CC BY
65
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Абаленихина Ю.В., Фомина М.А., 2016 УДК 577.1:547.96
СОСТОЯНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ ТИРОЗИНА И ТРИПТОФАНА В УСЛОВИЯХ Ш VIVO-МОДУЛИРОВАНИЯ СИНТЕЗА ОКСИДА АЗОТА
Ю.В. АБАЛЕНИХИНА, М.А. ФОМИНА
Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, г. Рязань
STATUS OF TYROSINE AND TRYPTOPHAN OXIDATIVE MODIFICATION IN CONDITIONS OF IN VIVO MODULATION OF NITRIC OXIDE SYNTHESIS
J.V. ABALENIHINA, MA. FOMINA
Ryazan state medical university, Ryazan, Russia
Изучено влияние модуляторов синтеза оксида азота - L-аргинина и N-Hrnpo-L-аргининметилового эфира на окислительную модификацию тирозина и триптофана в составе белков тимуса и селезенки. Установлено, что под действием L-аргинина окислительная модификация триптофана снижается, а тирозина - не изменяется. В условиях дефицита синтеза оксида азота снижается повреждение остатков тирозина и триптофана.
Ключевые слова: окислительная модификация белков, тирозин, триптофан, оксид азота.
The influence of nitric oxide modulators - L-arginine and N-nitro-L-arginine methyl ester on oxidative modification of tyrosine and tryptophan in the composition of proteins of the thymus and spleen was studied. It was established that under the effect of L-arginine oxidative modification of tryptophan is reduced and of tyrosine - does not change. Given the lack of nitric oxide, damage to tyrosine and tryptophan residues is reduced.
Keywords: oxidative modification of proteins, tyrosine, tryptophan, nitric oxide.
В связи с тем, что оксид азота способен как индуцировать [3, 5, 15], так и ин-гибировать окислительные процессы [14] существует две стороны проблемы изучения биологии оксида азота в организме: исследование эффектов избыточной и недостаточной продукции данного вещества [3]. Короткоживущая молекула NO спо-
собна продуцировать активные формы азота (ЫФ, ONOO" ), которые запускают свободно-радикальные реакции, оказывающие деструктивное действие на белковые молекулы.
Особым вариантом окислительной модификации белков является нитрозилиро-вание, индуцируемое оксидом азота [1, 7, 9,
13], сопровождающееся активацией тканевых протеиназ [9]. Наиболее изученным является механизм повреждения ароматических аминокислот. Доказано, что остатки аминокислот тирозина и триптофана чувствительны к повреждению в условиях окислительного стресса благодаря системе развитых двойных связей в своей структуре.
При этом важно отметить, что сайт-специфичное нитрозилирование тирозина и триптофана сочетается с изменением функций протеинов и развитием N0-зависимого окислительного стресса (нит-розативного стресса).
Материалы и методы
Работа выполнена на 88 конвенциональных половозрелых крысах-самцах линии массой 280-320 граммов, ко-
личество особей в каждой группе - 8. Содержание и выведение животных из эксперимента выполняли в соответствии с правилами, изложенными Международным Советом Медицинских Научных Обществ (CЮMS) в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985 г.) и приказе МЗРФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».
Для моделирования дефицита синтеза оксида азота осуществляли внутри-брюшинное введение неселективного ингибитора N0-синтазы №нитро-Ь-аргинин-метилового эфира (Ь-№АМЕ) в дозе 25 мг/кг [8] и 200 мг/кг [17] в виде физиологического раствора через переднюю брюшную стенку одноразовым пластиковым шприцем с тонкой короткой иглой. Моделирование изменения уровня синтеза оксида азота (II) субстратом К0-синтазы, осуществляли путем внутрижелудочного введения раствора Ь-аргинина на 0,9 % растворе №С1 в дозе 500 мг/кг [4] через стеклянный градуированный шприц с внутрижелудочным зондом. Для изучения корригирующего действия Ь-аргинина осуществляли внутрибрюшинное введение Ь-№АМЕ в указанных дозах с 3-х по 9-е сутки на фоне перорального введения Ь-аргинина. Животных выводили из экс-
перимента на 10-е сутки. Контрольные группы формировались для каждой серии эксперимента из животных, сопоставимых по возрасту, массе и условиям содержания с экспериментальными особями.
Немедленно после выведения животного из эксперимента из ткани тимуса и селезенки получали чистую цитоплазмати-ческую (неседиментируемую) фракцию, путём двойного ультрацентрифугирования, в которой оценивали окислительную модификацию тирозина и триптофана.
Интенсивность окислительной модификации белков оценивали по степени флуоресценции битирозина и триптофана. Флуоресценцию триптофана регистрировали при длине волны возбуждения X 295 нм и длина волны испускания X 340 нм [6], образование битирозина регистрировали при длине возбуждения X 325 нм и длина волны испускания X 415 нм [10]. Полученные результаты выражали в единицах флуоресценции, отнесенных на грамм белка.
Проверку нормальности распределения данных осуществляли с помощью критерия Шапиро-Уилка (W-критерий). Для вариационных рядов с отсутствием согласия данных с нормальным распределением вычисляли характеристики: медиану (Ме), минимальное (min) и максимальное (max) значение, результаты представляли в формате Ме [min; max]. Для оценки статистической значимости различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна-Уитни (U-тест).
Результаты и их обсуждение
Структурные изменения, являющиеся результатом окислительной модификации тирозина и триптофана, проявляются в изменении их флуоресцирующей способности. Так, продукты окисления триптофана (N-формилкинуренин) характеризуется снижением флуоресцирующей способности относительно исходного вещества [14], а окисление тирозина приводит к образованию битирозина, что сопровождается повышением флуоресцирующей активности [10, 11, 12].
В условиях in vivo-моделирования дополнительного синтеза оксида азота
ожидаемого накопления битирозина и окисленного триптофана не отмечалось. Полученные результаты показывают (табл. 1, 2), что флуоресценция битирозина не
изменяется, однако повышается для триптофана. Полученный факт может объясняться пространственной недоступностью тирозиновых и триптофановых остатков.
Таблица 1
Изменения флуоресценции битирозина и триптофана селезенки крыс в условиях модулирования синтеза оксида азота, ед. фл./г белка (Ме [min; max])
экспериментальная модель Флуоресценция битирозина Флуоресценция триптофана
контроль 1 0,15 [0,14; 0,17] 0,29 [0,26; 0,31]
L-NAME (25 мг/кг) 0,09 [0,08; 0,12]* р=0,045 0,72 [0,69; 0,73]*
р=0,018
L-NAME (200 мг/кг) 0,13 [0,12; 0,15]* 0,71 [0,62; 0,77]*
р=0,02 р=0,008
контроль 2 0,16 [0,13; 0,22] 0,31 [0,29; 0,34]
L-аргинин (500 мг/кг) 0,18 [0,15; 0,20] 0,61 [0,39; 0,74]*
р=0,02
контроль 3 0,13 [0,11; 0,19] 0,33 [0,28; 0,36]
L-NAME (25 мг/кг) + 0,14 [0,09; 0,13] 0,73 [0,69; 0,96]*
L-аргинин (500 мг/кг) р=0,01
L-NAME (200 мг/кг) + 0,15 [0,10; 0,18] 0,86 [0,79; 1,25]*
L-аргинин (500 мг/кг) р=0,008
Примечание: * - статистически значимые отличия относительно группы контроля
Поскольку реакция образования нит-ротриптофана обратима, то он способен разлагаться, таким образом, низкие концентрации оксида азота способствуют смещению равновесия в сторону немодифициро-ванного триптофана, о чем свидетельствует
увеличение флуоресценции (табл. 1, 2). Незначительный уровень битирозина свидетельствует об отсутствии процессов агрегации, а низкий уровень окисленного триптофана об отсутствии процессов фрагментации белковых молекул.
Таблица 2
Изменения флуоресценции битирозина и триптофана тимуса крыс в условиях модулирования синтеза оксида азота, ед. фл./г белка (Ме [min; max])
экспериментальная модель Флуоресценция битирозина Флуоресценция триптофана
контроль 1 0,32 [0,31; 0,38] 0,65 [0,63; 0,75]
L-NAME (25 мг/кг) 0,20 [0,15; 0,25]* р=0,045 1,47 [1,42; 1,53]* р=0,008
L-NAME (200 мг/кг) 0,26 [0,19; 0,32]* р=0,04 1,68 [0,94; 2,17]* р=0,008
контроль 2 0,31 [0,30; 0,35] 0,62 [0,61; 0,69]
L-аргинин (500 мг/кг) 0,34 [0,19; 0,66] 1,43 [0,59; 2,65]* р=0,002
контроль 3 0,34 [0,25; 0,40] 0,61 [0,59; 0,73]
L-NAME (25 мг/кг) + L-аргинин (500 мг/кг) 0,39 [0,11; 0,49]# р=0,021 1,59 [0,95; 3,53]* р=0,01
L-NAME (200 мг/кг) + L-аргинин (500 мг/кг) 0,38 [0,17; 0,49]А р=0,03 1,44 [1,38; 1,67]* р=0,008
Примечание: * - статистически значимые отличия относительно группы контроля; # - статистически значимые отличия относительно группы L-NAME (25 мг/кг); ▲ - статистически значимые отличия относительно группы L-NAME (200 мг/кг).
Процессу нитрозилирования аминокислотных остатков могут помешать функциональные группы аминокислот, которые окружают остатки триптофана в первичной структуре белка.
Выделяют несколько механизмов нитрозилирования тирозиновых остатков белков, а именно: пероксонитритный (классический), пероксидазный (энзима-тический) и гем-пероксидазный (неэнзи-матический) [16].
Важно отметить, что для нитрозили-рования тирозина необходимы следующие условия:
- недостаток остатков цистеина
- отсутствие пространственных преград.
Кроме этого нитрозилирование протеинов в организме животных связано с ок-сидативным стрессом [2], который, по данным полученных результатов, под действием субстрата синтеза NO не развивается.
Таким образом, моделирование дефицита синтеза оксида азота препятствует образованию битирозина и окисленного триптофана, изменения не зависят от вводимой дозы. L-аргинин не оказывает влияния на изучаемые показатели, но обладает корригирующим действием.
Литература
1. Абаленихина Ю.В. Влияние модуляторов синтеза оксида азота на активность и аутопроцессинг катепсина в им-мунокомпетентных органов крыс в условиях in vitro / Ю.В. Абаленихина, М.А. Фомина // Наука молодых (Eruditio Juvenium). - 2014. - №1. - С. 53-60.
2. Блюм Я.Б. Нитрувание тирозина как регуляторная посттрансляционная модификация протеинов / Я.Б. Блюм, Ю.А. Красиленко, А.И. Смецъ // Укр. биохим. журн. - 2009. - Т. 81, № 5. - С. 5-15.
3. Граник В.Г. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств: монография / В.Г. Граник, Н.Б. Григорьев. - М.: Вузовская книга, 2004. - 360 с.
4. Дорохина Л.В. Прооксидантно-антиоксидантное равновесие у крыс при гипотермии в условиях коррекции L-
аргинин-NO системы / Л.В. Дорохина, ВВ. Зинчук // Весщ НАН РБ. Сер. бiял. нав. - 2000. - №4. - С. 87-90.
5. Исследование эндотелио и кар-диопротективных эффектов комбинаций основных групп антигипертензивных средств с L-аргинином при экспериментальной эндотелиальной дисфункции/ Т. Г. Покровская [и др.] // Российский медико-биологический вестник им. акад. И.П. Павлова. - 2008. - №2. - С. 126-131.
6. Окислительная модификация белков: окисление триптофана и образование битирозина в очищенных белках с использованием системы Фентона / Е.Е. Дубинина [и др.] // Биохимия. - 2002. -Т. 67, вып. 3. - С. 413-421.
7. Окислительная модификация белков и изменение активности катепсина L селезенки крыс в условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота / Ю.В. Абаленихина [и др.] // Российский медико-биологический вестник им. акад. И.П. Павлова. - 2013. - №1. - С. 45-49.
8. Эндотелиопротекторные эффекты L-аргинина при моделированиии дефицита окиси азота / М.В. Покровский [и др.] // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2008. - Т. 71, №2. - С. 29-31.
9. Фомина Н.В. Оценка связи активности лизосо- мальных цистеиновых про-теиназ плазмы крови и показателей эндоте-лиальной дисфункции у пациен- тов с заболеваниями вен нижних конечностей / Н.В. Фомина, М.А. Фомина // Наука молодых (Eruditio Juvenium). - 2014. - №1. - С. 60-68.
10. Amado R. Dytyrosine: in vitro production and characterization / R. Amado, R. Aeschbach, H. Neukom // Methods En-zymol. - 1984. - Vol. 107. - P. 377-388.
11. Colak E. New markers of oxidative damage to macromolecules / E. Colak // JMB. - 2008. - P. 1-16.
12. Giulini C. Tyrosine oxidation products: analysis and biological relevance / C. Giulini, N.J. Traaseth, K.J. Davies // Amino Acids. - 2003. - №3-4. - P. 227-232.
13. Liang-Jun Y. Protein Redox Modification as a Cellular Defense Mechanism
against Tissue Ischemic Injury / Y. Liang-Jun // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. - 2014. - Vol. 2014. - Article ID 343154. -URL: http://dx.doi.org/10.1155/2014/343154
14. Nitric oxide as a cellular antioxidant: A little goes a long way / Stephen G. Hummel [et al.] // Free Radical Biology & Medicine. - 2006. - Vol. 40. - P. 501-506.
15. Nitric Oxide in Cell Survival: A Janus Molecule / Vittorio Calabrese [et al.] //
ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING.
- 2009. - Vol. 11, №11. - P. 2717-2739.
16. Oxidative and nitrosative stress markers in bus drivers / Pavel Rossner Jr. [et al.] // Mutation Research. - 2007. - Vol. 617.
- P. 23-32.
17. Wang Zun-Yi. Role of nitric oxide (NO) in ocular inflammation / Zun-Yi Wang, Rolf Hakanson // British Journal of Pharmacology. - 1995. - Vol. 116. - P. 2447-2450.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Абаленихина Юлия Владимировна - ст. преп. кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань. E-mail: abalenihina88@mail.ru
Фомина Мария Алексеевна - к.м.н., доц. кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань. E-mail: marya.fom@yandex.ru
