CC BY
10"BicHUK стоматологи", № 1, 2017
L
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧНИИ РОЗД1Л
УДК 612.314+615.322
А. П. Левицкий1, д. биол. н., А. И. Фурдычко2, к. мед. н., О. Е. Успенский3, А. М. Сенникова1, С. В. Гончарук1, к. мед. н.
'Государственное учреждение «Институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Национальной академии медицинских наук Украины» 2Львовский национальный медицинский университет им. Данилы Галицкого 3Харьковский национальный медицинский университет
ВЛИЯНИЕ ВНУТРИДЕСНЕВОГО ВВЕДЕНИЯ МИКРОБНЫХ ПАТОГЕНОВ
НА СТЕПЕНЬ ДИСБИОЗА И АНТИОКСИДАНТНУЮ АКТИВНОСТЬ В ДЕСНЕ И СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС
Введение в десну растворов ЛПС, гиалуронидазы или трипсина вызывает в десне и в сыворотке крови развитие дис-биоза и увеличивает уровень антиоксидантной защиты, больше выраженный для гиалуронидазы. Ключевые слова: липополисахарид, гиалуронидаза, трипсин, десна, сыворотка крови, уреаза, лизоцим, каталаза.
А. П. Левицький1, А. I. Фурдичко2,
О. €. Успенський3, Г. М. Сенткова1, С. В. Гончарук1
1 Державна установа «1нститут стоматологи та щелепно-лицево! х1рургп Нацюнально! академи
медичних наук Украши» 2Львшський нацюнальний медичний ушверситет
1м. Данила Галицького 3Харкшський нацюнальний медичний уншерситет
ВПЛИВ ВНУТР1ШНЬОЯСЕННОГО ВВЕДЕННЯ М1КРОБНИХ ПАТОГЕН1В
НА СТУП1НЬ ДИСБ1ОЗА ТА АНТИОКСИДАНТНУ АКТИВН1СТЬ В ЯСНАХ I СИРОВАТЦ1 КРОВ1 ЩУР1В
Введення в ясна розчишв ЛПС, гiалуронiдази або трипсину викликае в яснах i в сироватц кровi розвиток дисбюзу та збыьшення рiвня антиоксидантного захисту, быьш вира-женого для гiалуронiдази.
Ключовi слова: лтополкахарид, гiалуронiдаза, трипсин, ясна, сироватка кровi, уреаза, лiзоцим, каталаза.
A. P. Levitsky1, A. I. Furdychko2, O. E. Uspenskiy3, A. M. Sennikova1, S. V. Goncharuk1
'State Etablishment «The Institute of Stomatology and Maxillo-Facial Surgery of the National Academy
of Medical Science of Ukraine» 2Lviv National Medical University named after Danylo Galytskij
3Kharkov National Medical University
THE INFLUENCE OF INTRAGUM INTRODUCTION OF MICROBIAL PATHOGENS ON THE DEGREE OF DYSBIOSIS AND ANTYOXIDANT ACTIVITY IN RAT AND SERUM
ABSTRACT
The aim: To investigate the microbial pathogens (LPS, hyaluronidase and trypsine) actions on state of endogenic microbiocenose, antimicrobial and antioxidant defenses in parodonte and serum.
The materials and methods. Microbial pathogens were introduced into rat gum hear molar radices. After 3 hours determined activity urease, lysozyme, catalase and content of MDA in gum and serum.
The findings. The introduction of trypsine decreased lysozyme activity in gum and increased activity of urease and catalase into serum. The introduction of hyaluronidase decreased urease activity into gum but increased catalase activity into gum and serum. The introduction of LPS increased urease activity into serum and increased catalase activity into gum and serum. The conclusion. The intragum introduction of the microbial pathogens (LPS, hyaluronidase, trypsine) provoke bacteriemia and activisation of antioxidant system into gum and serum. Key words: lipopolysaccharide, hyaluronidase, trypsine, gum, serum, urease, lysozyme, catalase.
Роль микробного фактора в патогенезе заболеваний пародонта подтверждена многочисленными экспериментальными и клиническими исследованиями [1-5]. Как известно, патогенное действие микробов на ткани реализуется через образование микробных патогенов (токсинов) [6-9]. К числу последних относятся кишечный эндотоксин (липополисахарид, ЛПС) [10], уреаза [11], ферменты гиалуронидаза [12, 13], протеазы [8] и другие.
ЛПС активирует провоспалительные системы организма, уреаза расщепляет мочевину, образует ядовитый аммиак, гиалуронидаза расщепляет гиалуроно-вую кислоту («межклеточный цемент»), увеличивая проницаемость гисто-гематических барьеров, что способствует транслокации бактерий и их токсинов. Протеазы, выделяемые бактериями, расщепляют защитные белки - лизоцим, иммуноглобулины, а также коллаген.
Цель настоящего исследования. Определение влияния микоробных патогенов (ЛПС, гиалуронидаза, протеаза), вводимых в ткань десны, на состояние эндогенного микробиоценоза, антимикробной и антиок-сидантной защиты в пародонте и в сыворотке крови.
Материалы и методы исследования. В работе был использован ЛПС из E. coli 0111В4 производства «Sigma», США, бактериальная гиалуронидаза с активностью 500 ед/мг производства «Sigma», США и в качестве протеазы - трипсин из панкреас с активностью 400 ед/мг производства «Merck» (ФРГ).
© Левицкий А. П.,Фурдычко А. И., Успенский О. Е., Сенникова А. М., Гончарук С. В., 2017.
"Вiсник стоматологИ", № 1, 2017
Эти препараты использовали в виде растворов на 0,9 %-ном №С1 с концентрацией: ЛПС - 1 мг/мл, гиа-луронидаза - 2 мг/мл и трипсин - 5 мг/мл.
Эксперименты были проведены на белых крысах линии Вистар (самцы, возраст 2 года, средняя живая маса 332±15 г), распределенных в 4 группы: 1-ая -контроль; 2-ая - ЛПС, 3-я - гиалуронидаза и 4-ая -трипсин. Растворы патогенов вводили в десну в районе корней моляров в дозе 0,2 мл на крысу. Контрольным крысам вводили 0,2 мл 0,9 %-ного №С1.
Эвтаназию животных осуществляли через 3 часа под тиопенталовым наркозом (20 мг/кг) путем тотального кровопускания из сердца. Иссекали десну из зоны введения препаратов и получали сыворотку крови.
В гомогенатах десны и в сыворотке определяли активность уреазы [14], как маркера микробного обсеменения, лизоцима [15], как показателя неспецифи-
ческого иммунитета, каталазы [16], являющейся ан-тиоксидантным ферментом. По соотношению относительных активностей уреазы и лизоцима рассчитывали степень дисбиоза по Левицкому [17], а по соотношению активности каталазы и содержания малонового диальдегида (МДА) [18] рассчитывали антиокси-дантно-прооксидантный индекс АПИ [16].
Результаты исследований подвергали стандартной статобработке [19].
Результаты и их обсуждение. В таблице 1 представлены результаты определения в десне активности уреазы и лизоцима. Из этих данных видно, что введение патогенов не сказалось на уровне уреазы, однако введение трипсина вызвало достоверное снижение активности лизоцима, свидетельствующее о падении уровня неспецифического иммунитета в па-родонте.
Таблица 1
Влияние микробных патогенов на активность уреазы и лизоцима в десне крыс
№№ пп Группы Уреаза, мк-кат/кг Лизоцим, ед/кг
1 Контроль 0,177±0,034 287±25
2 ЛПС 0,169±0,061 р>0,8 300±36 р>0,5
3 Гиалуронидаза 0,084±0,010 р<0,05 258±31 р>0,3
4 Трипсин 0,163±0,082 р>0,5 214±23 р<0,05
Таблица 2
Влияние микробных патогенов на активность уреазы и лизоцима в сыворотке крови крыс
№№ пп Группы Уреаза, нкат/л Лизоцим, ед/л
1 Контроль 0,90±0,08 78±18
2 ЛПС 1,68±0,99 р<0,05 121±31 р>0,05
3 Гиалуронидаза 1,04±0,22 р>0,3 107±11 р>0,05
4 Трипсин 2,82±0,61 р<0,01 73±3 р>0,3
Таблица 3
Влияние микробных патогенов на активность каталазы и индекс АПИ в десне крыс
№№ пп Группы Каталаза, мкат/кг АПИ
1 Контроль 4,33±0,30 6,33±0,52
2 ЛПС 6,56±0,50 р<0,05 5,03±0,53 р>0,05
3 Гиалуронидаза 8,17±0,39 р<0,001 7,35±0,70 р<0,05
4 Трипсин 8,02±0,39 р<0,001 7,66±0,72 р<0,05
"В1сник стоматологи", № 1, 2017
Таблица 4
Влияние микробных патогенов на активность каталазы и индекс АПИ в сыворотке крови крыс
№№ пп Группы Каталаза, мка^л АПИ
1 Контроль 0,294±0,013 4,19±0,43
2 ЛПС 0,555±0,014 р<0,01 9,08±1,07 р<0,01
з Гиалуронидаза 0,508±0,016 р<0,01 7,29±0,74 р<0,05
4 Трипсин 0,523±0,016 р<0,01 6,99±0,70 р<0,05
В таблице 2 показаны изменения активности уреазы и лизоцима в сыворотке крови. Видно, что введение ЛПС и, особенно, трипсина существенно повышает в сыворотке активность уреазы, свидетельствующее о бактериемии, поскольку уреаза имеет микро-
бное происхождение, а соматические клетки ее не синтезируют [14].
Введение ЛПС проявляет тенденцию к росту активности лизоцима, что может быть обусловлено активацией секреции лизоцима нейтрофилами под влиянием ЛПС.
4 п
з,2 -
о s ю о s ч
2,4 -
1,6 -
О
0,8 -
0
2
з
4
□ десна □ сыворотка
Рис. Влияние микробных патогенов на степень дисбиоза в десне и в сыворотке крови крыс
Рассчитанная по соотношению уреазы и лизоци-ма степень дисбиоза представлена на рисунке, из которого следует, что введение гиалуронидазы снижает степень дисбиоза в десне, а введение трипсина резко увеличивает степень дисбиоза в сыворотке крови.
В таблице 3 представлены результаты определения в десне активности каталазы и индекса АПИ. Видно, что введение патогенов достоверно увеличивает активность каталазы (особенно, гиалуронидаза и трипсин). Эти же патогены достоверно увеличивают и индекс АПИ, свидетельствующий о повышенном уровне антиоксидантной системы пародонта под влиянием гиалуронидазы и трипсина.
В таблице 4 представлены аналогичные показатели для сыворотки крови. Видно, что все три патогена достоверно повышают активность каталазы (в 1,71,9 раза) и показатель АПИ (в 1,7-2,2 раза), причем в наибольшей степени ЛПС. Если признать за антиок-сидантной системой важную защитную функцию в организме, то полученные данные свидетельствуют о способности избранных нами микробных патогенов (в этой дозе) повышать резистентность организма.
Вывод. Интрадентальное введение микробных патогенов (ЛПС, гиалуронидазы и трипсина) вызыва-
ет бактериемию и активизацию антиоксидантной системы сыворотки крови и десны.
Список литературы
1. Mикрофлора полости рта: норма и патология I [Е. Г. Зеле-нова, M. И. Заславская, Е. В. Салина и др.]. - Н. Новгород: HГMA, 2004 - 158 с.
2. Кухарская О. Г. Mикробиологический баланс полости рта у больных пародонтитом I О. Г. Кухарская, M. Д. Король II Украш-ський стоматолопчний альманах. - 2007. - № 1. - С. 58-61.
3. Череда В. В. Miкрофлора як фактор виникнення запальних хвороб пародонта I В. В. Череда II Украшський стоматолопчний альманах. - 2007. - № 1. - С. 77-80.
4. Цепов Л. М. Роль микрофлоры в возникновении воспалительных заболеваний пародонта I Л. M. Цепов, Н. А. Голева II Па-родонтология. - 2009. - № 1(50). - С. 7-12.
5. Распространенность грибковой флоры и особенности микробиоценоза у лиц с интактным пародонтом и с хроническими воспалительными заболеваниями пародонта I О. А. Чепуркова, M. Г. Чеснокова, В. Б. Недосеко [и др.] II Пародонтология. - 2009. - № 1(50). - С. 60-65.
6. Бондаренко В. М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса I В. M. Бондаренко II ЖMЭИ. - 1999. - № 5. - С. 34-з9.
7. Virulence mechanisms of periodontopathic bacteria and host responses / K. Ishihara, T. Miura, A. Yamanaka [et al.] // Bull. Tokyo dent. Coll. - 2001. - v. 42, № 2. - P. 105-108.
8. Флуер Ф. С. Энтеротоксины Bacillus cereus / Ф. С. Флуер // ЖMЭИ. - 2007. - № 2. - С. 105-110.
"Вiсник стоматологИ", № 1, 2017
9. Куцевляк В. Ф. Микробная флора полости рта в норме и ее повреждающие факторы при патологии / В. Ф. Куцевляк // Стоматолог. - 2011. - № 10(160). - С. 28-31.
10. Wang X. Endotoxins: structure, function and recognition / X. Wang, P. Quinn // Seria: Subcellular Biochemistry. - 2010. - v. 53. -415 p.
11. Сухарев Ю. С. Энтеротоксин-продуцирующие патогенные Escherichia coli / Ю. С. Сухарев. - Харьков: Коллегиум, 2008. -346 с.
12. Гириш К. С. Ингибирование гиалуронидазы яда индийской кобры биоактивными компонентами и полисахаридами растений / К. С. Гириш, К. Кемпараджу // Биохимия. - 2005. - т. 70, вып. 8. - С. 1145-1150.
13. Роль гиалуронидазы в регуляции гемопоэза / Г. Н. Зюзь-ков, В. В. Жданов, А. И. Дыгай [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - т. 144, № 12. - С. 690-695.
14. Гаврикова Л. М. Уреазная активность ротовой жидкости у больных с острой и одонтогенной инфекцией челюстно-лицевой области / Л. М. Гаврикова, И. Т. Сегень // Стоматология. - 1996. -Спецвыпуск. - С. 49-50.
15. Левицкий А. П. Лизоцим вместо антибиотиков / А. П. Левицкий. - Одесса: КП ОГТ, 2005. - 74 с.
16. Биохимические маркеры воспаления тканей ротовой полости: методические рекомендации / А. П. Левицкий, О. В. Деньга, О. А. Макаренко [и др.] - Одесса: КП ОГТ, 2010. - 16 с.
17. Патент на корисну модель, Укра!на 43140, МПК (2009) G01N 33/48. Споаб оцшки ступеня дисбюзу (дисбактерюзу) орга-шв i тканин / Левицький А. П., Деньга О. В., Селiванська I. О. [та ш.]. - Опубл. 10.08.2009, Бюл. № 15.
18. Стальная И. Д. Метод определения малонового диальде-гида с помощью тиобарбитуровой кислоты. В кн.: Современные методы в биохимии / И. Д. Стальная, Т. Г. Гаришвили. - М.: Медицина, 1977. - С. 66-68.
19. Кокунин В. А. Статистическая обработка данных при малом числе опытов / В. А. Кокунин // Укра!нський бiохiмiчний журнал. - 1975. - т. 47, № 6. - С. 776-791.
REFERENCES
1. Zelenova E. G., Zaslavskaya M. I., Salipa E. V. [i dr.].
Mikroflora polosti rta: norma i patologiya [Microflora of oral cavity: the norm and the pathology] N. Novgorod, NGMA, 2004: 158.
2. Kukharskaya O. G., Korol' M. D. The microbial balance of oral cavity in parodontite patients. Ukrai'ns'kyj stomatologichnyj al'manah. 2007; 1: 58-61.
3. Chereda V. V. Microflora as factor of development of inflammation diseases of parodonte. Ukrai'ns'kyj stomatologichnyj al'manah. 2007; 1: 77-80.
4. Tsepov L. M., Goleva N. A. The role of Microflora in development of inflammation diseases on parodonte. Parodontologiya. 2009; 1(50): 7-12.
5. Chepurkova O. A., Chesnokova M. G., Nedoseko V. B. [i dr.]. The fingus flora sprading and peculiarity of microbiocenose in patients with intact parodontitis and with chronic inflammation . Parodontologiya. 2009; 1(50): 60-65.
6. Bondarenko V. M. The factors of bacterial pathogenity and its roles in the development of infections processes. ZhMEI. 1999; 5: 34-39.
7. Ishihara K., Miura T., Yamanaka A. [et al.]. Virulence mechanisms of periodontopathic bacteria and host responses. Bull. Tokyo dent. Coll. 2001; 42(2): 105-108.
8. Fluer F. S. Enterotoxins of Bacillus cereus. ZhMEI. 2007; 2: 105-110.
9. Kutsevlyak V. F. Microbial flore of oral cavity and her damage factors at pathology. Stomatolog. 2011; 10(160): 28-31.
10. Wang X., Quinn P. Endotoxins: structure, function and recognition. Seria: Subcellular Biochemistry. 2010; 53: 415.
11. Sukharev Yu. S. Enterotoksin-produtsiruyushchie patogennye Escherichia coli [The enterotoxin-producent pathogenic Escherichia coli]. Khar'kov, Kollegium, 2008: 346.
12. Girish K. S., Kemparadzhu K. The inhibition indian cobra's venom hyaluronidase by the bioactive components and plants' polysac-charides. Biokhimiya. 2005; 70(8): 1145-1150.
13. G. N. Zyuz'kov, V. V. Zhdanov, A. I. Dygay [i dr.]. The role of hyaluronidase in hemopoese regulation. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny. 2007; 144(12): 690-695.
14. Gavrikova L. M., Segen I. T. Urease activity of oral liquid in patients with acute odontogenic infection of maxillo-facial part. Stomatologiya. 1996; The extra issue: 49-50.
15. Levitsky A. P. Lizotsym vmesto antibiotikov [Lysozyme instead of antibiotics]. Оdеssа, KP OGT, 2005: 74.
16. Levitsky A. P., Denga O. V., Makarenko O. A. [i dr.]. Biokhimicheskie markery vospaleniya tkaney rotovoy polosti: metodicheskie rekomendatsii [Biochemical markers of inflammation of oral cavity tissue: method guidelines]. Оdеssа, KP OGT, 2010:16.
17. Levitsky A. P., Denga O. V., Selivanskaya I. A. [ta in.]. The method of estimation of the degree of dysbiosis (dysbacteriosis) of organs and tissues. Patent of Ukraine 43140. IPC (2009) G01N 33/48. Application number u 200815092. Date of filling: 26.12.2008. Publ.: 10.08.2009. Bul. № 15.
18. Stalnaya I. D., Garishvili T. G. Metod opredeleniya malonovogo dialdegida s pomoshchyu tiobarbiturovoy kisloty [The method of revelation of malonic dialdehyde with thiobarbituric acid]. Moskva, Meditsina, 1977: 66-68.
19. Kokunin V. A. Statistical processing of data for a small number of experiments. Ukrai'ns'kyj biohimichnyj zhurnal. 1975; 47(36): 776-791.
Поступила 01.02.17
УДК 612.014.1
И. Г. Топов
Государственное учреждение «Институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Национальной академии медицинских наук Украины»
ОТСУТСТВИЕ ПРОДИСБИОТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НА ТКАНИ ПОЛОСТИ РТА ПОТРЕБЛЕНИЯ ВЫСОКООЛЕИНОВОГО ПОДСОЛНЕЧНОГО МАСЛА
Кормление крыс высокоолеиновым подсолнечным маслом (85 % олеиновой кислоты) в течение 40 дней не повышает в десне, слизистой щеки, в печени и в сыворотке крови активность уреазы и не снижает активность лизоцима, не вызывает развитие дисбиоза.
Ключевые слова: высокоолеиновое подсолнечное масло, дисбиоз, оральные ткани, сыворотка крови, печень.
I. Г. Топов
Державна установа «1нститут стоматологи та
щелепно-лицево! хiрурril Нащонально! академи медичних наук Украши
ВЩСУТШСТЬ ПРОДИСБ1ОТИЧНО1 Д11 НА ТКАНИНИ РОТОВО1 ПОРОЖНИНИ СПОЖИВАННЯ ВИСОКООЛЕ1НОВО1 СОНЯШНИКОВО1 ОЛ11
Годiвля щурiв високоолетовою соняшниковою олieю не тд-вищуе в яснах, щощ, печтщ i сироватц кровi активностi уреази, не знижуе активностi лiзоциму, не викликае розви-ток дисбюзу.
Ключовi слова: високоолешова соняшникова олiя, дисбiоз, оральт тканини, сироватка кровi, печiнка.
© Топов И. Г., 2017.
