CC BY
74
УДК [664.951.014:577.15]: 547.995.12
М. Д. Мукатова, Алаа Эльдин Мухаммед Юнес
ВЛИЯНИЕ ВИДА И ДОЗЫ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ХИТОЗАНА
Введение
Хитин (поли-К-ацетил-В-Б-глюкозамин) является высокоупорядоченным кристаллическим полисахаридом с Р-гликозидными связями, одним из наиболее распространенных в природе. Самое простое и распространенное производное хитина - хитозан, частично или полностью деацетилированный [1].
Молекулярная масса (ММ) является очень важной характеристикой как природных, так и синтетических полимеров. Молекулярная масса хитина и хитозана зависит от источника их получения и условий деацетилирования [2].
В зависимости от источника и способа получения хитозана его ММ составляет от сотен тысяч до нескольких миллионов Да, а ММ хитина - от нескольких миллионов Да и выше [2].
В настоящее время известны три основных способа получения низкомолекулярного хитозана: химический, физический и ферментативный. Наибольший интерес представляет ферментативный способ, сохраняющий исходную природную структуру хитозана.
Разработке способа получения хитозана с низкой ММ уделяется большое внимание [3]. Низкомолекулярные хитозаны обладают, как правило, более высокой биологической активностью по сравнению с высокомолекулярными [4-5]. В качестве ферментных препаратов для деградации хитина и хитозана применяют комплексы ферментов различного происхождения.
Материалы и методы исследования
Цель исследования состояла в изучении влияния вида и дозы ферментных препаратов на физико-химические показатели хитозана. Из цели вытекали следующие задачи:
- изучение органолептических показателей хитозана;
- исследование физико-химических показателей хитозана;
- гидрирование хитозана разными ферментными препаратами;
- установление изменений ММ хитозана в процессе гидрирования разными дозами ферментных препаратов;
- исследование изменения вязкости хитозана в процессе гидрирования ферментными препаратами.
В наших исследованиях ферментативный гидролиз высокомолекулярного хитозана был осуществлен с помощью протеолитических ферментных препаратов: папаина и протосубтилина.
Исходный хитин был получен из панциря речных раков деминерализацией кислотой, де-протеинированием жидким ферментным препаратом, полученным из желудочной ткани рыбы, с последующей щелочной доочисткой от остатков белковых веществ.
Исходный хитин, максимально очищенный от примесей белковых и минеральных веществ, был гидрирован для получения хитозана обработкой 50 %-м раствором щелочи.
Результаты исследований и их обсуждение
Органолептические и физико-химические показатели полученного хитозана приведены в табл. 1.
Данные табл. 1 свидетельствуют о том, что в результате гидрирования хитина концентрированным раствором щелочи (50 %-м) полученный хитозан имеет ММ 172 кДа, степень деацетилирования - 77 % при содержании, %: воды - 5,8, азотистых веществ - 0,92, минеральных веществ - 0,22. Такой хитозан является высокомолекулярным и не может иметь широкого спектра применения.
Таблица 1
Органолептические и физико-химические показатели хитозана
Показатели Органолептические Физико-химические
Цвет Светло-кремовый
Запах Без запаха
Размеры частиц, мм 2,5
Плотность, кг/м3 0,2
Содержание, %:
воды 5,8
азотистых веществ (К х 6,25) 0,92
минеральных веществ 0,22
Молекулярная масса, кДа 172
Степень деацетилирования, % 77
Растворимость в уксусной кислоте, % 91,8
Вязкость 1 %-го раствора в уксусной кислоте, мм2/с 3,9
Для получения низкомолекулярного полимера из высокомолекулярного хитозана был приготовлен 1 %-й раствор с использованием 0,2 М ацетатного буфера, имеющего pH 5,0. В полученный раствор были внесены папаин и протосубтилин в дозах 1, 2, 3 % соответственно. Нагрев осуществляли при температуре 52 °С в течение 8 часов. В процессе гидрирования через каждый час определяли ММ и вязкость 1 %-го раствора хлопьевидного осадка в уксусной кислоте. На рис. 1 приведена модель технологической схемы получения низкомолекулярного хитозана.
Приготовление раствора высокомолекулярного хитозана в ацетатном буфере - pH 5,0.
4
Внесение сухого ферментного препарата
4
Термостатирование при ґ = 52 °С в течение 8 часов
4
Фильтрат ^ Фильтрование (центрифугирование)
4
Сточные воды ^ Промывка осадка водой до pH 7,0 при гидромодуле 1:12
4
Высушивание при ґ = 35 °С
4
Низкомолекулярный хитозан Рис. 1. Модель технологической схемы получения низкомолекулярного хитозана
Определение органолептических и физико-химических свойств является очень важным для характеристики хитозана. Степень депротеинирования и деминерализации определяет такие физико-химические характеристики хитозана, как вязкость и растворимость.
В табл. 2 показано изменение ММ исходного хитозана в процессе гидрирования разными дозами папаина и протосубтилина в течение 8 часов.
Таблица 2
Изменение ММ хитозана в процесс гидрирования ферментными препаратами
Продолжительность, ч Доза ферментных препаратов, %
1,0 | 2,0 | 3,0
ММ, кДа
Папаин Протосубтилин Папаин Протосубтилин Папаин Протосубтилин
0 172 172 172 172 172 172
1 131 158 120 138 82 108
2 110 121 105 112 73 91
3 90 103 88 93 49 76
4 83 90 67 82 37 56
5 66,5 86 45 60 19,5 44
6 64 83 43 58 19,5 31
7 64 83 43 58 19,5 31
8 64 83 43 58 19,5 31
Согласно данным табл. 2, в результате гидрирования исходного хитозана с ММ 172 кДа ММ уменьшается в зависимости от дозы фермента и продолжительности процесса гидрирования. Выявлено, что ферментный препарат папаин более эффективен в процессе гидрирования хитозана. Через 5 часов гидрирования хитозана папаином при дозе 1, 2, 3 % его ММ уменьшается до 66,5, 45,0 и 19,5 кДа соответственно. Протосубтилин в тех же дозах уменьшает ММ хитозана за указанное время гидрирования до 86,0; 60,0; 44,0 кДа соответственно.
После 6 часов гидрирования продолжение процесса до 8 часов не изменяет ММ, независимо от вида препарата и его дозы. Исключение составляет доза папаина 3 %, которая способствует уменьшению ММ до 19,5 кДа в течение 5 часов гидрирования.
Интерес представляло также исследование изменения вязкости 1 %-го раствора гидрированного хитозана в зависимости от вида, дозы ферментных препаратов и продолжительности процесса гидрирования (рис. 2, 3).
-Доза 1 % -Доза 2 % -Доза 3 %
Время, ч
Рис. 2. Изменение вязкости раствора хитозана в процессе гидрирования разными дозами папаина
♦ Доза 1 % -А—Доза 2 % -Щ—Доза 3 %
Время, ч
Рис. 3. Изменение вязкости раствора хитозана в процессе гидрирования разными дозами протосубтилина
Характер кривых на рис. 2 и 3 свидетельствует об уменьшении вязкости 1 %-го раствора хитозана с увеличением дозы ферментного препарата. После 5 часов гидрирования вязкость раствора хитозана, так же как и его ММ, при всех дозах папаина остается неизменной (рис. 2). Вязкость раствора хитозана, гидрированного протосубтилином, остается неизменной при всех дозах после 6 часов гидрирования (рис. 3).
Заключение
Таким образом, в ходе исследований:
1. Установлена возможность получения низкомолекулярного хитозана с применением разных доз ферментных препаратов папаина и протосубтилина.
2. Выявлено, что дозу ферментного препарата для получения низкомолекулярного хитозана необходимо выбирать в зависимости от вида фермента и назначения полимера для применения. Для получения полимера с ММ ниже 100 кДа достаточна продолжительность гидрирования 6 часов при дозе ферментов не более 1 %; при увеличении дозы ферментов до 2 % возможно получение полимера с ММ 45-60 кДа за указанное время гидрирования; получение полимера с ММ менее 20 кДа возможно за 5 часов гидрирования при дозе папаина 3 %.
3. Определено, что с уменьшением ММ хитозана в процессе гидрирования вязкость 1 %-го раствора снижается и стабилизируется после 5 часов гидрирования при использовании папаина, 6 часов - протосубтилина.
При необходимости получения низкомолекулярного хитозана, используемого в качестве структурообразователя, низкая вязкость 1 %-го раствора неприемлема, поэтому процесс гидрирования следует осуществлять при дозе ферментов не более 1 % продолжительностью 5-6 часов в зависимости от вида ферментного препарата.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Lim S. H., Hudson S. M. Application of a fiber-reactive chitosan derivative lo cotton fabric as an antimicrobial textile finish // Carbohydr. - Polym. - 2004. - Vol. 56. - P. 227-234.
2. Получение многофункционального низкомолекулярного хитозана и его применение в косметике / С. Б. Сео, Ч. С. Рго, Х. Б. Ким и др. // Косметическая химия. - 2003. - № 1. - С. 26-30.
3. Purification and characterization of chitosanase from Bacillus sp. strain KCTC 0377BP and its application for the production of chitosan oligosaccharides / Y. I. Choi, E. J. Kim, Z. Piao et al. // Appl. Environ. Microbiology. - 2004. - Vol. 70, N 8. - P. 4522-4531.
4. Rhoades J., Roller S. Anlimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - Vol. 66, N 1. - P. 80-86.
5. Kittur F. S., Kumar A. B.V., Tharanalhan R. N. Low molecular weight chitosans - preparation by depolymerization with Aspergillus ttiger pectinase, and characterization // Carhohydr. Res. - 2003. - Vol. 338. -P. 1283-1290.
Статья поступила в редакцию 13.04.2009
INFLUENCE OF TYPES AND DOSES OF ENZYMATIC AGENTS ON THE PHYSICAL AND CHEMICAL PROPERTIES OF CHITOSAN
M. D. Mukatova, Alaa Eldin Mokhamed Yunes
The results of the investigation on fixing the possibility of hydrogenation of high-molecular chitosan of crayfish crust by means of enzymatic agents of two types: papain and protosubtilin are given. The hydrogenation of chitosan was made by introduction of different enzyme doses at pH 5.0 and temperature 52 °C during 8 hours. It was stated that for obtaining low-molecular weight of chitosan at the given parameters the process of hydrogenation should take 5-6 hours at doses 1-3 %. After 6 hours of hydrogenation the continuation of the process up to 8 hours does not change the molecular weight of chitosan irrespective of the type of the agent and its dose. However, the reduction of the molecular weight of chitosan leads to the reduction of the viscosity of 1 % polymer solution, that is inadmissible for its use as an amendment.
Key words: chitin, chitosan, high-molecular, low-molecular, molecular weight, hydrogenation, papain, protosubtilin, solution viscosity.
