CC BY
47
УДК: 577.113:576.5:547.455.3:577.152.1
А.В. Брыксин, Б.П. Челобанов, Н.В. Володько, В.В. Власов, П.П. Лактионов
ВЛИЯНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ НА ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТ ДЕГИДРОГЕНАЗЫ (САРБН)
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск ГУ НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск
Клеточная локализация глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы и комплексов фермента дезоксирибоолигонуклеотидами была исследована при помощи флуоресцентной микроскс иии с использованием антител против САРИН и аффинной модификации фермента с ис пользованием реакционно-способных производных олигонуклеотидов. Было показано, чт взаимодействие с дезоксирибоолигонуклеотидами приводит к накоплению модифицирован ного фермента в ядрах клеток линий А431, НеЬа и НаСа^ в то время как немодифицирован ная форма САРИН локализуется главным образом в цитоплазме клеток. Эти данные и дан ные о том, что окисленная форма САРИН обладает повышенным сродством к нуклеиновьв кислотам, позволяют предположить, что окисление САРИН при окислительном стрессе мо жет приводить к накоплению фермента в ядре за счет комплексообразования с внутрикле точными или внеклеточными нуклеиновыми кислотами.
Ключевые слова: глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, ядерная локализация, антитела алкилирующие производные олигонуклеотидов, САРИН
В настоящее время достоверно показано, что глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа является полифункциональным белком и выполняет ряд функций как в цитоплазме, так и в ядрах клеток. Так, например, было показано, что GAPDH связывается с микротрубочками, модулирует их конденсацию и участвует в слиянии клеточных мембран [1]. GAPDH участвует в регуляции кальциевого баланса клетки связываясь с рецептором инозитол 1,4,5-трифосфата [2]. Находясь в ядре, GAPDH участвует в транскрипции генов, DNA репликации, DNA репарации и в экспорте ядер-ной RNA [3]. Группой Сировера было показано, что GAPDH может функционировать как урацил-DNA гликозилаза и репарировать повреждения в DNA, вызванные дезаминированием цитозина [4]. В другой работе этой же группы было показано, что концентрация GAPDH в ядре зависит от фазы клеточного цикла [5]. В работе Zheng и соавторов GAPDH была идентифицирован как необходимый компонент мультикомпонентного Oct-1 коактива-тора — OCA-S, необходимого для транскрипции генов гистона Н2В во время прохождения клеткой S-фазы [6]. Эти данные согласуются с сообщением о том, что GAPDH была идентифицирована как ssDNA-связывающий белок и предположительно является активатором транскрипции в нейронах
[7]. В недавних исследованиях было показано, что GAPDH играет важную роль в апоптозе, час-
то ассоциированным с окислительным стрессол
[8]. Считается, что в ходе апоптоза происходит пе рераспределение САРИН между ядром и цитоп лазмой за счет транспорта САРИН в комплексе < 81аЫ протеазой из цитоплазмы в ядро. По обще принятому мнению, накопление САРИН в ядр< свидетельствует о неминуемой гибели клетки Таким образом, очевидно, что фермент выполня ет множество функций находясь в ядре клетки I изучение процессов, приводящих к накопленик САРИН в ядрах клеток является важной задачей.
Известно, что САРИН связывает РНК и ДНЬ [9, 10]. При помощи разных подходов локализо ваны участки связывания нуклеиновых кислот н; молекуле САРИН, выявлены мотивы, преимущес твенно связывающиеся с молекулой САРИН [И] Показано, что окисленная форма САРИН связы вает нуклеиновые кислоты с большей эффективностью, чем не окисленная [12]. Однако биологи* взаимодействия САРИН с нуклеиновыми кислотами не известна, хотя, вполне вероятно, что такое взаимодействие может влиять на распределение фермента между ядром и цитоплазмой и оказывать действие на биологические процессы, в реализации которых участвует САРИН.
Мы исследовали распределение САРИН и комплексов САРИН с 21-звенным дезоксирибоолиго-нуклеотидом и его укороченным аналогом в ядрах и цитоплазме клеток линий А431, НеЬа и НаСа!
Было показано, что GAPDH локализуется преимущественно в цитоплазме клеток линий А431, HeLa и HaCat, в то время как образование комплексов GAPDH с 21-звенным дезоксирибоолигонуклео-тидом приводит к накоплению значительного количества фермента в ядрах клеток. Полученные результаты свидетельствуют о том, что транслокация фермента в ядро может усиливаться в присутствии внутриклеточных либо внеклеточных нуклеиновых кислот, имеющих в своей структуре последовательности, обладающие высоким сродством к GAPDH.
Материалы и методы
Радиоактивную метку 32Р вводили в олигонуклеотиды 5’-pCAGTAAATATCTAGGA (p(N)16) и 5’-рТ AC AGT АААТ ATCT AGGAATG (p(N)21) («Биоссет», Новосибирск, Россия) обменом 5’-концевого фосфата с помощью Т4-полинуклео-тидкиназы. Алкилирующую группировку (C1R) вводили присоединением 4-[ (N-2-хлорэтил-М-метил)амино]бензиламина к 5’- концевому фосфату олигонуклеотидов по описанному ранее методу [13].
Препарат GAPDH выделяли из эритроцитов человека как описано в [14]. Кроликов породы «Шиншилла» весом 1,7±0,3 kg иммунизировали подкожно 500 |ig препарата GAPDH (примесей <10%), эмульгированного с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Повторную иммунизацию проводили через 21 день и, затем с интервалом 2 недели 100 jag антигена, эмульгированного с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда. Для проверки титра и выделения антител кровь забирали из краевой вены уха кролика непосредственно перед иммунизацией и через 1 неделю после 3-й и последующих иммунизаций. Антитела очищали из сыворотки преципитацией сульфатом аммония с последующей аффинной хроматографией на сорбенте с иммобилизованной GAPDH и истощением антител против неполного лизата клеток HeLa, дефицитного по GAPDH (преципитат, полученный при 50% насыщении лизата клеток HeLa сульфатом аммония) [15]. Для получения флуоресце-ин-меченых козьих антител против IgG кролика (GAR-Flu) GAR инкубировали с раствором флу-оресцеинизотиоционата в 0,1 М карбонатном буфере pH 9,5 в течение 2 ч. Избыток не прореагировавшего флуоресцеинизотиоционата отделяли гель-фильтрацией на на сефадексе G-25sf.
Клетки линий А431 (эпидермальная карцинома человека), HeLa (карцинома шейки матки человека) и HaCat (иммортализованные кератиноциты человека), культивировали в среде Д MEM (Sigma), содержащей 10% ЭТС и антибиотики (пенициллин и стрептомицин, 100 ед/мл). Для экспериментов по аффинной модификации клетки рассевали на 24-луночные планшеты, а для микроскопии на
8-луночные камеры (Chamber Slide, Nunc Inc.) за 1-2 дня до эксперимента. Культуры клеток использовали при плотности не более 70% от монослоя. Жизнеспособность клеток определяли окрашиванием клеток трипановым синим.
Для проведения аффинной модификации клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и инкубировали с 1 мкМ раствором производного олигонуклеотида в PBS в течение 1 ч при 37 °С. После инкубации клетки трижды промывали PBS, разделяли на мембранно-цитозоль-ную (МЦ) и ядерную (Я) фракции и анализировали белки при помощи DS-Na-диск-электрофореза в градиентном (10 20%) ПААГ как описано ранее [16].
Для исследований локализации GAPDH при помощи флуоресцентной микроскопии клетки трижды отмывали средой ДМЕМ, фиксировали метанолом и инкубировали в среде ДМЕМ с кроличьими АТ против GAPDH в течение 2 часов. Затем трижды отмывали средой ДМЕМ и инкубировали 1 час с флуоресцеин-мечеными козьими антителами против IgG кролика. После инкубации клетки трижды отмывали PBS, отделяли предметное стекло с клетками от камеры, удаляли избыток PBS фильтровальной бумагой, наслаивали среду для поддержания флуоресценции (DACO® Fluorescent mounting medium), накрывали покровным стеклом и анализировали при помощи флуоресцентной микроскопии.
Электрофорез в нативных условиях проводили как описано в [13]. Денситометрия электрофоретических данных и данных флуоресцентной микроскопии были выполнены в программе ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Статистическую обработку данных проводили в программе GraphPad Prism (http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm).
Результаты и обсуждение
Ранее нами было показано, что в нативных условиях олигонуклеотиды определенной последовательности (p(N)21 и p(N)16) способны образовывать стабильные комплексы с GAPDH при инкубации с ядерным экстрактом клеток линии HeLa [13].
Для того, чтобы выяснить является ли связывание таких олигонуклеотидов с GAPDH уникальной характеристикой клеток линии HeLa или оно наблюдается в клетках разных линий, мы инкубировали ядерные экстракты клеток линий HeLa, А431, HaCat и, в качестве контроля, очищенный препарат GAPDH с радиоактивно меченным олигонуклеотидом p(N)21. Образование комплексов олигонуклеотидов с GAPDH анализировали при помощи электрофореза в нативных условиях с последующей радиоавтографией (Рис. 1а). Как видно из рисунка, образование комплекса GAPDH-p(N)21 наблюдается в ядерных экстрактах всех исследованных клеток и, по-видимому, является универ-
сальным свойством глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы.
Исследование локализации молекул САР01I и олигонуклеотидов методом флуоресцентной микроскопии позволяет выяснить их взаимное расположение в клетке, однако не позволяет однозначно утверждать, что эти молекулы находятся в комплексе друг с другом. Для анализа распределения комплекса САРОН с олигонуклеотидом р(Ы).,, между ядерной и мембранно-цитозольной фракциями клеток мы использовали аффинную модификацию САРОН радиоактивно-меченым алкилнрующим производным олигонуклеотида (С1Кр(Ы)16), которая приводит к формированию ковалентных комплексов между белком и олигонуклеотидом, не влияя при этом на специфичность комплексообразо-вания [13]. Ковалентные комплексы между САРОН п С1Кр(1^)|е, полученные в результате инкубаци и С1 Яр(Ы) 16 с ядерными экстрактами клеток линий НеЬа, А431 и НаСаС идентифицировали после электрофореза в денатурирующем ПААГ с последующей радиоавтографией (Рис. 16). Как видно из рисунка 1, введение алкилирую-щей группы в олигонуклеотид р(М),м. а так же использование более короткого аналога олигонуклеотида р(М)|Г> не влияют на специфичность комп-лексообразования с САРОН.
Для локализации внутриклеточного распределения комплекса САРОН-олнгонуклеотид мы проводили инкубацию живых клеток НеЬа, А431 и НаСаС с алкилирую-щими производными С1Кр(Ы)|Г., как описано в материалах и методах, и, после разделения клеток на мембранно-цитозольную и ядерную фракции, анализировали содержимое фракций электрофорезом в денатурирующих условиях (Рис. 2а). Анализ полученных данных свидетельствует о том, что в ходе инкубации клеток линий НеЬа, А431 и НаСа1 с алкилирующи-ми производными олигонуклеотида происходит накопление комплекса в ядрах клеток (Рис. 26).
Чтобы сопоставить полученные данные о распределении комплексов САРОМ-р(М)|(. с данными по распределению САРОН в клетках, мы вы-
делили САРОН из эритроцитов человека и получили кроличьи поликлональные антитела против САРОН. Для получения мо-носпецифичных антител против САРОН мы провели очистку антител методом аффинной хроматографии на колонке с иммобилизированной САРОН с последующим истощением антител на колонке с иммобилизованным клеточным лизатом, дефицитным по САРОН. Полученные антитела были затем использованы для исследования внутриклеточной локализации САРОН методом флуоресцентной микроскопии. Распределение САРОН
НоСл! A4JI HcLa - GAPDH
CIRpN,t
HaCat A43I HcLa
CIRpN,,
HcLa GAPDH
- GAPDH-опигомуялвотид •
Рис. 1. Образование специфичных комплексов олигонуклеотидов
р№„<р№^ и САРОН
(I ядерных экстрактах клеток линий НаСа1, А431 и Не1м.
а) Электрофореграмма разделения в нативных условиях ядерных экстрактов клеток линий НаСа1, А431, Не1м и САРОН эритроцитов человека после инкубации с радиоактивно меченным олигонуклеотидом р(1Ч)2Г Разделение проводили в 4% ПААГ с последующей радиоавто/рафией, б) Аффинная модификация белков ядерных экстрактов клеток-линий НаСа1, А431, НеЬа и САРОН эритроцитов человека алкилирующими производными олигонуклеотидов р(Ю,6 и р(М)!Г Белки анализировали при помощи ЯОБ-дискэлектрофореза в градиентном (10-20%) П/ЫГс последующей радиоавтографией
а)
HaCat А431 Hela MU я мц я мц я
б)
г
п
□ ~мц
□ -я
Рис. 2. Накопление комплексов p(N) W-GAPDH в ядерной фракции клеток HaCat, А431 и Не La после инкубации интактных клеток с алкилирующим производным олигонуклеотида ClR-p(N) 1в.
а) Клетки инкубировали 1 час с 1 мкМ производными олигонуклеотида в PBS при 37 °С, разделяли на мембранноцитозольную (МЦ) и ядерную (Я) фракции, как описано в материалах и методах, и анализировали содержание комплексов при помощи SDS-дискэлектрофореза в градиентном (10-20%) ПААГ с последующей радиоавтографией,
б) Количественная оценка распределения комплексов GAPDH-олигонуклеотид между мембранно-цитозольной и ядерной фракциями клеток по данным денситометрии
90
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №5 (127), 2007 г.
в клетках линий А431, НеЬа и НаСа1 оценивали по отношению интенсивностей флуоресценции ядер клеток н флуоресценции цитоплазмы (Рис. 3). Оказалось, что такое распределение практически не зависит от используемой клеточной линии н, что САРОН локализуется главным образом в цитоплазме клеток, что подтверждает данные других авторов [17].
Полученные нами данные свидетельствуют о том. что инкубация клеток с олигонуклеотидами, специфически взаимодействующими с С АРОН, приводит к изменению внутриклеточного распределения САРОН таким образом, что САРОН, локализующийся в норме в цитоплазме клеток, при образовании стабильного комплекса с нуклеиновыми кислотами (каковым является ковалентный комплекс с р(М)|6) преимущественно локализуется в ядрах клеток.
а)
70
60
50
40
30
20
10
HaCat
A34I
HeLa
Рис. 3. Внутриклеточное распределение САРОН в клетках линий НаСаІ, А431 и Неїм, наблюдаемое методом флуоресцентной микроскопии а) Флуоресцентная микроскопия клеток линий НаСаІ, А431 и Неїм, выполненная с использованием кроличьих поликлональных антител против САРОН
б) Количественная оценка интенсивности флуоресценции ядерной и мембранно-цитозольной фрикций (статистические данные по распределению в 20 случайно выбранных клетках)
Известно, что транспорт олигонуклеотидов в клетки происходит преимущественно по эндоци-тозному пути [18]. При таком транспорте олигонуклеотиды проводят значительную часть времени в цитоплазме клеток, где скорее всего и происходит взаимодействие и модификация GAPDII. Однако, нельзя исключить ситуации при которой олигонуклеотиды проникают в ядро и модифицируют ядерную форму GAPDH.
Существование механизма циркуляции GAPDH между ядром и цитоплазмой активно дискутируется в научной литературе. GAPDH содержит в своей структуре сигнал ядерного экспорта, но вто же время, в отличие от белков, претерпевающих постоянный обмен между ядром и цитоплазмой, в нем отсутствует сигнал ядерного импорта (19]. Нага и соавторы, используя двухгпбрндную систему дрожжей, показали, что транслокация GAPDH в ядро происходит за счет образования комплекса с Siahl протеазой 1201. Наблюдаемый феномен перераспределения GAPDH в ядро после образования комплекса с олигонуклеотидом свидетельствует об изменении работы такого транспортного механизма, при котором равновесие сдвигается в сторону ядерного экспорта. Такой сдвиг может быть опосредован удержанием комплекса GAPDH-оли-гонуклеотид в ядре за счет взаимодействия олиго-иуклеотпдной компоненты комплекса с ядерным содержимым, либо за счет изменения аффинности фермента после образования комплексас олигонуклеотидом к компонентам транспортной системы. Последняя гипотеза выглядит особенно привлекательной в свете того, что сигнал ядерного экспорта белка расположен в его С-концевой части (19] и пересекается с обнаруженным нами ранее олиго-нуклеотид-связывающим сайтом 1111. Таким образом, олигонуклеотид, связываясь с GAPDH. может блокировать сайт ядерного экспорта от распознавания специфической экспортазой и препятствовать транспорту фермента в цитоплазму приводя к его накоплению в ядре.
Ранее нами было показано, что константа диссоциации комплекса GAPDH-p(N)j, составляет 0,2 мкМ [13]. Окисление GAPDH может увеличивать стабильность комплекса фермента с нуклеиновыми кислотами более чем в 10 раз [12]. Эти данные вместе с нашими данными о транслока-ции комплексов GAPD11 с спквенс-снецнфпчны-ми олигонуклеотидами позволяют предположить существование клеточного механизма, в котором GAPDII выступает в роли сенсора окислительного стресса. Вполне вероятно, что окисление GAPDH может приводить к увеличению ее аффинности к специфическим внутриклеточным нуклеиновым кислотами, которые и регулируют транслокацню GAPDH в ядро и, таким образом, определяют судьбу клетки.
— мц
— Я
Работа была выполнена при поддержке комплексного интеграционного проекта СО РАН № 5.1 и гранта РФФИ 06-04-49485-а.
INTERACTION WITH NUCLEIC ACIDS CAN AFFECT SUBCELLULAR LOCALIZATION OF GAPDH
A.V. Bryksin, B.P. Chelobanov, N.V. Volod’ko,
V.V. Vlassov, P.P. Laktionov
Increased nuclear accumulation of glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is considered to be the early, critical event in apoptosis induced by different effectors one of which is oxidative stress. Oxidation of GAPDH also increases the affinity of the protein towards the nucleic acids. In order to investigate if the formation of the complex between GAPDH and nucleic acids can affect the intracellular distribution of the protein the alkylating derivatives of oligonucleotides were employed. The intracellular distribution of GAPDH and GAPDH-oligonucleotide complexes were monitored by fluorescent microscopy or by fractionation of the cells with the consequent analysis of nuclear and cytosolic fractions by SDS-PAAG. The study revealed that unlike GAPDH which is distributed mostly in the cytoplasm of A431, HeLa and HaCat cells, GAPDH-oligonucleotide complexes have the preferential localization in the nucleus. The results suggest that oxidative stress-induced GAPDH may undergo translocation in to the nuclear as a complex with intra- or extracellular nucleic acids that can facilitate such a process.
Литература
1. Tisdale, E.J. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is phosphorylated by protein kinase Ciota /lambda and plays a role in microtubule dynamics in the early secretory pathway / E.J. Tisdale //J.Biol.Chem. — 2002. — Vol. 277. — № 5. — P. 3334-3341.
2. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor/GAPDH complex augments Ca2r release via locally derived NADH / R.L. Patterson, D.B. van Rossum, A.I. Kaplin, et al. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A - 2005. - Vol. 102. - № 5. -P. 1357-1359.
3. Sirover, M. A. New nuclear functions of the glycolytic protein, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, in mammalian cells / M.A. Sirover // J. Cell Biochem. — 2005.
- Vol. 95. - № 1. - P. 45-52.
4. A human nuclear uracil DNA glycosylase is the 37-kDa subunit of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase / K. Meyer-Siegler, D,J. Mauro, G. Seal, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. - Vol. 88. - № 19. - P. 8460-8464.
5. Cell cycle regulation of the glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase/uracil DNA glycosylase gene in normal human cells / N.R. Mansur, K. Meyer-Siegler, J.C. Wurzer, M.A. Sirover // Nucleic Acids Res. — 1993. — Vol. 21,-№4.-P. 993-998.
6. Zheng, L. S phase activation of the histone H2B
promoter by OCA-S, a coactivator complex that contai GAPDH as a key component / L. Zheng, R.G. Roeder, Luo // Cell. - 2003. - Vol. 114. - № 2. - P. 255-266.
7. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is nonhistone protein and a possible activator of transcripti in neurons / G. Morgenegg, G.C. Winkler, U. Hubscher, al. //J. Neurochem. - 1986. - Vol. 47. - № 1. - P. 54-(
8. Chuang, D.M. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydi genase, apoptosis, and neurodegenerative diseases / D.] Chuang, C. Hough, V.V. Senatorov // Annu. Rev.Pharrr col. Toxicol. - 2005. - Vol. 45. - P. 269-290.
9. Sirover, M.A. New insights into an old protein: t functional diversity of mammalian glyceraldehyde-3-phc phate dehydrogenase / M.A. Sirover // Biochim. Bioph' Acta. - 1999. - Vol. 1432. - № 2. - P. 159-184.
10. Ronai, Z. Glycolytic enzymes as DNA binding pr teins / Z. Ronai // Int. J. Biochem. — 1993. — Vol. 25. №7.-P. 1073-1076.
11. Knock down of cytosolic phospholipase A2: an a tisense oligonucleotide having a nuclear localization bin a С-terminal motif of glyceraldehyde-3-phosphate deh drogenase / P. Laktionov, E. Rykova, M. Toni, et al. , Biochim. Biophys. Acta. — 2004. — Vol. 1636. — № 2-3. P. 129-135.
12. Oxidation of glyceraldehyde-3-phosphate deh drogenase enhances its binding to nucleic acids / E.I. Ar tyunova, P.V. Danshina, L.V. Domnina, et al. // Biocbei Biophys. Res. Commun. — 2003. — Vol. 307. — № 3. P. 547-552.
13. The Rossmann fold of glyceraldehyde-3-pho phate dehydrogenase (GAPDH) is a nuclear docking si for antisense oligonucleotides containing a TAAAT mi tif / C. Griffoni, P.P. Laktionov, E.Yu. Rykova, et al. , Biochim.Biophys. Acta. — 2001. — Vol. 1530. — № 1. P. 32-46.
14. Heinz, F. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydn genase from human tissues / F. Heinz, B. FreimulL // Methods Enzymol. — 1982. — Vol. 89. — Pt D.
P. 301-305.
15. Harlow, E. Antibodies a laboratory manual / E. Ha low, D. Lane. — New York, 1988. — 231 p.
16. Исследование поверхностных олигонуклеоти, связывающих белков эукариотических клеток при го мощи аффинной модификации реакционноспособным производными олигонуклеотидов / Б.П. Челобанов, П.1 Лактионов, М.В. Харькова и др. // Известия Академи Наук. Серия Химическая. — 2002. — № 7. — С. 1113-11Г
17. Schmitz, Н. D. Reversible nuclear translocation < glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase upon serui depletion / H.D. Schmitz // Eur. J. Cell Biol. — 2001. -Vol. 80. -№ 6. -P. 419-427.
18. Cell delivery and mechanisms of action of antisens oligonucleotides / J.P. Leonetti, G. Degols, J.P. Claren et al. // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. — 1993. -Vol. 44.-P. 143-166.
19. Jenkins, J.L. High-resolution structure of huma D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase / J.L. Jei kins, J.J. Tanner // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallog
- 2006. - Vol. 62. - Pt 3. - P. 290-301.
20. S-nitrosylated GAPDH initiates apoptotic ce death by nuclear translocation following Siahl binding M.R. Hara, N. Agrawal, S.F. Kim, et al. // Nat. Cell Bic
- 2005. - Vol. 7. - № 7. - P. 665-674.
92
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН. №5 (127). 2007
