CC BY
16
трического анализа (ГХ-МС и ЖХ-МС). Они основаны на пересчете индексов (для ГХ-МС) или времен (ЖХ-МС) удерживания при условии комбинированной оценки достоверности получаемых результатов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве основы для создания поисковых библиотек, адаптированных для принятых хроматографических условий, и в условиях отсутствия стандартных соединений были приняты следующие информационные продукты.
- Для ГХ-МС.
1. MPW Edition 2011 (Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, STM Databases, Weinheim, 2011).
- Для ЖХ-МС.
2. Toxtyper 1.1 Library (https://www.bruker.com/products/ mass-spectrometry-and-separations/lc-ms/ion-trap/toxtyper/ overview.html).
3. LC-MCn Library of Drugs, Poisons, and Their Metabolites (Maurer H., Wissenbach D. K., Weber A. A. Wiley-VCH KgGA. 2014).
4. Broecker, Herre and Pradst Accurate Mass Spectral Library (Agilent Technologies. Application Note 5990-6419EN).
Основными принципами, применяемыми при адаптации библиотек, были:
- пересчет индексов удерживания при изменении температурных условий разделения (крутизна температурного градиента и/или конечная температура разделительной колонки), а также вида хроматографической фазы на основе линейного уравнения (для ГХ-МС);
- пересчет времен удерживания при изменении вида концентрационного градиента на основе корреляции с удерживанием веществ, принятых в качестве маркеров изменения удерживания (для ЖХ-МС);
- принятие решений об истинно-положительном обнаружении ксенобиотиков или их производных на основе непротиворечивости результатов, получаемых с применением разных ХМС систем (в том числе, использующих разные физико-химические принципы разделения и разные принципы регистрации спектров);
- учете химического и биохимического поведения ксенобиотиков и их производных.
Пересчет индексов удерживания (ГХ-МС) позволял получать верные и практически значимые результаты для более чем б3 % и около 70 % случайно выбранных анали-тов (при допустимом отклонении ±2 % и ±4 ед. индекса) при смене хроматографической фазы с неполярной (HP-1) на слабополярную (HP-5ms). При смене температурных условий разделения верные результаты получали для более 70 % и около 80 % случайно выбранных аналитов (при допустимом отклонении ±0,5 % и ±1 ед. индекса). Этот результат в целом, можно считать достаточным при обязательном условии хорошего совпадения получаемых масс-спектров с библиотечными. Его подтверждение методом ЖХ-МС желательно при отсутствии дополнительной информации об образце (включающую, в частности, обнаружение производных и/или метаболитов).
Пересчет времен удерживания (для ЖХ-МС) позволял получать отклонение менее ±0,8 мин, что является достаточным для достоверного обнаружения при соответствии спектров МС2, МС3 (для ионной ловушки) и точных масс ионов-прекурсоров и ионов-продуктов (для квадру-поль-времяпролетного масс-спектрометра).
ВЫВОДЫ
Поисковые ХМС-библиотеки могут быть адаптированы для их использования в условиях, принятых в лаборатории. Для пересчета удерживания применимы эмпири-
ческие корреляционные методы. Необходимым условием практического использования адаптированных поисковых библиотек следует считать критичный подход к результатам положительных обнаружений и, в ряде случаев, необходимость проведения подтверждающих анализов.
влияние вида
электрораспылительного ионного источника на обнаружение-целевых аналитов в моче методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии с приминением анализатора bruker toxtyper
С.И. Реброва1, А.М. Григорьев2, Н.А. Крупина1,2
• 1Бюро судебно-медицинской экспертизы Московской области (нач. - д.м.н., проф. В. А. Клевно)
• 2Кафедра судебной медицины (зав. -д.м.н., проф. В. А. Клевно) ФУВ ГБУЗ МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского
• Аннотация: Доклад посвящен обнаружению наркотических средств, лекарственных веществ и их метаболитов с помощью автоматизированного анализатора Bruker ToxTyper с использованием стандартного источника для ионизации электрораспылением и источника IonBooster, фокусирующего поток при электрораспылении. Работа проводилась с использованием поверочных контролей мочи человека с целевыми значениями компонентов (Medidrug® Drug U-Confirmation cut-off -25 % и Medidrug® Drug U-Confirmation cut-off +25 %o). Величины пороговых концентраций (cut-off) определены EWDTS (Европейским обществом по тестированию на наркотики).
• Ключевые слова: LC-MS, ионная ловушка, IonBooster, ToxTyper, моча, скрининг, судебная токсикология
ВВЕДЕНИЕ
Жидкостные хромато-масс-спектрометры (ХМС), имеющие в своем составе узел, использующий принципы работы ионных ловушек, используются для обзорного (скринингового) анализа сложных образцов. В 2015 году в судебно-химическом отделе ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» внедрен в практическую работу ХМС-анализатор ToxTyper, позволяющий определять более 900 токсикологически важных веществ в автоматическом режиме. Важным усовершенствованием анализатора, предлагаемым его изготовителем (Bruker Daltonics), является новый электрораспылительный ионный источник (IonBooster), позволяющий увеличивать количество вещества, попадающего в масс-спектрометр за счет фокусирования потока в процессе электрораспыления, и, следовательно, увеличивать чувствительность определения и вероятность обнаружения аналитов.
Целью исследования было сравнение вероятностей идентификации ряда аналитов, выполняемое при использовании двух источников - стандартной модели и IonBooster, а также оптимизация подготовки проб при учете вида применяемого источника.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для исследования применяли два анализатора, состоящих из хроматографов UltiMate 3000 с колонкой Acclaim RSLC 120 C18 (2,1x100 мм, 2,2 мкм) (Thermo Fisher Scientific) и масс-спектрометров AmaZon Speed (ионная
ловушка, Bruker Daltonic). Разделение выполняли при градиентном элюировании двумя фазами: А (1 % об. ацето-нитрила, 0,1 % об. муравьиной кислоты, 2 мМ формиата аммония в воде) и В (1 % об. воды, 0,1 % об. муравьиной кислоты, 2 мМ формиата аммония в ацетонитриле). Объем вводимой пробы 5 мкл. Масс-спектрометр использовали в режиме UltraScan с изменением полярности; регистрация спектров МС1-МС3 (Target MSMS). Режим фрагментации standard; амплитуда фрагментации 0,8 В, модуляция 40-250 %, время 40 мс. Один анализатор был оборудован стандартным источником для электрораспылительной ионизации, второй - источником IonBooster, фокусирующим поток при электрораспылении. Все условия настройки ХМС систем соответствовали тем, что были рекомендованы методическими указаниями ToxTyper. Сбор данных осуществляли в информационно-зависимом автоматическом режиме. Для идентификации обнаруживаемых соединений пользовались библиотекой ToxTyper 1_1 Library, содержащей масс-спектры МС1-МС3 и времена удерживания аналитов.
Для приготовления модельных растворов использовали поверочные контроли мочи человека, содержащие амфетамин, метамфетамин, 3,4-метилендиоксиамфе-тамин (MDA), 3,4-метилендиокси-Ы-этиламфетамин (MDEA), 3,4-метилендиоксиметамфетамин (MDMA), Ы-метил-1-(3,4-метилендиоксифенил)-2-бутанамин (MBDB), секобарбитал, 7-аминофлунитразепам, бромазе-пам, оксазепам, нордиазепам, золпидем, 11-нор-Д9-ТГК-карбоновую кислоту, бензоилэкгонин, экгонин метиловый эфир, морфин, кодеин, дигидрокодеин, 6-моноацетил-морфин, метадон, EDDP (2-этилиден-1,5-диметил-3,3-дифенилпирролидин), бупренорфин, норбупренорфин, пропоксифен, ЛСД (диэтиламид лизергиновой кислоты), метаквалон, фенциклидин (всего 28 соединений). Концентрации аналитов составляли 75 % и 125 % от величин пороговых концентраций, рекомендованных Европейским обществом по тестированию на наркотики (EWDTS).
Подготовку проб выполняли двумя методами.
1. Извлечение ацетонитрилом (500 мкл) из мочи (100 мкл) при охлаждении (-18 °C, 15 мин.). Пробу (5 мкл) вводили в хроматограф в виде раствора в смеси ацетонитри-ла и воды (100 мкл) с концентрацией ацетонитрила 10 % об. Степень концентрирования около 0,8.
2. Последовательная жидкостно-жидкостная экстракция из мочи (1 мл) в присутствии избытка гидрокарбоната натрия: а) смесью 1-хлорбутана и изоамилового спирта (99:1), б) этилацетатом. Пробу (5 мкл) вводили в хроматограф в виде раствора в смеси ацетонитрила и воды (100 мкл, 50 % об.). Степень концентрирования 10.
Образцы, получаемые при обоих способах пробопод-готовки, анализировали десятикратно на обоих анализаторах, отличающихся видом ионных источников. Критерием правильности идентификации считали результат работы анализатора, получаемый в автоматическом режиме.
Рис. 1. Сравнение вероятностей истинно-положительных идентификаций (от 100 %) при использовании обычного ионного источника и источника IonBooster для разных способов пробоподготовки и концентраций аналитов.
Получаемые вероятности истинно-положительных идентификаций для всех соединений приведены на рис. 1. При использовании ионного источника 1опБоо81ег и для выбранного набора аналитов вероятность обнару-
жений увеличивается на 2-6 %. Снижение вероятности обнаружения наблюдали только в случае тетрагидрокан-набинолкарбоновой кислоты (метаболита тетрагидрокан-набинола).
ВЫВОДЫ
Применение источника 1опБооз1ег в скрининговом анализе мочи позволяет несколько увеличить вероятность обнаружений. В зависимости от концентраций аналитов и способа пробоподготовки это увеличение составляет от 2 до 6 %. Термолабильные соединения рекомендуется определять при использовании обычного ионного источника.
current trends in monitoring of drug-related deaths in slovakia
CSc. Prof. J. Sidlo1, Dr. I. Steliar2
• institute of Forensic Medicine (head CSc. Prof. J. Sidlo), School of Medicine, Comenius University, Bratislava, Slovakia
• 2National Monitoring Centre for Drugs (head Dr. I. Steliar), Bratislava, Slovakia
• Abstract: Using illicit drugs as well as psychoactive medicaments represents a serious health and social problem. Obtained data serve as one of the bases for shaping anti-drug policy and strategy not only at national but also international level.
• Keywords: drug-related deaths, autopsy, toxicology, monitoring
INTRODUCTION
Using illicit drugs as well as psychoactive medicaments represents a serious health and social problem. Monitoring of illicit drugs and psychoactive medicaments related deaths and mortality rates among drug users is one of the essential indicators of the seriousness of drug-related problem. Obtained data serve as one of the bases for shaping anti-drug policy and strategy not only at national but also international level.
The aim of the paper is to present the results of analysis of cases of illicit drugs and psychoactive medicaments related deaths in the period of years 2004-2014 in the Slovak Republic.
MATERIAL AND METHODS
The study included all those deceased who died in relation to drug abuse and were submitted to medico-legal autopsy and toxicological investigation in Slovakia within eleven-year period ofthe years 2004-2014. The obtained data were analyzed according to methodology of European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addictions as direct and indirect deaths. Cases included in both of groups were evaluated according to occurrence of cases in particular years, sex, age, drugs detected, cause of death, external cause of death and compared.
RESULTS
The results of analyses show a comparatively low mortality rate related to psychoactive substances, there were reported 1123 cases in total, i.e. less than 2 % of all autopsies. In absolute figures so-called indirect deaths concerning deaths under the influence of psychoactive substances - 654 cases (58 %o), prevail over so-called direct deaths where a cause of death is overdosing by psychoactive substances - 469 cases (42 %o). Out of the total number of cases, 74 % were related to men and 26 %o to women. More than 47 % of the cases were related to the age up to 34 years. To illicit drugs were related more than 53 % of deaths. The most frequently detected drugs in the group of direct deaths were from the group of psychoactive medicaments and opiates. In
