цитотоксического эффекта на клетку-мишень при помощи перфорина, гранзима А и CD18 без участия Fas (CD95) [4, 5]. Мишенями цитотоксичности могут быть рядом расположенные CD4+-, CD8+-Т-клетки, моноциты, дендритные клетки (ДК), антигенпрезентирующие В-клетки. Еще один ме-
ханизм супрессии периферических Т-клеток, используемый Тпг - связывание молекул В7 (костимулирующие молекулы CD8o, CD86) на клетках-мишенях, через которые идет негативный сигнал. Клетки-мишени с низким уровнем экспрессии В7 устойчивы к супрессорным влияниям CD4+CD25+(high) лимфоцитов [6].
Таблица 1
Фенотип ^регуляторных клеток у пациентов с различной тяжестью бронхиальной астмы
Формы БА CD4+CD25+, % CD4+CD25+high, % CD4+FoxP3+,%
Легкая персистирую-щая 3l,06±2,l P<o,05 l,36±o,34 7,09±l,l
Тяжелая 35,05±l,7 P<o,05 2,64±0,52 P<o,05 Pl<0,05 9,9l±l,4 P<o,05 Pl<0,05
Группа контроля 4l,8l±3,9 l,56±0,2l 8,l3±o,9
р<0,05 по сравнению с группой контроля;
р1<0,05 по сравнению с легкой БА.
Одним из маркеров развития и функционирования T-reg является молекула FoxP3 (Fork-head Box Protein 3), входящая в состав семейства белковых транскрипционных факторов (forkhead transcription factor). Foxp3 является важнейшим маркером дифференциации и развития CD4+CD25+ Treg. Мутации в гене FoxP3 вызывают сцепленный с Х-хромосомой синдром (IPEX), включающий иммунодисрегуляцию. У пациентов с IPEX повышена частота встречаемости аутоиммунных и воспалительных заболеваний [6]. Генетический дефицит Foxp3 у мышей сопровождается чрезвычайно низким уровнем тимических и периферических T-reg в сочетании с высоким риском развития аутоиммунных заболеваний, а разрушение эквивалента FoxP3 у мышей приводит к развитию аутоиммунных заболеваний и бесконтрольной лимфоидной пролиферации [Fehervari Z., Sakaguchi S. CD4(+) Tregs and immune control [7]. Установлено, что FoxP3 оказывает негативный эффект на активацию Т-клеток, вероятно, вследствие угнетения действия цитокинов, в частности, IL-2 [8, 9].
Экспрессия FoxP3 Т-регуляторными клетками при тяжелой астме достоверно выше, чем при легкой астме и в группе контроля (9,91±1,4% против 7,09±1,1% и 8,13±0,9% соответственно, р<0,05) (табл. 1). Увеличение количества T-reg клеток и повышение экспрессии FoxP3 у пациентов с тяжелой БА может быть связано с адаптивным механизмом в ответ на хроническое аллергическое воспаление. Достоверных различий по экспрессии Foxp3 в Treg у больных легкой астмой и у здоровых доноров обнаружено не было.
В таблице 2 представлены результаты изучения влияния токсического метаболита оксида азота 3-нитротирозина на состав субпопуляции регуляторных клеток.
Таблица 2
Влияние 3-нитротирозина на состав субпопуляции T-регуляторных клеток у пациентов с бронхиальной астмой
Формы БА з- НТ,нг/м л Фенотип Т-регуляторных клеток
CD4+CD25+, % CD4+CD25+high, % CD4+FoxPз+,%
Легкая l0 o,96±o,25 P<0,05 4,47±і,з5 P<0,0l 0,89±0,зі P<0,05
Тяжелая l0 0,87±0,40 P<o,05 із,58±5,іі P<o,05 Pl<0,05 9,72±з,22 р<0,05 Pl<0,05
Группа контроля l0 4,25±l,2l 9,86±2,0з з,7з±і,65
р<0,05 по сравнению с группой контроля;
Pl<0,05 по сравнению с легкой БА.
При культивировании мононуклеаров (МН) больных легкой персистирующей бронхиальной астмой с 3-НТ в концентрации 10 нг/мл, количество CD4+CD25+(high)-Т-лимфоцитов составило 4,47±1,35%, что достоверно ниже, чем при тяжелой астме и в группе контроля (13,58±5,11% и 9,86±2,03% соответственно, р<0,01). Число CD4+CD25+ и CD4+CD25+FoxP3+ Т-клеток составило 0,9б%±0,25% и 0,89±0,31% соответственно, что также достоверно ниже, чем у здоровых доноров (4,25%±1,21% и 3,73%±1,65%, соответственно, р<0,01).
При культивировании МН больных тяжелой астмой с 3-НТ в концентрации 10 нг/мл количество CD4+CD25+(high) и CD4+CD25+FoxP3+ регуляторных Т-лимфоцитов было достоверно выше, чем при легкой астме и в группе контроля (табл. 2). В тоже время при тяжелой астме наблюдалась тенденция к снижению количества CD4+CD25+ T-reg: 0,87±0,40% против 0,9б±0,25% при легкой астме, однако
различие было недостоверным. Наибольшее количество Т-регуляторных клеток с фенотипом CD4+CD25+ отмечено в группе контроля.
Высокая концентрация 3-НТ при тяжелой астме приводит к увеличению популяции регуляторных клеток, экспрессирующих FoxP3. С одной стороны клетки с фенотипом CD4+CD25+FoxP3 обладают супрессорной активностью в отношении эффектор-ных клеток и оказывают ингибирующий эффект на иммунные процессы, с другой являются важным фактором для стимуляции Т-регуляторных клеток. Кроме того, эти клетки выделяют TG^3, который является медиатором ремоделирования бронхов и своеобразным «панстимулятором» синтеза других факторов роста, концентрация которых повышена при ремоделировании тканей стенки бронхов. Факторы роста фиб-робластов, хондроцитов, остеобластов стимулируют избыточную пролиферацию соединительной ткани. Это соответствует морфологической картине воспаления при тяжелой астме, характеризующейся значительным утолщением базальной пластинки, высоким объемом соединительной и снижением доли железистой ткани.
В то же время, при тяжелой астме на фоне высокой концентрации 3-НТ наблюдается снижение количества CD4+CD25+ Treg, продуцирующих большое количество ИЛ-10 и обладающих супрессорной активностью. В патогенезе аллергических заболеваний ИЛ-10 представляет особый интерес. ИЛ-10 описан как ингибитор активности ТЬ1, он способствует развитию гуморальной составляющей иммунного ответа, обусловливая аллергическую реактивность организма, подавляет развитие гиперчувствительности замедленного типа. ИЛ-10 подавляет продукцию провоспалительных цито-кинов, продуцируемых Th1 и Th2 активированными клетками. Он также подавляет экспрессию молекул МНС II класса, препятствует активации тучных клеток и эозино-филов, супрессирует функциональную активность макрофагов. Таким образом, действие ИЛ-10 направлено на подавление воспаления. Соответственно, уменьшение при тяжелой бронхиальной астме количества клеток, продуцирующих этот цитокин, приводит к персистенции воспаления и терапевтической резистентности.
Полученные результаты свидетельствуют о влиянии 3-НТ на формирование субпопуляции Т-регуляторных клеток и, как следствие, особого паттерна воспаления результатом которого является ремоделирование бронхиальной стенки, необратимая бронхообструкция и терапевтическая резистентность.
Список литературы
1. Козина, О.В. Вклад токсических метаболитов NO в формирование эозинофильного воспаления при бронхиальной астме / О.В. Козина, Л.М. Огородова, Е.А. Геренг и др. // Пульмонология. - 2009. - № 4. - C. 69-73.
2. CD4+ T cell response elicited by different subsets of human skin migratory dendritic cells / A.E. Morelli, J.P. Rubin, G. Erdos [et al.] // J. Immunol. - 2005. - Vol.175. - P. 7905-7915.
3. Пухальский, А.Л. Влияние стероидной терапии на течение бронхиальной астмы / А.Л. Пухальский, Г. В. Шмарина, К. А. Зыков, В.А. Алешкин // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. - 2009. - № 6. - C. 3-9.
4. Human T regulatory cells can use the perforin pathway to cause autologous target cell death / W.J. Grossman, J.W. Verbsky, W. Barchet [et al.] // Immunity. - 2004. - Vol.21. - P. 589601.
5. The emerging role of CTLA-4 as an immune attenuator / C.B. Thompson, J.P. // Immunity.
- 1997. - Vol. 7, № 4. - Р. 445 - 450.
6. «Иммунология» 7-е издание,/ Д. Мейл [и др.] // М., 2007,568 с..
7. CD4(+) Tregs and immune control / Z. Fehervari, S. Sakaguchi, W.J. Grossman, J.W. Verbsky, W. Barchet [et al.] // J. Clin. Invest. - 2004. - Vol.114. - P. 1209—1217.
8. Generalized autoimmune disease in interleukin-2-deficient mice is triggered by an uncontrolled activation and proliferation of CD4+ T cells / B. Sadlack, J. Lohler, H. Schorle [et al.] // J. Eur. Immunity. - 1995. - Vol.25. - Р. 3053 - 3059.
9. Cutting edge: IL-2 is critically required for the in vitro activation of CD4+CD25+ T cell suppressor function / A.M. Thornton, E.E. Donovan, C.A. Piccirillo, E.M. Shevach // J. Immunol. -2004. - Vol.172. - P. 6519-6523.
EFFECT OF 3- NITROTYROSINE ON THE FORMATION OF THE SUBPOPULATION OF T-REGULATORY CELLS IN AIRWAYS INFLAMMATION
L.M. OGORODOVA I.V. PETROVA K.Y. RUKIN
Siberian State Medical University, Tomsk
e-mail: [email protected]
Allergic airway inflammation is a cascade of processes involv- ing many cells and mediators and a complex of regulation. Important place among the mediators is NO and its metabolites. As a result of the active forms of NO or oxidative stress develops, or nitrozilating stress with the formation of nitrites, nitrosamines, 3- nitrotyrosine. In the regulation of immune response and the development of allergic reactions play a key role of T-regulatory cells, which are under nitros- ative stress ripen in the presence of high concentrations of 3- nitrotyrosine. Objective: to establish the effect of 3-nitrotyrosine on the immune response involving T-regulatory cells in allergic inflam- mation. The study involved patients with mild persistent and severe asthma. Cultivation of mononuclear cells was performed in the pres- ence of 3-nitrotyrosine without him. Analysis of subpopulations of T-reg cells were analyzed by Flow Cytometric. In patients with asthma, the number of regulatory T cells with the phenotype CD4+CD25+ was significantly lower than in healthy donors. The number of CD4+CD25+ high in severe asthma was 1,5 higher than in mild asth- ma and in healthy donors. High concentrations of 3-nitrotyrosine in severe asthma leads to an increase in population of regulatory cells with the phenotype of CD4+FOXP3+ and decrease the number of CD4+CD25+ Treg.
Key words: bronchial asthma, dendritic cells, 3-nitrotyrosine.
