CC BY
34
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Теплов С.А., Абаленихина Ю.В., Иванычева Ю.Н., 2015 УДК 616.12-008.9-085.31,156
ВЛИЯНИЕ УЛЬТРАДИСПЕРСНЫХ ПОРОШКОВ МЕДИ НА ОКИСЛИТЕЛЬНУЮ МОДИФИКАЦИЮ БЕЛКОВ СЕРДЦА КРЫС
С.А. ТЕПЛОВ, Ю.В. АБАЛЕНИХИНА, ЮН. ИВАНЫЧЕВА
Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, г. Рязань
THE INFLUENCE OF ULTRAFINE POWDERS OF COPPER OXIDATIVE MODIFICATION PROTEINS OF RAT HEART
S.A. TEPLOV, JU.V. ABALENIHINA, JU.N. IVANYCHEVA
Ryazan State Medical University, Ryazan
Изучено влияние ультрадисперсных порошков меди в дозе 10-4 мг/кг и 1 мг/кг на окислительную модификацию белков сердца крыс. Установлено, что в условиях данной модели уменьшается содержаниекарбонильных производныхпротеинов и доля вторичных маркеров окислительного стресса. Воздействие меди в ультрадисперсной форме сопровождается сайт-специфическим окислительным повреждением белков в области остатков триптофана, что свидетельствует о процессе фрагментации белковых молекул.
Ключевые слова: карбонильные производные белков, окисленный триптофан, медь в ультрадисперсной форме.
The effect of ultrafine copper powder at a dose of 10-4 mg / kg and 1 mg / kg on the oxidative modification of proteins rat heart. It was found that under this model reduces the content of oxidation-modified proteins and the proportion of
secondary markers of oxidative stress. Exposure to form copper ultrafine followed by site-specific oxidative damage to proteins in tryptophan residues, indicating that the fragmentation of the protein molecules.
Keywords: protein carbonyl derivatives, oxidized tryptophan, copper in the form of ultrafine.
Введение
Медь необходима для жизни всех организмов, так как участвует в осуществлении многих клеточных процессов. Способность меди восстанавливать молекулярный кислород до его активныхформ позволяет рассматривать ионы меди в качестве токсического вещества [5]. Большой интерес вызывают биопрепараты нового поколения - микроэлементы в виде ультрадисперсных порошков металлов (УДИМ), активными компонентами которых является медь и другие микроэлементы в ультрадисперсном состоянии. Установлено, что нанок-ристаллические порошки меди улучшают физиологическое состояние животных, однако большая удельная поверхность наноматериалов и ее особые свойства могут усилить механизмы, связанные с токсическим действием металла на живые организмы [1].
Эффективными ловушками активных форм кислорода являются белки, в результате чего формируются карбонильные производные белковых молекул. Окислительная модификация белков является наиболее перспективным маркёром интенсивности свобод-
но-радикальных процессов, происходящих под действием неблагоприятных внешних факторов, таких как ионизирующая радиация, фотохимические воздействия, металл-зависимое окисление [3, 2, 8]. Роль окислительного стресса рассматривается в качестве одного из патогенетических звеньев многих заболеваний [4, 6].
Цель исследования
Выявление влияния меди в ультрадисперсной форме на окислительную модификацию белков сердца крыс.
Материалы и методы
Исследование проводились на 18 конвенциональных крысах-самках линии массой 280-320 г. Животным экспериментальных групп в течении 14 дней перорально вводили ультрадисперсный порошок меди (размер частиц 10-15 нм): экспериментальной группе 1 (п=6) в дозе 10-4 мг/кг, а экспериментальной группе 2 (п=6) в дозе 1 мг/кг. Контрольной группе животных (п=6) в те же сроки осуществляли пероральное введение физиологического раствора. Содержание животных в виварии соответствовало "Санитарным правилам по
устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник" от 06.04.1993 г. В манипуляции с животными, в том числе выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (Приказ Минздрава СССР №755 от 12.08.1977 г.) Немедленно после выведения животного из эксперимента из ткани сердца готовили го-могенатткани сердца.
Окислительную модификацию белков оценивали в цитоплазматиче-ской фракции гомогенатапо методу КЬ.Ьеутев модификации Е.Е. Дубининой [3], после осаждения нуклеиновых кислот 10% раствором стрептомицина сульфата. Карбонильные производные белков регистрировали на спектрофотометре на следующих длинах волн: 254, 270, 280, 354, 363, 370, 428, 430, 434, 520, 524, 535 нм. По полученным экстинкциям строили спектр окислительной модификации белков.
Содержание битирозина и окисленного триптофана определяли флуо-риметрическим методом. Окислительная модификация тирозиновых остатков белков измерялась по образованию битирозина, который обладает характерной флуоресценцией [7]. Окисление триптофановых остатков сопровождается снижением флуоресценции, характерной для триптофана [9].
Для оценки достоверности различий независимых выборок исполь-
зовали ранговый критерий Манна-Уитни (И-тест).
Результаты и их обсуждение
Результаты экспериментальных групп были сопоставлены с результа-тамиконтрольной группы: уровень карбонильных производных белков в сердце крыс статистически значимо снижался (рис. 1). Указанные изменения не зависят от дозы вводимых ультрадисперсных порошков меди.
В УФ-свете спектра регистрируются динитрофенилгидразоны нейтрального характера: в диапазоне 260558 нм- альдегиды, а при 363-370 нм -кетоны.Для динитрофенилгидразоно-восновного характера спектр поглощения в области видимого света в диапазоне 258-264, 428-520 нм для альдегидов, и 430-434 нм, 524-535 нм для кето-нов. Из спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков следует, что показатели снижаются на длинах волн 356 нм и 520 нм, что свидетельствует о снижении количества альдегид-динитрофенилгидразонов основного и нейтрального характера, а при X = 363, 370 нм и 428, 430 нм - ке-тон-динитрофенилгидразоны основного и нейтрального характера.
Представленный факт может объясниться следующими механизмами: ограничение поступления избытка меди через ионные каналы [5], а также индуцирование защитных путей от токсического действия металлов переменной валентности.
Контроль
щт^/кг)
Cu(1 мг/кг)
Рис. 1. Спектр поглощения продуктов спонтанной окислительной модификации белков Примечание: *-статистически значимые различия от контрольной группы (р<0,05).
Известно, что первичными маркерами окислительного стресса являются альдегиды, а вторичные маркеры - кетоны [2]. Из полученных результатов следует, что доля вторичных маркеров окислительного стресса при введении УДИ меди статистически значимо снижается относительно показателей контрольной группы (рис. 2). Иолученная закономерность свидетельствует о том, что процесс окислительного стресса не переходит в позднюю стадию и носит обратимый характер. Возможно, в условиях снижения уровня карбонильных производных белков новые альдегиды не образуются, а присутствующие в ткани сердца переходят в кетоны.
Индуцирование белкового механизма защиты может осуществляться по пути синтеза белков denovo, которые связывают медь в неактивные комплек-
сы. Возможно, что в качестве таких белков выступают триптофан-содержащие протеины. Об этом процессе свидетельствует прямая достоверная зависимость между вводимой дозой меди в ультрадисперсной форме и резким снижением флуоресценции триптофана (табл. 1). Таким образом, воздействие УДИ меди сопровождается сайт-специфическим окислительным повреждением белков в области остатков триптофана. Иредставленные данные свидетельствуют о глубоких окислительных повреждениях белков при данной экспериментальной модели, подтверждением этого является зарегистрированная нами в гомогенате сердца высокая концентрация практически не-репарируемых стабильных модификаций триптофана в белках, сопровождающееся выраженными и достоверными изменениями их флуоресценции.
Рис. 2. Соотношение первичных и вторичных маркёров окислительного стресса
контрольной группы животных
Примечание: *-статистически значимые различия от контрольной группы (р<0,05).
Окислительная модификация тирозиновых остатков сопряжена с образованием битирозина, который обладает характерной голубой флуоресценцией, однако, его образование в экспериментальных условиях снижалось (табл. 1). Представленный фактпод-тверждает литературные данные о том, что ароматические аминокислоты ред-
ковходят в состав металл-связывающей поверхности белков, поэтому они меньше подвергаются воздействию ме-талл-катализируемого окисления [8]. Снижение уровенябитирозина и нарастание количества окисленного триптофана свидетельствует об отсутствии процессов агрегации и преобладании фрагментации белков.
Таблица 1
Показатели флуоресценции битирозина и триптофана
Показатель Контроль Группа №1 Группа №2
Триптофан, интенсивность флуоресценции, ед. на 1 г белка 2,02 [1,84;2,97] 1,09 [0,97;1,30]* 0,93 [0,87;1,63]*
Битирозин, интенсивность флуоресценции, ед. на 1 г белка 1,10 [0,77;1,51] 0,65 [0,48;1,09]* 0,87 [0,59;1,34]*
Примечание: *- статистически значимые различия (р<0,05)
Выводы
При пероральном введении ультрадисперсных порошков меди содержание карбонильных производных белков снижается и сопровождается нарастанием первичных маркеров окислительного стресса. Количество битирозина в условиях экспериментальных моделей снижается, однако, количество окисленного триптофана возрастает, что свидетельствует о сайт-специфичном повреждении и защитном значении данного процесса.
Литература
1. Глущенко Н.Н. Сравнительная токсичность солей и наночастиц металлов и особенность их биологического действия / Н.Н. Глущенко, О.А. Богословская, И.П. Ольховская // Нанотехнологии и информационные технологии - технологии XXI века: материалы Международной научно-практической конференции. - М., 2006. - С. 93-95.
2. Губский Ю.И. Токсикологические последствия окислительной модификации белков при различных патологических состояниях / Ю.И. Губский // Современные проблемы токсикологии. - 2005. - Т. 8, № 3 - С. 20-27.
3. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток / Е.Е. Дубинина. -СПб.: Медицинская пресса, 2006. - 400 с.
4. Локальные изменения свобод-норадикального статуса роговицы при
экспериментальной гнойной язве / А.В. Колесников [и др.] // Наука молодых -ERUDITIO JUVENIUM. - 2013. - №1. -С. 26-30.
5. Розонцвет А.О. Аккумуляция меди и ее влияние на метаболизм белков, липидов и фотосинтетических пигментов в листьях POTAMOGETON PERFOLIATUS L. / А О. Розонцвет [и др.] // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2003. - Т. 5, №2. - С. 305-311.
6. Солейко Е.В. Осложненное течение хронической постинфарктной аневризмы сердца (клинико-морфоло-гические параллели) / Е.В. Солейко, Л.В. Кактурский // Наука молодых -ERUDITIO JUVENIUM. - 2013. - №3.
- С. 7-14.
7. Amado R. Dytirosine: in vitro production and characterization / R. Amado, R. Aeschbach, H. Neukom // Methods Enzymol. - 1984. - Vol. 107. -P. 377-388.
8. Aust S.D. Role of metals in oxygen radical reactions / S.D. Aust, L.A. Morehouse, C.E. Thomas // Free Radic. Biol. Med. - 1985. - Vol. 1, № 1. - P. 3-25.
9. Stadtman E.R. Metal ion-catalyzed oxidation of proteins: biochemical mechanism and biological consequences / E.R. Stadtman // Free Radic. Biol. Med. - 1990.
- Vol. 9, № 4. - P. 315-325.
10. Teale F.W.J. Ultraviolet fluorescence of proteins in neutral solution / F.W.J. Teale // Biochem. J. - 1960. -Vol. 76, №2. - P. 381-388.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Теплов С.А. - студент 3 курса лечебного факультета ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань.
Абаленихина Юлия Владимировна - ст. преп. кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань.
Иванычева Юлия Николаевна - канд. биол. наук, ассист. кафедры общей химии с курсом биоорганической и органической химии ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань.
