CC BY
72
УДК 615.27:577.125:616.33
О. П. Родина, И. Я. Моисеева
ВЛИЯНИЕ ВИТАМИНА Е НА СОСТОЯНИЕ ОКСИДАНТНОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ, АКТИВНОСТЬ ФОСФОЛИПАЗЫ А2 НА МОДЕЛИ СТРЕССОВОГО УЛЬЦЕРОГЕНЕЗА
Изучено состояние оксидантной и антиоксидантной системы, активность фосфолипазы А2 в тканевых структурах желудка и тонкой кишки при действии стрессового ульцерогенного фактора на фоне введения витамина Е. Были выявлены значительные изменения изученных показателей. Данные экспериментального исследования свидетельствуют о том, что воздействие стрес-сорного ульцерогенного фактора способствует изменению состояния окси-дантной и антиоксидантной систем, активности фосфолипазы А2 в ткани желудка и тонкой кишки, что свидетельствует о развитии при этом оксидативно-го стресса. Введение витамина Е стабилизирует процессы пероксидации липидов, сдерживает разрушение мембранных структур слизистой оболочки желудка и тонкой кишки, тем самым препятствует массивному образованию язвенных дефектов.
Пролиферативные и секреторные процессы в слизистой оболочке гастродуоденальной зоны в норме и при патологии сопровождаются изменением активности перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты (АОЗ) [1-3].
Активация ПОЛ является стимулом для индукции системы АОЗ - совокупности ферментативных и других факторов, обеспечивающих защиту клеток от свободных радикалов [4-6]. При язвенной болезни существенно изменяется функциональная активность системы АОЗ: в сыворотке крови увеличивается содержание церулоплазмина, малонового диальдегида, диеновых конъюгатов, оснований Шиффа, гидроперекисей липидов и ке-тонов, повышается активность каталазы наряду со снижением содержания супероксиддисмутазы, глутатиона, что говорит об усилении процессов ПОЛ [7]. Снижение содержания а-токоферола в сочетании с ростом содержания вторичного продукта ПОЛ при язвенной болезни наблюдали Г. Ч. Махакова и Л. П. Сыбденова [8].
В регуляции различных физиологических процессов важная роль отводится и фосфолипазе А2, которая поддерживает необходимый уровень арахи-доновой кислоты. На активность фосфолипазы А2 влияет фазовое состояние биомембраны, определяемое структурой фосфолипидов, содержанием холе-стерола, природой белков, фосфорилированием фермента. Изменение структурного состояния биомембран при активации ПОЛ приводит к тому, что каталитическая активность фосфолипазы А2 резко возрастает [9].
Учитывая вышесказанное, целесообразно включение в комплексную терапию биоантиоксидантов с высокой антирадикальной активностью, к которым относятся, например, витамины - антиоксиданты Е, С и А и микроэлемент селен [10].
В данной работе представлен фрагмент результатов экспериментальных исследований по изучению роли антиоксидантов в процессе язвообразо-вания на фоне действия стрессового ульцерогенного фактора.
Материалы и методы исследования
В основу работы положены экспериментальные исследования на 40 половозрелых белых крысах обоего пола средней массой 200-250 г. На экспериментальных животных при моделировании «стрессовой» язвы исследовали процесс ульцерогенеза, а также интенсивность процессов ПОЛ тканевых структур желудка, тонкой кишки.
Моделирование язвенных дефектов производили по способу С. В. Аничкова и И. С. Заводской (1965). Крыс не кормили в течение 24 ч, затем фиксировали на доске в положении лежа на спине при пониженной температуре окружающей среды до 12 ч, вводили в передние лапы игольчатые электроды и в течение 3 ч раздражали импульсами электротока от стимулятора ППМ-1 при напряжении 5-10 В, частоте 50 Гц, продолжительностью импульса 50 мс.
Через 12 ч животных выводили из опыта путем передозировки эфирного наркоза. Производили лапаротомию и биопсию желудка и тонкой кишки. При вскрытии оценивали состояние слизистой оболочки желудка, тонкой кишки, определяли характер ее повреждений, которые подразделяли на точечные кровоизлияния, эрозии и язвы. Дифференциальную диагностику изменений со стороны слизистой оболочки желудка и тонкой кишки осуществляли при помощи бинокулярной лупы с 6-кратным увеличением, а также путем микроскопических исследований: микропрепараты подвергались окраске гематоксилин-эозином. Для каждого вида повреждений слизистой оболочки рассчитывали «язвенный индекс» Паулса. В опытной группе животных для исследования влияния на показатели ульцерогенеза и активности ПОЛ включили препарат, обладающий антиоксидантным действием - 10% раствор альфа-токоферола (витамина Е) в масле из расчета 5 мг/кг массы тела внутримышечно.
В работе применялись следующие методы исследования.
1. Содержание малонового диальдегида (МДА) оценивали в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Для определения антиокислительной активности липидов предварительно проводили индукцию липопереокисления раствором сульфата железа в концентрации 5 мкмоль в течение часа.
2. Активность каталазы определяли фотометрическим методом, основанным на способности перекисей образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине 410 нм. Активность каталазы выражали в мг Н2О2/мин/г белка.
3. Определяли активность супероксиддисмутазы (СОД) в реакции с нитросиним тетразолием (Гуревич В. С. и др., 1990).
4. Определение активности фосфолипазы А2. Активность фосфолипа-зы А2 оценивали в среде, содержащей 10 ммоль трис-ЫСЬ-буфер (pH = 8,0), 150 ммоль тритон Х-100, 10 ммоль CaCl2 и субстрат (1,2 ммоль). В качестве субстрата использовали фосфатидилхолины яичного желтка. Регистрацию каталитической деятельности фермента проводили титрометрическим методом по мере образования свободных жирных кислот. Расчет проводили по калибровочной кривой, построенной по пальмитиновой кислоте, и выражали в мкмоль/с/г белка (Трофимов В. А., 1999).
Основные результаты исследования
Опытной группе животных на фоне действия стрессового ульцероген-ного фактора вводили витамин Е в дозе 5 мг/кг внутримышечно трехкратно: за 2 ч до их фиксации, через 2 и 6 ч после фиксации.
Степень выраженности нарушений липидного гомеостаза при действии на организм стрессового фактора обусловлена увеличением активности ПОЛ и фосфолипазы А2, а также изменением состояния антиоксидантной системы. Поэтому анализ указанных изменений может служить критерием оценки проводимой терапии.
Витамин Е, обладающий антиоксидантным действием, способствовал предупреждению развития липидного дистресс-синдрома при действии стрессового ульцерогенного фактора. Как показал эксперимент, под действием этого витамина снижалась скорость свободнорадикальных реакций и фосфолипазная активность, а также возрастал антиоксидантный потенциал.
При анализе морфологических изменений слизистой оболочки желудка на фоне введения витамина Е у всех животных отмечались точечные кровоизлияния, но по отношению к контролю количество кровоизлияний уменьшилось на 46,25% (р < 0,05), хотя индекс Паулса при этом не изменился. Эрозии на слизистой оболочке желудка наблюдались в 80% случаев. Их количество по сравнению с контролем снизилось на 75,86% (р < 0,05). Индекс Паулса для эрозий уменьшился в 5,3 раза и составил 1,09. Язвенные дефекты отмечались в 95% случаев, и их число по отношению к контрольной группе также снизилось на 63,16% (р < 0,05), а индекс Паулса уменьшился в 2,9 раза и был равен 1,31.
При исследовании состояния слизистой оболочки тонкой кишки деструкции определялись у всех экспериментальных животных группы. Однако по сравнению с контрольной группой количество кровоизлияний уменьшилось на 64,37% (р < 0,05), а индекс Паулса уменьшился в 2,8 раза и составил для данного вида повреждений 7,50. Число эрозий по отношению к контрольным показателям снизилось на 65,84% (р < 0,05), а значение индекса Паулса уменьшилось в 2,9 раза и составило 5,51. Зарегистрировано, что по сравнению с контрольными показателями количество язв снизилось на 57,27% (р < 0,05) и индекс Паулса уменьшился в 2,3 раза и был равен 4,69.
Следовательно, использование витамина Е на модели стрессового ульце-рогенеза действительно приводит к снижению количества деструктивных поражений слизистой оболочки желудка и тонкой кишки.
При включении в эксперимент витамина Е в тканях желудка отмечалось по сравнению с контролем уменьшение уровня МДА на 10,42% (р < 0,05), Fe-МДА на 40,84% (р < 0,05) и активности фосфолипазы А2 на 48,96% (р < 0,05) (таблица 1). Активность СОД увеличилась на 70,75% (р < 0,05), активность каталазы же не изменилась. Выявлено достоверное изменение исследуемых показателей по отношению к норме (рис. 1) (исходные данные приняты за 100%, звездочкой отмечены данные, достоверно измененные по отношению к норме).
Таблица 1
Показатели ПОЛ, АОЗ и активности фосфолипазы А2 в тканевых структурах желудка на модели стрессового ульцерогенеза при применении витамина Е (М ± т)
Показатель Норма Контрольная группа Опытная группа
МДА (нМоль/г белка) 2,39 ± 0,06 8,23 ± 0,15* 4,34 ± 0,24*
Бе-индуцированный МДА (нМоль/г белка) 3,42 ± 0,09 12,44 ± 0,24* 7,36 ± 0,31*
Активность фосфолипазы А2 (мкмоль/с/г белка) 0,73 ± 0,022 1,92 ± 0,047* 0,98 ± 0,038*
Активность каталазы (мг Н2О2/мин/г-белка) 1,63 ± 0,04 2,71 ± 0,12* 2,79 ± 0,18*
Супероксиддисмутаза (усл. ед. /мг белка) 6,21 ± 0,14 3,18 ± 0,18* 5,43 ± 0,14*
* Достоверность изменений по отношению к норме при р < 0,05; жирный шрифт - достоверность изменений по отношению к контролю при р < 0,05.
450 П 400 -350 -300 -250 -
%
200 -150 -100 -50 -0 -
МДА РеМДА Каталаза ФЛА2 СОД
□ Норма □ Модель □ Опыт
Рис. 1 Показатели ПОЛ, АОЗ и активности фосфолипазы А2 желудка под влиянием витамина Е на модели стрессового ульцерогенеза
Аналогичные изменения наблюдались и в тканях тонкой кишки: по сравнению с контрольной группой выявлено снижение содержания МДА на 43,60% (р < 0,05), Бе-индуцированного МДА на 44,29% (р < 0,05), уменьшение активности фосфолипазы А2 на 28,38% (р < 0,05), увеличение активности СОД на 59,06% (р < 0,05). Однако отмечено изменение активности каталазы: ее уровень снизился на 19,55% (таблица 2). По отношению к норме изученные показатели достоверно изменились (рис. 2) (Исходные данные приняты за 100%, звездочкой отмечены данные, достоверно измененные по отношению к норме).
Таблица 2
Показатели ПОЛ, АОЗ и активности фосфолипазы А2 в тканевых структурах тонкой кишки на модели стрессового ульцерогенеза при применении витамина Е (M ± m)
Показатель Норма Контрольная группа Опытная группа
МДА (нМоль/г белка) 2,35 ± 0,07 6,33 ± 0,18* 3,57 ± 0,26*
Fe-индуцированный МДА (нМоль/г белка) 4,12 ± 0,06 10,25 ± 0,27* 5,71 ± 0,24*
Активность фосфолипазы А2 (мкмоль/с/г белка) 1,11 ± 0,019 2,52 ± 0,064* 1,83 ± 0,048*
Активность каталазы (мг Н2О2/мин/г-белка) 3,37 ± 0,13 5,37 ± 0,28* 4,32 ± 0,22*
Супероксиддисмутаза (усл. ед. /мг белка) 9,54 ± 0,24 5,08 ± 0,34* 8,08 ± 0,39*
* Достоверность изменений по отношению к норме при р < 0,05; жирный шрифт - достоверность изменений по отношению к модели при р < 0,05.
300 -250 -200 -% 150 -100 -50 -0 -
Рис. 2 Показатели ПОЛ, АОЗ и активности фосфолипазы А2 тонкой кишки под влиянием витамина Е на модели стрессового ульцерогенеза
Резюмируя проведенные экспериментальные исследования, можно сделать вывод, что витамин Е обладает антиульцерогенным эффектом. Появление такого рода фармакологического эффекта становится возможным благодаря наличию у данного препарата способности восстанавливать нарушенный липидный метаболизм (мембраностабилизирующий эффект). Как показал эксперимент, витамин Е вызывает уменьшение интенсивности ПОЛ и фосфолипазной активности, повышает антиоксидантный потенциал тканей исследованных органов, что способствует коррекции нарушений обмена липидов, развивающихся при действии стрессового ульцерогенного фактора.
Следовательно, полученный фактический материал показывает, что использование витамина Е на модели стрессового ульцерогенеза достоверно приводит к снижению количества деструктивных поражений слизистой оболочки желудка и тонкой кишки.
МДА
FeМДА Каталаза
□ Норма □ Модель □ Опыт
ФЛА2
СОД
Выводы
1. При действии стрессового ульцерогенного фактора в слизистой оболочке желудка и тонкой кишки развиваются существенные модификации липидов, сопровождающиеся интенсификацией процессов ПОЛ и активизацией фосфолипазы А2.
2. Использование витамина Е (5 мг/кг) на модели стрессового ульцеро-генеза приводит к уменьшению выраженности поражений слизистой оболочки желудка и тонкой кишки.
3. Антиульцерогенный эффект препаратов сопровождается снижением в исследованных тканевых структурах интенсивности свободнорадикальных реакций процессов ПОЛ и уменьшением активности фосфолипазы А2.
Список литературы
1. Вайнштейн, С. Г. Роль катехоламинов в возникновении поражений слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки у больных периодической болезнью / С. Г. Вайнштейн, Ф. А. Завершхановский, Г. П. Гривенко // Тер. арх. - 1987. -№ 2. - С. 26-28.
2. Корочкин, И. М. Лечение язвенной болезни гастродуоденальной зоны антиоксидантом дибунолом и изменение уровня антиокислительной активности липидов эритроцитов в крови больных в процессе лечения / И. М. Корочкин,
B. Г. Башкатова, М. В. Пославский // Тер. арх. - 1984. - № 12. - С. 88-90.
3. Куликов, В. Ю. Реакция перекисного окисления липидов в эритроцитах крови и некоторые системы их регуляции у больных язвенной болезнью / В. Ю. Куликов, В. В. Ермолаева, Л. В. Мамонтова [и др.] // Вопр. мед. химии. - 1981. - № 6. -
C. 463-465.
4. Архипенко, Ю. В. Свободнорадикальное окисление при гипоксии и ре-оксигенации: плюсы и минусы / Ю. В. Архипенко, Т. Г. Сазонова // Свободные радикалы и болезни человека : сборник трудов Национальной научн.-практ. конф. с международным участием. - Смоленск, 1999. - С. 21-22.
5. Papas, A. M. Determination of antioxidant status in humans / A. M. Papas // Lipids. -1996. - V. 31. - P. 77-82.
6. Владимиров, Ю. А. Свободные радикалы и антиоксиданты / Ю. А. Владимиров // Вестник РАМН. - 1998. - № 7. - С. 43-51.
7. Подопригорова, В. Г. Роль свободнорадикального окисления липидов и ан-тиоксидантных систем в патогенезе и саногенезе язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, возможности коррекции антиоксидантами : дис. ... д. мед. наук / В. Г. Подопригорова. - М., 1998.
8. Махакова, Г. Ч. Применение противоязвенного сбора в терапии язвенной болезни / Г. Ч. Махакова, Л. П. Сыбденова // Человек и лекарство : тез. докл. VIII Рос. нац. конгр. - М., 2001. - С. 171.
9. Власов, А. П. Роль нарушений липидного гомеостаза в патогенезе перитонита / А. П. Власов, В. А. Трофимов, Р. З. Аширов // Саранск, 2000. - 207 с.
10. Сейфулла, Р. Д. Проблема фармакологии антиоксидантами. Классификация препаратов / Р. Д. Сейфулла, И. Т. Борисова // Фармакология и токсикология. -1990. - № 6. - С. 3-10.
