CC BY
10БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
И.А.Николаева, В.У.Буко
ВЛИЯНИЕ УРСОДЕЗОКСИХОЛЕВОЙ И ТАУРОУРСОДЕЗОКСИХОЛЕВОЙ КИСЛОТ НА МИТОХОНДРИАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ И ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ У КРЫС, ПОЛУЧАВШИХ МЕТИОНИН-ХОЛИН ДЕФИЦИТНУЮ ДИЕТУ
ГУ НПЦ «Институт фармакологии и биохимии НАН Беларуси», г. Гродно
В данной работе исследовалось влияние урсодезоксихолевой (УДХК) и тауроурсо-дезоксихолевой (ТУДХК) кислот на функциональные показатели митохондриального дыхания и окислительного фосфорилирования в печени крыс при неалкогольном стеатогепатите, вызванном длительным содержанием животных на метионин-холин дефицитной диете (МХДД). Наиболее выраженный эффект наблюдался в случае применения УДХК. Использование УДХК приводило к нормализации большинства функциональных показателей митохондриального дыхания и окислительного фосфори-лирования, изменявшихся под действием МХДД. Происходило снижение скорости дыхания митохондрий до уровня контроля и увеличение эффективности фосфорилирования. Введение ТУДХК не оказало значительного воздействия на митохондриальное дыхание, но снижало эффективность фосфорилирования.
Разнонаправленное действие оказали оба препарата на фермент дыхательной цепи — сукцинатдегидрогеназу, активность которого увеличивалась под действием МХДД. УДХК снижала активность данного фермента, а ТУДХК, напротив, увеличивала. Отсюда можно сделать вывод о более целесообразном использовании УДХК, а не ТУДХК для коррекции митохондриальных нарушений, развивающихся в печени при стеатогепати-те.
ВВЕДЕНИЕ
Неалкогольный стеатогепатит
(НАСГ) классифицируется как самостоятельное хроническое заболевание печени, характеризующееся жировой дистрофией печени, активацией маркерных ферментов сыворотки крови и аккумуляцией триглицеридов в гепатоцитах [1]. Все эти признаки стеатоза сопровождаются воспалительными явлениями. Кроме того, в печени отмечаются нарушения митохондриального окисления и активация окислительного стресса. Митохондрии участвуют в Р-окислении жирных кислот, окислительном фосфорилировании, ЦТК, что обеспечивает клетку энергией. Митохондрии также являются главным источником реактивного кислорода в клетках. Многие авторы считают, что нарушение функции митохондрий может быть главным механизмом ожирения печени. Следствием нарушения Р-окисления жирных кислот является возникновение микровезикулярных стеатозов, которые в итоге могут вызывать печеночную недостаточность. Эндогенные соединения (цитокины, женские половые гормоны) или ксенобиотики (этанол, амиодо-рон и др.) могут угнетать Р-окисление прямо, или через влияние на митохондриальный геном, или непосредственно воздействуя на дыхательную цепь. Хроническое нарушение митохондриального Р-окисления и дыхательной цепи ведет к процессам активации перекисного окисления липидов, что, в свою очередь, способствует развитию признаков стеатоза, а также некрозов, воспаления, появлению телец Мэллори и фиброза.
До сих пор отсутствуют строгие схемы лечения пациентов с НАСГ. При выборе терапии учитывается наличие сопутствующих заболеваний, факторов риска. В настоящее время широко исследуется эффективность препаратов гидрофильных желчных кислот, обладающих цитопротек-торным и мембраностабилизирующим действием. Так, урсодезоксихолевая кислота (УДХК) применяется как эффективное средство для лечения холестазов раз-
личной природы, при первичном билиарном циррозе, хронических гепатитах, а также — алкогольном стеатогепатите [2]. По применению УДХК для лечения НАСГ у клиницистов мнения расходятся. Проведенный двойной слепой опыт по применению УДХК у пациентов с НАСГ не продемонстрировал эффективности проводимого лечения [3], однако по данным других авторов эффективность УДХК при лечении этой патологии не вызывает сомнений [4,5]. Сравнительные исследования с тау-роурсодезоксихолевой кислотой (ТУДХК) показали эффективность последней при ряде заболеваний печени, в частности при холестатических явлениях, при трансплантации печени [6]. В опытах in vitro продемонстрирован выраженный защитный эффект ТУДХК в случае апоптоза гепатоци-тов, индуцированного гидрофобными желчными кислотами, либо длительным потреблением этанола, а также способность предотвращать мембранные повреждения в изолированных митохондриях.
Целью нашего исследования явилось изучить влияние УДХК и ТУДХК на функциональные показатели митохондриального дыхания и окислительного фосфо-рилирования в печени.
Для моделирования НАСГ нами была выбрана наиболее распространенная алиментарная модель, основанная на длительном поедании животными высокожировой (34%) диеты, дефицитной по метионину и холину (МХДД). Согласно литературным данным, эта модель является наиболее адекватной, однако имеет ряд существенных отличий в патогенетических механизмах. В частности, НАСГ, вызываемый этой диетой не сопровождается резистентностью к инсулину [7].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В опыте использовались белые крысы-самцы линии Вистар. Животные были разделены на 3 группы: 1-я — контроль, 2-я — только МХДД; 3-я группа на фоне МХДД получала ТУДХК, внутриже-лудочно, в дозе 50 мг кг массы. Введение ТУДХК начинали с 6-й недели опыта, после развития признаков стеатогепатита,
подтвержденных гистологически. Длительность опыта — 10 недель. Во втором аналогичном эксперименте со скармливанием МХДД животные получали УДХК в эквимолярных количествах, 40 мг/кг массы. В опыте с введением ТУДХК начальный вес животных составлял 200-230 г, а при введении УДХК - 240-270 г и животные во всех группах были равномерно распределены по весу. Каждая группа в обоих опытах состояла из 8 животных. Следует отметить, что эксперименты с УДХК и ТУДХК проводились раздельно, в разные времена года, что, наряду с некоторой разницей в начальном весе животных, могло обусловить отдельные количественные различия в показателях контрольных групп.
Оценка функционального состояния митохондрий проводилась полярографическим методом. Исследовалась активность дыхания митохондрий в различных метаболических состояниях по Чансу - У3 и У4, степень сопряженности дыхания и фосфорилирования, как показатель дыхательного коэффициента (ДК), и эффективность фосфорилирования (АДФ/О).
Для статистической обработки использовалась непараметрическая статистика ЛКОУЛ с применением критерия t Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В таблицах 1 и 2 представлены изменения функциональных показателей митохондрий при окислении НАД-зависимых субстратов (сукцинат, пируват+малат) и карнитинового производного длинноцепочечной жирной кислоты - пальмитоилкар-нитина.
В эксперименте с УДХК у животных, получавших МХДД, потребление кислорода в состоянии 3 (У3) достоверно увеличивалось при окислении всех используемых субстратов, особенно сукци-ната. В состоянии 4 (У4) потребление кислорода у крыс с ожирением достоверно увеличивалось при окислении пирувата с малатом и пальмитоилкарнитина. При окислении сукцината потребление кислорода в состоянии 4 у животных с ожирени-
ем не отличалось от контрольного уровня. митохондриального дыхания повышался у
Соответственно, коэффициент дыхатель- животных при окислении всех субстратов.
ного контроля (У3/У4), характеризующий эффективность торможения активности
Таблица 1
Влияние ТУДХК на функциональные показатели митохондрий_________
Показатели Контроль МХДД 10 нед. МХДД +50 мг/кг ТУДХК
Пальмитоил-карнитин
У3 94±9 86±9 83±7
У4 39±3 39±4 41±3
ДК 2.1±0.10 2.0±0.16 1.9±0.09
АДФ/О 2.40±0.11 2.16±0.13 1.93±0.11а
Пируват+малат
У3 55±6 52±5 62±6
У4 29±3 29±3 38±4
ДК 1.7±0.12 1.7±0.09 1.5±0.04ь
АДФ/О 2.43±0.16 2.42±0.13 1.96±0.12а,ь
Сукцинат
У3 158±11 181±16 229±18а
У4 85±7 84±6 105±8
ДК 1.8±0.1 2.1±0.09а 2.2±0.08а
АДФ/О 1.38±0.07 1.50±0.09 1.26±0.07
а - достоверно по отношению к контролю; б - достоверно по отношению к МХДД 10 нед.
Таблица 2
Влияние УДХК на функциональные показатели митохондрий__________
Показатели Контроль МХДД 10 нед. МХДД + 40мг/кг УДХК
Пальмитоил-карнитин
У3 50±7 93±7а 70±4а^
У4 26±0,9 38±1а 31±1б
ДК 1,7±0,1 2,4±0,1а 2,6±0,1а
АДФ/О 2,34±0,2 1,67±0,07а 1,95±0,1б
Пируват + малат
У3 24±0.4 54±3а 41±3аб
У4 17±1 26±2а 20±1б
ДК 1,6±0,1 2,1±0,1а 2,1±0,1
АДФ/О 2,76± 0,1 2,22±0,1а 2,43±0,1
Сукцинат
У3 90±13 170±11а 155±14а
У4 50±7 58±3 55±3
ДК 2,1±0,2 3,0±0,1а 2,9±0,1а
АДФ/О 1,61±0,1 1,49±0,04 1,59±0,04
а - достоверно по отношению к контролю; б Эффективность фосфорилирования в митохондриях, выражаемая отношением АДФ/О, достоверно снижалась у крыс с ожирением при окислении пальмитоил-карнитина и пирувата с малатом, что указывает на снижение активности переноса
- достоверно по отношению к МХДД 10 нед.
электронов с НАДН на кислород при сопряжении окисления с фосфорилировани-ем. Нарушение окислительного фосфори-лирования связывают с реактивными формами кислорода. Активация перекисного окисления липидов уменьшает текучесть
митохондриальной мембраны, изменяя проницаемость мембраны и активность мембранных ферментов, что сопровождается набуханием митохондрий, ломкостью лизосом, нарушением целостности клеточных мембран. Повреждающие эффекты окислительного стресса на митохондриальное дыхание, синтез АТФ и мембранные свойства, главным образом связаны с усилением перекисного окисления мембранных полиненасыщенных фосфолипидов, стабильность которых имеет большое значение для функционирования дыхательной цепи митохондрий. Нарушение липидного окружения мембраносвязанных митохондриальных дегидрогеназ существенно изменяет их функции. Длительное воздействие реактивных форм кислорода приводит к окислительному стрессу, который проявляется в окислительном повреждении митохондриальных белков, что ведет к нарушению образования энергии в митохондриях.
Введение УДХК снижало скорость митохондриального дыхания в состоянии 3 (субстраты - пируват+малат и пальмитоил-карнитин), но показатель ДК не изменялся, поскольку скорость дыхания в состоянии 4 также снижалась. Эффективность фосфо-рилирования (АДФ/О) под воздействием препарата увеличилась до контрольного уровня при окислении пальмитоилкарни-тина. На параметры окисления сукцината УДХК не оказала существенного влияния.
В эксперименте с ТУДХК, потребление кислорода митохондриями крыс с ожирением в состоянии 3 и 4 существенно не отличалось от контрольного уровня при окислении пирувата с малатом и пальми-тоилкарнитина. Некоторое увеличение митохондриального дыхания в состоянии У3 наблюдалось при использовании сукцина-та, в связи с чем при окислении сукцината повышался дыхательный коэффициент (У3/У4). Эффективность фосфорилирова-ния (АДФ/О) не отличалась от контрольных значений при окислении всех трех субстратов.
Введение ТУДХК наиболее выраженный эффект оказало на параметры окисления пирувата с малатом. Произошло снижение показателя ДК при отсутствии
достоверных изменений митохондриального дыхания в состоянии 3 и 4. Эффективность фосфорилирования (АДФ/О) также снижалась под воздействием препарата. Под влиянием ТУДХК возросла скорость дыхания митохондрий в состоянии 3 (V3) по сравнению с контролем при окислении сукцината. Значительных эффектов на окисление пальмитоилкарнитина ТУДХК не оказала.
На рисунках 1 (А, Б) приведены диаграммы, иллюстрирующие сравнительное использование различных энергодающих субстратов в условиях нашего эксперимента. Для большей наглядности был выбран показатель с наиболее характерными изменениями: скорость дыхания в состоянии V3.
Очевидно, что УДХК (рис. 1 А) преимущественно воздействует на окисление пирувата с малатом и пальмитоилкарнити-на, снижая митохондриальное дыхание в состоянии 3. ТУДХК, напротив, увеличивала скорость потребления кислорода в состоянии 3 при окислении сукцината и пирувата с малатом (рис. 1 Б).
Таким образом, анализ полученных данных позволяет сделать заключение, что для улучшения функционального состояния митохондрий более целесообразно использование УДХК, как активатора окислительного фосфорилирования, чем ТУДХК.
Изучаемое полярографическим методом in vitro окисление субстрата является многоступенчатым процессом с наличием нескольких возможных лимитирующих стадий (транспорт субстрата через митохондриальную мембрану, активность соответствующей первичной дегидрогеназы, активность дыхательной цепи). Поэтому нами была исследована активность одного из ключевых ферментов дыхательной цепи
- сукцинатдегидрогеназы (СДГ).
Из рисунка 2 (А, Б) видно, что активность СДГ возрастала под воздействием МХДД в обоих экспериментах. Введение УДХК снижала активность фермента до уровня контроля. ТУДХК, напротив, увеличивала данный показатель не только по отношению к диете, но и к контролю.
Сукцинат
Пальмитоил
карнитин
250
А
Пируват+малат
Рис. 1А. Скорость дыхания митохондрий в состоянии 3 при окислении различных субстратов у животных, содержавшихся на МХДД и получавших УДХК (А) и ТУДХК (Б). Показатели контрольной группы приняты за 100%.
Пальмитоил
карнитин
Б
Рис. 1Б. Активность сукцинатдегидрогеназы у контрольных крыс и крыс с алиментарным ожирением до и после введения УДХК (А) и ТУДХК (Б).
ci
■л
л
и
ю
-
S
120
100
so
60
4o
20
■*
Контроль
МХДД
ТУДХК
Рис 2А. Активность сукцинатдегидрогеназы у контрольных крыс и
крыс с алиментарным ожирением до и после введения УДХК.
o
140
120
а
■-Í
л
<и
ю
н
=
£
£
н
100
80
60
40
20
**
ж нн
1
1 1 Контроль МХДД ТУДХК
Рис 2Б. Активность сукцинатдегидрогеназы у контрольных крыс и крыс с алиментарным ожирением до и после введения ТУДХК.
*- достоверно по отношению к контролю; **- достоверно по отношению к МХДД.
б
0
УДХК активирует окислительное фосфорилирование в печени, достоверно повышая отношение АДФ/О при окислении пальмитоилкарнитина (табл. 1) и смещая также потребление субстратов в сторону пальмитоилкарнитина и пирувата с малатом, снижая при этом процент потребления сукцината (рис. 1А), что обусловлено угнетением активности сукци-натдегидрогеназы. С другой стороны, в угнетении сукцинатдегидрогеназы ведущую роль играет накопление оксалоацета-та [В], что вызывает угнетение всего ЦТК и окисление любого из субстратов. Можно предполагать, что перенос электронов под воздействием УДХК осуществляется по НАДН-оксидазному и, в меньшей степени, по сукцинатдегидрогеназному пути.
Энергообеспечение печени под влиянием УДХК, по-видимому, происходит как за счёт гликолитического пути ресинтеза АТФ [9] с использованием окисления жирных кислот в качестве основного пути энергообеспечения. Последний путь хорошо согласуется с выраженным гипо-липидемическим эффектом УДХК, отмеченным нами ранее в аналогичной экспериментальной модели [10]. В то же время повышение использования пирувата митохондриями крыс, получавших УДХК, маловероятно, поскольку окисление этого субстрата в состояниях V3 и V4 снижается.
Напротив, активация сукцинатде-гидрогеназы под влиянием ТУДХК (табл. 2) сопровождается преимущественным потреблением сукцината в качестве основного энергодающего субстрата (Рис. 1Б) и коррелирует с угнетением окислительного фосфорилирования, по всей видимости, за счёт усиления окисления субстратов, и в первую очередь, сукцината [11]. Не исключено, что в этой ситуации возможно развитие дефицита АТФ вследствие угнетения окислительного фосфорилирования.
По мнению некоторых авторов, активация процессов дыхания может быть связана с одновременным ростом внутри-митохондриального сукцината и усилением его использования вследствие активации сукцинатдегидрогеназы [12].
По всей вероятности, этот эффект ТУДХК связан с действием таурина, как компонента ТУДХК, который способен восстанавливать тканевое дыхание в печени при некоторых экстремальных ситуациях [13]. В то же время, разобщение окислительного фосфорилирования посредством ТУДХК может быть обусловлено частичным разрушением внутренней мембраны митохондрий и угнетением деполяризации мембраны [14] этой желчной кислотой. С другой стороны, УДХК предотвращает снижение трансмембранного потенциала и предупреждает выделение цитохрома с в цитоплазму, свидетельствуя о сохранении целостности клеточных структур [15]. Полученные данные свидетельствуют о большей целесообразности использования УДХК, а не ТУДХК, для коррекции митохондриальных нарушений, развивающихся в печени при стеатогепатите.
SUMMARY
I.A.Nikolaeva, V.U.Buko EFFECTS OF URSODEOXYCHOLIC AND TAUROURSODEOXYCHOLIC ACIDS ON MITOCHONDRIAL OXIDATION AND OXIDATIVE PHOSPHORYLATION IN RATS FED METHIONINE- AND CHOLINE-DEFICIENT DIET Effects of ursodeoxycholic (UDCA) and tauroursodeoxycholic (TUDCA) acids on mitochondrial oxidation and oxidative phosphorylation in the liver of rats with nonalcoholic steatohepatitis induced by the feeding of methionine- and choline-deficient diet (MCDD) during 10 weeks were studied. The administration of UDCA (40 mg/kg, 4 last weeks of the trial) normalized most of parameters related to mitochondrial oxidation and oxidative phosphorylation which were changed after the MCDD feeding. The treatment with TUDCA (50 mg/kg, 4 last weeks of the trial) did not changed mitochondrial oxidation of substrates studied (succinate, pyru-vate+malate, palmitoylcarnitine) but lowered the efficiency of oxidative phosphorylation. We can conclude that UDCA but not TUDCA can be useful for a correction of mitochon-
drial abnormalities in non-alcoholic steatohepatitis.
ЛИТЕРАТУРА
1. Sheth, S.G. Nonalcoholic steatohepatitis.// S.G. Sheth, Ann. Intern. Med. - 1997. -Vol. 12б, № 2. - P. 137-145.
2. Lazaridis, K.N. Ursodeoxycholic acid mechanism of action and clinical use in hepatobiliary disorders.// K.N. Lazaridis. J. Hepa tol. - 2001. - Vol. 35, № 1. - P. 1З4-14б.
3. . Ursodeoxycholic acid for treatment of nonalcoholic steatohepatitis: results of a randomized trial.// K.D Lindor [et al];.- Hepa-tology. - 2004. - Vol. 39, № 3. - P. 770-В.
4. А 2-years multicenter randomized placebo-controlled study testing UDCA in combination with vitamin E to treat NASH.// J-F Dufour [et al];.- J. Hepatol. - 2005. - Vol. 42, Suppl. 2: Abs. б.
5. Ursodeoxycholic acid and atorvastatin in the treatment of nonalcoholic steatohepati-tis.// M. Kiyici [et al];.- Can. J. Gastroenterol.
- 2003. - Vol. 17, № 12. - P. 71З-В.
6. Que neau P.-E., Mon tet J.-C. Hepato-protection by hydrophilic bile salts.// J. Hepa tol. - 1994. - Vol. 21, № 2. - P. 2б0-2бВ.
7. The methionine-choline deficient dietary model of steatohepatitis does not exhibit insulin resistance // M.E Rinella. J. Hepatol. -2004. - Vol. 40, № 1. - P. 47-51.
В. Действие бикарбоната и инсулина на энергетический обмен в митохондриях печени крыс // Е.А. Косенко [и др.]; Вопросы медицинской химии. - Москва, 19В2. - Т. 28 (б). - С. В7-90.
9. Молодцов, Е.А. Исследование влияния аналогов урацила на окислительную и фосфорилирующую функцию митохондрий печени белых крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.
- Москва, 1974. - Т. 7В (11). - С. 59-б1.
10. The dose-dependent beneficial effect of ursodeoxycholic acid in rats with non-
alcoholic steatohepatitis induced by methionine and choline deficient diet // Буко В.У [и др.]; Здоровье и питание. - Минск, 2005. -
С. 4б-52.
11. Дементьева, Т. А. Влияние высокоэнергетического излучения на активность цитохромоксидазы и сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени и сердечной мышцы крыс // Т. А. Дементьева, Г. А Док-шина, В. А. Пегель Вопросы медицинской химии. - Москва, 19б9. - Т. 15 (5). - С. 535В.
12. Саакян, И.Р. Участие митохондрий печени в адаптационных реакциях организма при пересадке сердца у крыс // И.Р. Саакян, Вопросы медицинской химии. -Москва, 19В1. - Т. 27 (б). - С. 755-9.
13. Докшина, Г. А. Влияние таурина на восстановление тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях печени облученных крыс // Г. А. Докшина [и др.];.- Радиобиология. - 1974. -Т.14(1). - С. 44-В.
14. Rodrigues, C.M. Tauroursodeoxy-cholic acid partially prevents apoptosis induced by 3-nitropropionic acid: evidence for a mitochondrial pathway independent of the permeability transition.// C.M Rodrigues [et al]; J. Neurochem. - 2000. - Vol. 75, № б. -P. 2ЗбВ-79.
15. Rodrigues, C.M., Ursodeoxycholic acid prevents cytochrome c release in apop-tosis by inhibiting mitochondrial membrane depolarization and channel formation // C.M Rodrigues [et al]; Cell Death Differ. - 1999. -Vol. б, № 9. - P. В42-54.
Поступила 22.01.2007 г.
