CC BY
51
УДК -615.322:582. 998. 2.03
ВЛИЯНИЕ ВНЕСЕНИЯ СУЛЬФАТА КОБАЛЬТА НА СОДЕРЖАНИЕ КУМАРИНОВ В ANGELICA ARCHANGELICA L.
© А.Ю. Касьянова, Р.М. Баширова , Н.В. Кудашкина
Башкирский государственный университет, ул. Фрунзе, 32, Уфа, 450074 (Россия) e-mail: kasiyanovaa@mail.ru
Изучены и проанализированы данные по подбору оптимальной дозы подкормки Angelica archangelica сульфатом кобальта и ее влияние на накопление кумаринов в корнях. Показано, что внесение сульфата кобальта под ювенильные растения позволяет получать большую массу сырья дягиля, содержание кумаринов в корнях увеличивается при внесении сульфата кобальта в дозе 5 10-6 г и снижается при подкормке сульфатом кобальта в дозе 5 10-4 г.
Введение
Дудник дягилевый (Angelica archangelica) - ценное лекарственное, пищевое, медоносное,
эфирномасличное растение. Представители рода Angelica, нормализующие эстрогенный баланс, известны как «женский женьшень». Из экстрактов A. archangelica изготавливают лекарственные средства для лечения заболеваний половой сферы [1], невралгии, артрита [2] и грибковых заболеваний. Корень Angelica, содержащий эффективный антиагрегант - феруловую кислоту [3], входит в состав болюсов Хуато. Популярны гастроэнтерологические препараты - «Гастритол», «Карвомин®», «Ветримарин®» с
добавлением корней дягиля [4]. Растение накапливает железо, витамин В12 и родственные ему кобаламины, предотвращающие развитие железодефицитной анемии [5]. Фуранокумарин остол, содержащийся во всех органах растения, обладает вазорелаксантной, антипролиферативной активностью [6-8]
За рубежом представители рода Angelica являются официнальными и введены в культуру [9]. Ведется активная селекция A. archangelica L. [10]. В Южной Корее дягиль выращивают на площади 2200 га, при этом получают до 3400 кг/га Angelica gigas сорта «Manhoodanggui». Во Вьетнаме ежегодно получают 157 тонн A. daurica [11].
К качеству получаемого сырья в зависимости от назначения предъявляются разные требования. Если для изготовления медицинских препаратов важно получение сырья Angelica с высоким содержанием фуранокумаринов, то в пищевых продуктах содержание этих веществ следует ограничивать в связи с их высокой фотосенсибилизирующей активностью. Поскольку содержание вторичных метаболитов в дягиле чрезвычайно динамично [12, 13], есть основания предполагать возможность регуляции качества сырья с помощью различных агротехнических мероприятий, в частности за счет изменения плотности высаживания рассады [14].
Экспериментальная часть
Нами проведена оценка влияния подкормки растений A. archangelica раствором сульфата кобальта на морфологические показатели растений и содержание вторичных метаболитов в корнях растений первого года вегетации.
Кобальт как потенциальный эдафический регулятор качества сырья привлек наше внимание из следующих соображений:
1. Ионы кобальта влияют на гормональный обмен растения, ингибируя образование этилена и инактивируя ауксиноксидазы [15, 16].
* Автор, с которым следует вести переписку.
2. Кобальт не только центральный ион кобаламиновых пигментов, но и стимулятор синтеза вторичных метаболитов [17, 1S], активизирующий ключевые ферменты синтеза фенольных соединений цитозольную 3-дезокси^-арабино-гептулоз-7-фосфат синтетазу и 3-дегидрохиннатсинтетазу [19, 20].
3. Семена растений, выращенных на карбонатных почвах, характеризуются низким содержанием кобальта [21].
Исследования проведены в Кармаскалинском районе Республики Башкортостан. Почва - чернозем выщелоченный среднесуглинистый. Рассаду дягиля высадили в мае по схеме 50x50 см. Сульфат кобальта вносили в виде 0,0001, 0,001, 0,01% раствора по 50 мл под каждое растение в июне.
Варианты эксперимента следующие:
1. контроль;
2.+ CoSO4, 0,005 мг на 1 растение;
3.+ CoSO4, 0,05 мг на 1 растение;
4.+ CoSO4, 0,5 мг на 1 растение.
В каждом варианте было по 50 растений, из которых методом случайного отбора 10 растений было взято для анализа. Содержание кумаринов в корнях оценивали методом прямого спектрофотометрирования хлороформных экстрактов корней при X 320 нм на регистрирующем спектрофотометре СФ-121. Экстракцию кумаринов CHCl3 вели в течение двух суток, содержание рассчитывали исходя из коэффициента молярной экстинкции. Как указывают К.Хауффе с соавт., 90% кумаринов, экстрагированных хлороформом, имеет максимум светопоглощения при 320 нм [22].
После упаривания хлороформных экстрактов их растворяли в метаноле и анализировали фракционный состав кумаринов методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Силуфол» в системе: эфир -толуол (1 : 1), в которую после встряхивания вносили 12% ледяной уксусной кислоты. Кумарины визуализировали в ультрафиолетовом свете [4].
Обсуждение результатов
Уже через две недели после подкормки растений отмечали морфологические изменения: увеличение площади листовых пластинок и массы корня, что связано, по-видимому, с более высоким содержанием хлорофилла в растениях, получивших микроэлемент. Наиболее эффективным оказалось внесение 0,005 мг CoSO4 в расчете на 1 растение, вызывавшее почти двукратное увеличение сырой массы корней.
Эффект от внесения больших доз был выражен в меньшей степени, например, при дозе 5 10б масса корней увеличивалась на 184,3%, а при дозах 5 10-5, 5 10-4 - на 129,9 и 115,7% хотя и в этом случае морфологические параметры опытных растений превышали контрольные значения. В ряду возможных причин столь выраженных эффектов стимуляции ростовых процессов ионами кобальта наиболее вероятной представляется дефицит этого элемента в высокогумусированных почвах. Хотя не исключено, что гиперконцентратор ионов железа A. archangelica способен накапливать и близкие по свойствам к ионам железа ионы кобальта, стимулирующие ростовые процессы.
Существенные изменения наблюдались и в накоплении фенольных соединений, в частности кумаринов (рис. 1), синтез которых активизировался при внесении 0,005 мг CoSO4 под одно растение.
Таблица 1. Влияние внесения сульфата кобальта на ювенильные особи A. archangelica (2002 г., осень)
Показатель Контроль Дозы внесенного CoSO4, г
5 10‘б 5 10'5 5 10'4
Количество листьев, шт. 4,14 4,29 4,14 4,57
Длина листьев, см 17,98 28,42 22,15 17,95
Количество листовых долей, шт. 3,28 б,б7 4,75 3,78
Длина листовых долей, см 5,93 7,88 7,44 б,48
Площадь листьев, см2 104,5 312,2 194,4 12б,9
Ширина листовых долей, см 5,37 5,94 5,50 5,18
Масса растения, г 21,93 54,б4 33,00 27,00
Масса надземной части, г 12,3б 37,00 17,71 15,93
Масса корней, г 9,57 17,б4 12,43 11,07
Удержание кумаринов, % 0,21 0,27 0,23 0,17
од .................................................
2ОО215 2ЭОЙ1320О2га29ОаНааОЗЕЗЭОЭе5
Рис. 1. Спектральные характеристики хлороформных) экстрактов корней A. archangelica (по оси ординат -оптическая плотность, по оси абсцисс длина волны). 1 - контроль; 2 - 5 10-6 г; 3 - 5 10-5 г; 4 - 5 10-4 г
Сопоставление спектров хлороформных экстрактов корней дудника показывает, что все они имеют максимумы поглощения, характерные для этой группы веществ, при X 260 и 320 нм. Сопоставление хроматограмм показало наличие шести пятен, одно из которых имело ярко-голубую окраску, а остальные голубую или зеленую, характерную для этой группы веществ. Как следует из рисунка, максимальная оптическая плотность в варианте с внесением сульфата кобальта в дозе 5 10-6 г.
Действие ионов кобальта может быть опосредовано через обмен ауксинов, активизирующих синтез кумаринов [23]. Известно также, что ионы кобальта повышают уровень эндогенных полиаминов в растениях [24]. Наконец, не исключено, что активизация синтеза кумаринов связана с повышением под действием CoSO4 феррохелатазной активности, далее последовательным увеличением концентрации ионов железа, участвующих в цитохромном пути транспорта электронов [25]. В последующем системы, содержащие железопорфириновую простетическую группу - цитохром-Р450-монооксигеназы- псорален- и мармезин-синтетазы, активизируют синтез ароматических бензоидных систем, определяющих специфику фармакологической активности A. archangelica [19].
При этом сами кумарины могут выступать в роли регуляторов роста растений, стимулирующих транслокацию азота из корней в листья, как это отмечается у Triticum durum [26]. Кроме того, кумарины влияют на рост корней, утолщая кортикальные клетки [27].
В варианте с внесением дозы 0,05 и 0,5 мг на 1 растение накопление кумаринов в корнях дягиля снижалось. Это согласуется с результатами модельных экспериментов Дж. Корна с соавторами, показавших, что повышение концентрации CoSO4 в среде вначале вызывает активизацию феррохелатазной активности, а дальнейшее повышение более 40 цМ вызывает ее снижение [25], т.е. рост концентрации ионов Со2+ приводит к изменению активности цитохромных систем, участвующих в синтезе фенольных соединений. Известно, что синтез кумаринов сопряжен с активизацией дыхания [28].
Факт снижения содержания кумаринов в корнях под действием сульфата кобальта в более высоких дозах мы не можем трактовать как эффект от токсического действия, поскольку масса растения при этом оставалась более высокой, чем в контрольном варианте. С нашей точки зрения, это отражает смену фактора, лимитирующего плодородие в данных условиях. на фоне полной обеспеченности растения кобальтом возникает дефицит азота, необходимого для синтеза предшественника кумаринов -фенилаланина, а возможно, и железа.
Аналогичная картина отмечалась и при прямой спектрофотометрии хлороформных экстрактов корней -низкие дозы сульфата кобальта стимулировали накопление кумаринов. Сравнение хроматограмм показало отсутствие принципиальных различий в спектре кумаринов, что позволяет сделать вывод о том, что изменения заключались в увеличении общего количества кумаринов, а не их фракционного состава.
Последствия внесения CoSO4 отражаются и на второй год развития A. Archangelica (табл. 2). Основное изменение касается увеличения площади листьев при неизменном их количестве и массы подземных органов.
Таблица 2. Влияние сульфата кобальта на морфологические параметры растений второго года вегетации (2003 г., июнь)
Показатель Контроль Внесение CoSO4
Количество листьев, шт. 2,7±0,25 2,5±0,28
Длина листьев, см 60,7±10,6 83,6±9,6
Количество листовых долей, шт. 26,0±5,9 31,9±6,05
Длина листовых долей, шт. 9,7±0,2 10,8±0,2
Ширина листовых долей, шт. 4,9±0,2 6,1±0,2
Масса всего растения, г 103,5±19,0 184,5±29,1
Масса надземной части, г 91,6±17,1 157,9±22,9
Масса корней, г 11,9±1,9 26,6±6,2
С хозяйственной точки зрения, особенно важно возрастание массы корней (в 2,2 раза), используемых в фармацевтической и ликероводочной промышленности. Следует отметить, что примененные для стимуляции ростовых процессов дозы сульфата кобальта не представляют опасности для потребителя, так как даже в случае полной транслокации Co2+ в растение (средняя масса которого к моменту уборки урожая 1000 г), потенциальная его концентрация в сырье не превысит 0,005 ПДК [29]. Кроме того, кобальт обладает достаточно низкой подвижностью в тканях растения [30].
Выводы
Внесение сульфата кобальта в дозах 5 10-6, 5 10-5 и 5 10-4 г стимулирует рост корней A. archangelica, масса которых увеличивается в первый год вегетации в 1,8, 1,3 и 1,1 раза соответственно, на второй год вегетации в дозе 5 10-6 в 2,2 раза.
Внесение сульфата кобальта позволяет получать большую массу сырья дягиля с содержанием кумаринов, сопоставимым с контрольным. Более того, снижение содержания кумаринов в корнях при воздействии CoSO4 в дозах более 0,05 мг на 1 растение можно рассматривать как показатель улучшения качества сырья, используемого в пищевых целях, так как высокий уровень содержания этих веществ в продуктах питания неблагоприятен для определенной категории лиц.
Список литературы
1. Патент №589140 США. Phytoestrogen supplement prepared from pomegranate seeds and a herbal mixture or coconut milk / Lamsky E.P. Опубл. 06.04.1999. РЖ Химия. 2000. 00-09-190.190П
2. Заявка №2337200 Великобритания. Sung Smoking substances for use in therapy by inhalation, based on a mixture of a least five medicinal herbs, ginkgo leaves as base and starch syrup/glycerin binders / Bae Oh.; РЖ Химия. 2000.00.11-190-223 П.
3. Yin Z.Z. The ffect of danggui (Angelica sinensis) and its ingredient ferulic acid on rat plateled aggregation and release of 5-HT // Acta pharmaceutica sinica. 1980. V. 15. P. 321.
4. Schonfelder P. Angelicawurzel. DAB//Teedrogen und Phytopharmaka. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft. MBH Stuttgart. 1997. S. 62-65.
5. Han S.-B. et al. Analysis of mineral contents of edible medicinal plants in Korea // Food Sci. Biotechnology. 2001. Vol. 10. №3. P. 225-230.
6. Guh J.H. et al. Antiproliferative effect in rat vascular smooth muscle cells by osthole, isolated from Angelica pubescens // Eur. J. Pharmacol. 1996. V. 298. P. 191-197.
7. Teng C.M. et al. The relaxant action of osthole isolated from Angelica pubescens in guinea-pig trachea // N-S. Arch. Pharmacol. 1994. 349. P. 202-208.
8. Ko F.N. et al. Vasorelaxation of rat thoracic aorta caused by osthole isolated from Angelica pubescens // Eur. J. Pharmacol. 1992. V. 219. P. 29-34.
9. Radix Angelicae sinensis // WHO monographs on selected medicinal plants. 1997. P. 25-34.
10. Wichtl М., Bisset N.G. Herbal drugs and phytopharmaceuticals. Stuttgart: medpharm scientific Publishers. 1997. S. 70-72.
11. Ho-Dzun, H., Knuppffer H., Hammer K. Additional notes to the checklist of Korean cultivated plants (5). Consolidated summary and indexes // Genetic Resources and Grop Evolution. 1997. V. 44. P. 349-391.
12. Gagiotti M.R., Menghini A., Cenci C.A., Pagiotti R. Osservazioni bioritmiche e produttivita'di Angelica archangelica cultivate a differeni altitudini // Ann. Fac. Agr. Perudgia. 1984. V. XXXYIII. P. 297-300.
13. Bourgaurd F., Gravot A., Milesi S., Gontier E. Production of plant secondary metabolies: a historical perspective // Plant Science. 2001. V. 161. P. 839-851.
14. Tremblay N, Michaud M.H., LaFlamme L. Optimization of angelica planting densities and production cycles for medicinal purposes // ISHS Acta Horticulturae 390: Internet. Symposium on Medicinal and Aromatic Plants.
15. Школьник М.Я. Микроэлементы в жизни растений. Л., 1974. 269 с.
16. Lau O.L., Yang S.F. Inhibition of ethylene production by cobaltous ion // Plant Physiology. 1976. V. 58. P. 114-117.
17. Болдырева Я.А., Величко Н.А. Влияние элементов минерального питания на рост каллусной ткани и синтез алкалоидов в культуре ткани катарантуса розового // Биотехнология. 2003. №1. С. 53-62.
18. Trejo-Tapia, G., A. Jimenez-Aparicio, et al. Influence of cobalt and other microelements on the production of betalains and the growth of suspension cultures of Beta vulgaris // Plant Cell Tissue and Organ Culture. 2001. V. 67. №1. P. 19-23.
19. Knaggs A.R. The biosynthesis of shikimat metabolites // Nat. Prod. Rep. 1999. V. 16. P. 525-560.
20. Lovkova M.Ya., Buzuk G.N., Sokolova S.M., Kliment'eva N.I. Chemical features of medicinal plants (Review) // Applied biochemistry and microbiology. 2001. Vol. 37. №3. P. 229-237.
21. Tyler G., Zohlen A. Plant Seeds as Mineral Nutrient Resource for Seedlings DA Comparison of Plants from Calcareous and Silicate Soils // Annals of Botany. 1998. V. 81. P. 455-459.
22. Hauffe K.D., Hahlbrock K., Scheel D. Elicitor-stimulated furanocoumarin biosynthesis in cultured parsley cells: S-
adenosyl-L-methionine: bergaptol and S-adenosyl-L-methyonine: xanthhotoxol O-methyltransferase // Z.
Naturforschung. 1985. V. 41. S. 228-239.
23. Siatka T, Kasparova M. Effect of auxins on production of coumarin in a suspension culture of Angelica archangelica L. // Ceska Slov. Farm. 2003. Jul. 2(4). P. 186-188.
24. Locke J.M., Bryce J.H., Morris P.C. Contrasting effects of ethylene perception and biosynthesis inhibitors on germination and seedling growth of barley (Hordeum vulgare L.) // J. of experimental botany. 2000. V. 51. №352. P. 1843-1849.
25. Cornah J.E. et al. Measurement of ferrochelatase activity using a novel assay suggests that plastids are the major site of haem biosynhesis in both photosynthetic and non- photosynthetic cells of pea (Pisum sativum L.) // Biochem. J. 2002. V. 362. P. 423-432.
26. Abenavoli1 M. R.et al. Influence of coumarin on the net nitrate uptake in durum wheat // New Phytol. V. 150. №3. P. 619-627.
27. Kupidlowska E., Kowalec M., Sulkowski G., Zobel A. M. The effect of coumarins on root elongation and ultrastructure of meristematic cell protoplast // Annals of Botany. 1994. V. 73. P. 525-530.
28. Zangerl A.R., Anntz A.M., Berenibaum M.R. Physiological price of a induced chemical defense: photosynthesis, respiration, biosynthesis and growth // Oecologia. 1997. V. 109. №3. P. 433-441.
29. Амосова Н.В., Тазина И.А., Сынзыныс Б.И. Фито- и генотоксическое действие ионов железа, кобальта и никеля на физиологические показатели растений различных видов // Сельскохозяйственная биология. 2003. №5. С. 49-54.
30. Adauco B. Pereira. Netto. Effect of inhibitors of ethylene biosynthesis and signal transduction path-way on the multiplication of in vitro grown Harcornia spesiosa //Plantacea, Tissue and organ culture. 2001. V. 66. P. 1-7.
Поступило в редакцию 10 февраля 2004 г. После переработки 8 апреля 2004 г.
