CC BY
49
УДК 577.353.23 Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2006 вып. 2
М. А. Федорова, И. Ю. Благовещенский, В. Б. Филимонов, Н. В. Кулева
НЕЭНЗИМАТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ АКТИНА IN VITRO ПОД ВЛИЯНИЕМ ФАКТОРОВ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО,
ГЛИКООКИСЛИТЕЛЬНОГО И НИТРОЗАКТИВНОГО СТРЕССОВ
В живых организмах наряду с ферментативными модификациями белковых молекул имеют место и неэнзиматические процессы (например, окисление и неэнзиматическое гли-козилирование), которые могут оказывать влияние на функциональную активность биомолекул, например, влияние на синтез цитокинов, выход лейкоцитов в ткани, активацию протеин-киназы С, фактора NF-kB, экспрессию генов (в том числе протоонкогенов) и апоптоз [4]. Неэнзиматические модификации могут быть одним из повреждающих факторов для биомолекул. Их негативное влияние на структуру и функционирование биомолекул, клеток и тканей проявляется при различных патологических состояниях: сахарный диабет, атеросклероз [19]. ишемия [23], различные нейродегенеративные расстройства [8], старение [27, 25] и др.
При патологических состояниях, как правило, одновременно действуют несколько модифицирующих факторов и трудно определить, какой именно фактор вызывает обнаруживаемые модификации аминокислотных остатков белков. Поэтому, установив модификации, вызываемые отдельными факторами, можно проанализировать факторы, действующие на белок при конкретных патологических состояниях организма. Можно выделить три типа патологических условий, в которых могут модифицироваться клеточные белки. Это окислительный, гликоокислительный и нитрозактивный стрессы.
Особое место среди мишеней для неэнзиматических модификаций занимает высококонсервативный внутриклеточный белок актин, входящий в состав цитоскелета и участвующий в процессах поддержания и изменения клеточной формы, движения внузриклеточ-ных структур и самих клеток, а также обеспечения сокращения мышечных клеток [7]. Высокое содержание в цитоплазме делает актин вероятной мишенью для окисления и гликоокисления. Однако исследованиям, касающимся актина как объекта окислительной и гли-коокислительной модификации, пока не уделено достаточного внимания [2], и сравнительная характеристика влияния различных окислительных и гликоокислительных агентов на его функциональные и структурные свойства является актуальной задачей.
В данной работе предложены модельные системы, создающие in vitro условия, которые имитируют разные виды стрессов. В работе были использованы три модельные системы неэнзиматической модификации. В качестве модели окислительного стресса использовали инкубацию с перекисью водорода. Известно, что инкубация с перекисью водорода способна приводить к окислительной модификации белковых молекул. Кроме того, в присутствии в среде катионов металлов с переменной валентностью перекись водорода способна вступать в реакцию Фентона, приводящую к образованию высоко реакционноспособного гидроксильного радикала и запуску свободно-радикальных реакций [26, 28]. Для изучения прямого действия перекиси водорода и для предотвращения свободно-радикальных взаимодействий в среду инкубации добавляют ЭДТА - хелатор двухвалентных катионов. Окислительная модификация белковой молекулы, вызванная действием перекиси водорода, может касаться различных аминокислотных остатков. Наиболее подвержены действию окислительного стресса остатки метионина, цистеина, триптофана, треонина.
В присутствии активных форм кислорода (АФК), таких как Н202, 02 , ОН-, в составе белка происходит интенсивное образование карбонильных производных. Последние возни-
© М. А. Федорова, И. Ю. Благовещенский, В Б. Филимонов, Н. В. Кулева, 2006
кают в результате окисления остатков лизина, аргинина, пролина и гистидина. Одновременно окислительная модификация белка может приводить также к образованию низкомолекулярных продуктов деградации белковой молекулы и к появлению высокомолекулярных продуктов, обусловленных формированием битирозиновых сшивок [28].
Неэнзиматическое гликозилирование является посттрансляционной модификацией, представляющей собой реакции глюкозы, а-оксоальдегидов и других производных сахаров со свободными аминогруппами белков. Образующиеся при этом фруктозамины постепенно претерпевают необратимые превращения с формированием конечных продуктов глубокого гликирования (КПГГ). Кроме того, в процессе присоединения гликирующего агента к свободным аминогруппам белков запускаются процессы автоокисления сахаров, приводящие к генерации АФК. Таким образом, действие гликирующего агента на молекулу белка приводит к комплексной гликоокислительной модификации белковой молекулы [11]. Для создания модели гликоокислительной модификации в работе использовали среду, содержащую глицеральдегид.
Известно, что при ряде заболеваний (воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта, диабет, ишемия, катексия, артриты, болезнь Альцгеймера [18] происходит гиперактивация фермента №Э-синтазы (N08), участвующего в синтезе оксида азота. В норме оксид азота (II), являясь вторичным мессенджером, выполняет важные регуляторные функции в организме. N0 известен как эндотелиальный расслабляющий фактор (ЕБКР), показана его роль в синаптической передаче нервного импульса, регуляции нормальной перистальтики кишечника, предотвращении гипоксической вазоконстрикции в легких, цитоток-сической функции макрофагов [1]. Но при гиперактивации N05 происходит значительное увеличение содержания N0 в клетке, что, в конечном итоге, приводит к нитрозоактивному стрессу и нитрозилированию белковых молекул. Клеточными мишенями N0 в первую очередь являются железосерные и гемсодержащие белки, гуанилатциклаза, сама N05, митохондриальные дыхательные ферменты, ферменты цикла Кребса, ферменты синтеза белка и нуклеиновых кислот. Кроме того, гиперпродукцию N0 связывают с индукцией процессов некроза и апоптоза.
Следует заметить, что сам по себе радикал N0 довольно стабильный и мало реакци-онно-способный при физиологических и даже патологических условиях (время полужизни 5 мин). Сам по себе он не оказывает значительного цитотоксического воздействия на клетку. Но при указанных выше патологиях в клетке, помимо гиперпродукции N0, происходит образование повышенного количества активных форм кислорода, таких как Н202 и 02 . N0 реагирует с супероксид анионом (02 ), формируя сильнейший оксидант - пероксинитрит [12]. При действии пероксинитрита на белки происходит их нитрозилирование. Остатки метионина и цистеина являются наиболее уязвимыми участками полипептидной цепи. Кроме того, возможна модификация белков по остаткам тирозина и триптофана. Нитрозилирование тирозиновых остатков может быть исключительно важным, так как у многих белков тирозиновые остатки являются сайтами регуляторного фосфорилирования/дефосфорилиро-вания, а также сайтами присоединения нуклеотидов. Таким образом, нитрозилирование белков может приводить к нарушению механизмов активации клеточных ферментов, а также ингибированию сигнальных путей клетки. Кроме того, нитрозилирование аминокислотных остатков является необратимым процессом, приводящим к исключению модифицированных ферментов из метаболической сети клетки [12]. В настоящей работе в качестве элемента нитрозактивного стресса использовали N0, продуцируемый 1 мМ нитропруссидом натрия.
В связи с вышеизложенным, задачей настоящей работы является выявление модификаций актина т УПго в условиях действия факторов окислительного, нитрозактивного и гликоокислительного стрессов.
Материалы и методы исследования. Для получения актина использовали мышечную ткань задних конечностей крыс. Актин выделяли по общепринятому методу [29]. Ацетоновый порошок экстрагировали буфером А (2 мМ HEPES; 0,5 мМ АТФ; 0,2 мМ СаС12; 0,01% NaN3). Концентрацию белка измеряли микробиуретовым методом [21]. После выделения актин разбавляли до конечной концентрации 1 мг/мл и инкубировали в присутствии глицеральдегида (в конечной концентрации 10 мМ), или нитропруссида (в конечной концентрации 1 мМ), или Н202/ЭДТА (в конечной концентрации 1 мМ и 0,1 мМ, соответственно) и без модифицирующих агентов (контроль) при 37 °С в течение суток. Далее пробы диализовали при 4 °С в течение ночи против буфера А.
Для измерения содержания свободных NH2-rpynn использовали 0,0025% тринигробензол-сульфоновую кислоту (TNBS) [20], для измерения количества свободных SH-групп использовали 5,5 -дитиобис-2-нитробензоивую кислоту (DTNB) [17]. Содержание свободных СО-групп измеряли при помощи 2,4-динитрофенилгидразина (ДНФГ) [11]. Изменение содержания битирозиновых сшивок оценивали при помощи флуориметрии с возбуждением флуоресценции в области 325 нм и регистрацией эмиссии в области 415 нм [16]. Изменение содержания триптофановых остатков в актине оценивали при помощи флуориметрии с возбуждением флуоресценции в области 297 нм и регистрацией эмиссии в области 340 нм [16]. Для оценки изменения содержания конечных продуктов глубокого пикирования в белках в данном исследовании применяли флуориметрию с возбуждением в области 370 нм и регистрацией эмиссии в области 440 нм [24]. Оценку содержания пентозидинов в белках проводили флуориметрическим методом с возбуждением в области 335 нм и регистрацией эмиссии в области 384 нм [24].
Результаты исследований и их обсуждение. Для оценки структурных изменений в молекуле актина скелетных мышц в условиях окислительного, гликоокислительного и нитрозоактивного стрессов мы определяли содержание карбонильных производных, оценивали изменение содержания свободных сульфгидрильных и аминогрупп, немодифицированных остатков триптофана, увеличение количества битирозиновых сшивок, конечных продуктов глубокого гликирования и пентозидинов (как частный случай КПГГ). Данные по модификации аминокислотных остатков актина in vitro под влиянием 1 мМ Н202,10 мМ глицеральдегида (ГА) и 1 мМ нитропруссида (НП) представлены на рис. 1.
Увеличение содержания карбонильных групп в белке является общепринятым маркером его окислительной модификации [10, 13]. Карбонильные производные белка возникают при модификации таких аминокислот, как аргинин, лизин, пролин, треонин и гистидин. Существует ряд аминокислот - метионин, цистеин и ароматические аминокислоты, -окислительная модификация которых не приводит к формированию СО-групп [12].
На рис. 1, А представлена диаграмма, иллюстрирующая изменение содержания карбонильных производных в молекуле актина после инкубации с перекисью водорода, глице-ральдегидом и нитропруссидом натрия. Как показано на рисунке, инкубация с перекисью водорода не приводит к достоверному изменению содержания СО-групп в молекуле актина. Видимо, модификация белка, вызванная перекисью водорода, не инициирует окисление таких аминокислотных остатков, как лизин, аргинин, пролин, гистидин, треонин.
Гликоокислительная модификация актина, напротив, приводит к повышению содержания карбонильных производных в актине на 46% относительно контрольного уровня. Глицеральдегид в данном случае выступает в качестве инициатора образования АФК в ходе гликоокислительной модификации актина. АФК, в свою очередь, и вызывают окислительную модификацию указанных выше аминокислот'.
В присутствии 1 мМ нитропруссида происходит снижение содержания карбонильных производных в молекуле актина по сравнению с контрольным уровнем. Это можно объяснить тем, что взаимодействие как самого N0, так и продуцирующего его агента (нитропруссида) может приводить к дальнейшему окислению карбонильной группы и, соответственно, невозможности ее детекции используемым в работе методом.
Формирование карбонильных производных тесно связано с изменением такого структурного параметра как содержание свободных аминогрупп в молекуле актина. В
А
70 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Б
80 * 70 § 60 £- 50 о 40
ьг
и 30
о ™
0
В
70 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Н202 ГА НП
Рис. I. Изменение содержания карбонильных, амино- и сульфгидрильных групп в молекуле актина после инкубации с перекисью водорода, глицеральдегидом и нитропруссидом.
По оси абсцисс: ГА - актин + глицеральдегид в концентрации 10 мМ; НП - актин + нит-ропруссид в концентрации ! мМ, гЬС>2 - актин + Н2О2 в концентрации 1 мм+ЭДТА в концентрации 0,1 мМ (то же для рис. 2).
По оси ординат: концентрация СО- (А), 1МН2- (£) и 5Н-групп (В) в молекуле актина, в % от контрольного уровня, составляющего соответственно 0,81, 63 и 3,54 моль на моль актина.
случае модификации актина перекисью водорода не происходит достоверного изменения содержания свободных аминогрупп в молекуле актина, что соответствует данным неизменного содержания карбонильных производных (см. рис. 1, Б). На основании этого можно заключить, что модификации лизиновых и аргининовых остатков в молекуле актина после инкубации с перекисью водорода не происходит.
В случае инкубации с глицеральдегидом наблюдается снижение свободных Т\ПН2-групп в актине на 39% относительно контрольного уровня. Модификация лизиновых и аргининовых остатков в условиях гликоокислительного стресса может происходить как за счет образования карбонильных производных (окислительная составляющая; см. рис. 1, А), так и за счет взаимодействия альдегидной группы глицеральдегида со свободными аминогруппами белка (гликирующая составляющая).
При инкубации актина скелетных мышц с нитропруссидом происходит уменьшение содержания свободных М-Ь-групп на 16% по сравнению с контрольным уровнем. Видимо,
небольшая модификация лизина и аргинина в составе молекулы актина все же происходит. Но она либо не ведет к формированию карбонильных производных, либо происходит дальнейшее окисление СО-групп под действием N0 и нитропруссида.
Так как изменение содержания аминогрупп в молекуле белка может быть обусловлено как формированием карбонильных производных на основе лизиновых и аргининовых остатков, так и их гликированием, мы оценили изменение содержания КПГГ и пентозиди-нов (как одной из форм КПГГ) в препаратах актина после инкубации с перекисью водорода, глицеральдегидом и нитропруссидом (рис. 2).
600
500
400
ллл
оии
200
100
О
Н2О2
ГА
НП
Рис. 2. Интенсивность флуоресценции, характерной для КПГГ, пентозидинов и битирозиновых сшивок в молекуле актина после инкубации с перекисью водорода, глицеральдегидом и нитропруссидом.
По оси ординат: флуоресценция КПГГ (А), пентозидинов (Б) и битирозиновых сшивок (В) в молекуле актина в % ог контрольного уровня.
Как показано на рис. 2, А, изменение интенсивное™ флуоресценции, связанной с КПГГ, происходит в препарате актина лишь после инкубации с глицеральдегидом. Причем уровень флуоресценции повышается на 440% относительно контрольного уровня. Глице-ральдегид, взаимодействуя со свободными аминогруппами в молекуле актина, запускает реакцию Майарда, приводящую к формированию конечных продуктов глубокого гликиро-вания. Большая часть КПГГ, образовавшихся при гликировании актина глицеальдегидом, представлена пентозидиновыми сшивками (см. рис. 2, Б).
В формировании пентозидиновой сшивки участвует остаток лизина, с одной стороны, и остаток аргинина - с другой. Сшивки могут быть как внутри- так и межмолекулярные. Таким образом, при модификации актина глицеральдегидом происходит значительная модификация остатков лизина и аргинина как за счет окислительной составляющей (формирование карбонильных производных), так и за счет гликирующей (формирование КПГГ и пентозидинов). Причем, принимая во внимание тот факт, что пентозидины составляют основную массу КПГГ, можно заключить, что происходит равновероятная модификация как лизина, так и аргинина.
Остатки цистсина наиболее подвержены окислительной модификации во всех цис1е-ин-содержащих белках, а в молекуле актина им принадлежит особая роль в регуляции процесса полимеризации [7]. В молекуле актина присутствует пять цистеиновых остатков, но лишь один из них, цистеин-374 экспонирован на поверхности глобулы актина. Остальные остатки цистеина, находясь внутри глобулы, менее подвержены модификации.
Данные о модификации БН-групп актина Н202, глицеральдегидом и нитропруссидом натрия представлены на рис. 1, В. Во всех случаях наблюдается уменьшение количества свободных БН-групп, наиболее выраженное у глицеральдегида - примерно на 60% от кон-рольного уровня. При исследовании методом.масс-спектрометрии продуктов модификации актина другим альдегидом гидроксиноненалем показано образование аддукта между альдегидом и цистеином-374 [9]. Гликоокислительная модификация актина глицеральдегидом, по-видимому, приводит к серьезным нарушениям структурной целостности молекулы, в результате чего часть ранее закрытых цистеинов экспонируется в растворитель и может подвергаться модификации за счет окислительной составляющей комплексного гликоокис-лительного процесса.
Следствием свободно-радикальных реакций является образование в белке битирози-новых сшивок. В результате действия свободных радикалов происходит отрыв фенольного атома водорода от тирозинового остатка, и возникают долгоживущие тирозильные радикалы. Эти радикалы могут взаимодействовать друг с другом и формировать стабильные ковалентные С-С связи, приводящие к формированию 1,3-битирозинов. Формирование битиро-зинов приводит к образованию внутри- и межмолекулярных сшивок.
При окислении актина перекисью водорода не происходит достоверного образования битирозиновых сшивок, что легко объяснимо нерадикальной природой пероксида (см. рис. 2. В). При действии глицеральдегида вследствие автоокислительных реакций происходит мощный выброс свободных радикалов, в частности гидроксильного радикала и супер-оксид-аниона [19], что приводит к возникновению большого числа битирозиновых сшивок в молекуле актина. В случае нитропруссида образование битирозинов происходит, но их процент по отношению к контролю весьма незначителен (28%) (что говорит о том, что нитрозоактивный стресс, видимо, осуществляется не радикалом N0, а его активированной формой пероксинитритом).
Еще одной мишенью неэнзиматических модификаций являются остатки триптофана. Окислительная модификация триптофана критична для белковой молекулы, гак как ее ре-зультом является разрыв пятичленного индольного кольца в составе аминокислоты и формирование структурно отличных соединений, таких как кинуренин, формил-кинуренин и их производных. В молекуле актина представлены остатка триптофана - в положении 79, 86, 340 и 356. Флуоресценция триптофановых остатков в молекуле актина обусловлена трип-тофанами в положении 340 и 356 [22]. Эти аминокислотные остатки расположены в субдомене 1, ответственном за межмономерные взаимодействия в фибриллярном актине.
На рис. 3 показано, как изменяются спектры флуоресценции триптофана в препаратах актина после инкубации с перекисью водорода, глицеральдегидом и нитропруссидом. При действии перекиси водорода не происходит изменения интенсивности флуоресценции
триптофана, что соответствует данным литературы [13]. При действии глицеральдегида происходит снижение уровня флуоресценции триптофана практически до нуля, что свидетельствует об окислительной модификации как триптофана-340, так и триптофана-356. Нитропруссид понижает интенсивность флуоресценции соответственно окислительной модификации как минимум одного из указанных остатков триптофана.
Подводя итог, можно заключить, что при окислительной модификации актина перекисью водорода выявлено лишь уменьшение содержания свободных БН-групп в молекуле актина, по-видимому, связанное с их нитрозилированием. Не происходит изменения содержания свободных аминогрупп, немодифицированных остатков триптофана, накопления карбонильных производных и битирозиновых сшивок. Из литературы известно, что при окислении актина перекисью водорода, происходит значительная модификация остатков метионина в составе актиновой молекулы [15]. Молекула актина содержит 16 остатков метионина, часть которых экспонирована на поверхность молекулы. Известно, что окислительная модификация метионина и формирование метионинсульфоксида приводит к изменению конформации и увеличению гидрофобности поверхности молекулы. Окисление некоторых «критических» метионинов в составе молекулы актина (позиции 178, 192 и 271) приводит к полному ингибированию полимеризации актина и нарушению стабильности актиновых микрофиламентов, что ведет к их деполимеризации. Видимо, окисление этих «критических» метионинов нарушает специфические нековалентные взаимодействия, которые в норме стабилизируют структуру актиновых филаментов [15].
Модификация глицеральдегидом приводит к существенным изменениям структурной целостности молекулы актина и затрагивает все структурные параметры, использованные в работе. За счет тесной взаимосвязи процессов гликирования и окисления при действии глицеральдегида происходит модификация остатков лизина и аргинина, обусловленная как окислением (формированием карбонильных производных), так и гликированием (накопле-
1200
0
310 330 350 370 390 410 430 450
Длина волны, нм
Рис. 3. Спектр флуоресценции триптофана в препаратах актина после инкубации с перекисью водорода (Н2С>2). глицеральдегидом (ГА) и нитропруссидом (НП), и в контрольном препарате (К).
нием значительного количества КПГГ). Кроме того, окислительная составляющая комплексного процесса гликоокисления приводит к значительному снижению количества свободных сульфгидрильных групп, критическому уменьшению содержания немодифициро-ванных остатков триптофана, накоплению большого числа битирозиновых сшивок. Видимо, при действии глицеральдегида на молекулу актина происходит частичное разрушение структуры молекулы, приводящее к значительному изменению конформации и экспозиции ранее закрытых участков молекулы. В наших предыдущих исследованиях [2, 3] мы показали, что инкубация Г-актина в присутствии 10 мМ глицеральдегида приводит к падению его способности активировать миозиновую АТФазу.
Действие нитропруссида на молекулу актина приводит к небольшому уменьшению содержания свободных сульфгидрильных и аминогрупп, а также немодифицированных остатков триптофана.
Полученные в работе данные позволяют провести анализ вклада окислительного, гликоокислительного и нитрозоактивного факторов в модификацию актина скелетных мышц на моделях различных патологических состояний. Ранее мы получили данные относительно модификации актина скелетных мышц на модели стрептозотоцинового диабета [6J. В препаратах актина, полученных из мышц задних конечностей крыс через 3 недели и 2 месяца после индукции экспериментального диабета, было выявлено значительное увеличение содержания КПГГ и в частности пентозидинов. В то же время происходило незначительное формирование карбонильных производных, что говорит о преимущественной модификации лизиновых и аргининовых остатков путем гликирования, а не окисления. Количество битирозиновых сшивок через 3 недели после индукции диабета возрастало на 500% относительно контрольного уровня. Через 2 месяца наблюдалось снижение этого показателя до 230%. Видимо, свободно-радикальные процессы, запускаемые автоокислением сахаров, более активны на начальных сроках течения заболевания и постепенно теряют свою силу. Сравнение этих данных с данными, полученными в настоящей работе, показывает, что в использованной нами модели диабета имеет место гликооксидативный стресс, о чем свидетельствует образование КПГГ, пентозидинов и битирозиновых сшивок.
Сравнение данных другой нашей работы, касающейся действия ионизирующей радиации с полученными в настоящей работе данными, показывает, что в in vivo модели действия ионизирующей радиации на организм животных [5] происходит значительное увеличение содержания, как карбонильных производных молекулы актина, так и увеличения би-тирозиновых сшивок. Причем увеличения количества битирозинов соответствовало препаратам актина, полученным через 3 ч после облучения, тогда как накопление карбонильных производных происходило на более поздних сроках. Кроме того, было зафиксировано уменьшение количества свободных сульфгидрильных групп, в процентном соотношении соответствующее модификации цистеина-374. Уменьшение интенсивности флуоресценции триптофана соответствовало модификации одного из двух флуоресцирующих триптофанов.
Таким образом, полученные в исследовании данные неэнзиматических модификаций актина in vitro помогают понять механизмы соответствующих модификаций актина при патологических состояниях организма.
Summary
Fedorova М. A., Biagoveschenskiy I. U., Filimonov V. В.. Kuleva N. V. Non-enzymatic modification of actin in vitro under the influence of factors of oxidative, glycooxidative and nitrosactive stress.
The influence of the factors of oxidative, glycooxidative and nitrosactie stress (ЬЬОо, glyceraldehyde, nltroprusside) on parameters of non-enzymatic actin modification (Nib-, SH-, CO-groups, bityrosine, tryptophan, advanced glycation end product (AGE), pentosidine- content) is studied. We have found the decrease of SH-groups under the action of all factors, and AGEs; pentosidines and bityrosines increase only under the
action of glyceraldehyde. The data can be interesting to realize mechanisms of actin modification under different pathologies.
Литература
1. Ивашкин В. Т.. Драпкина О. М. Клиническое значение оксида азота и белков теплового шока. М., 2001. 2. Кулева Н. В.. Коваленко 3. С. Изменение функциональных свойств актина при его гли-кировании in vitro // Биохимия. 1997. Т. 61, № 10. С. 1307-1313. 3. Кулева Н. В., Залесова 3. С. Исследование неэнзиматического гликозилирования и окислительных повреждений актина in vitro и in vivo// Цитология. 2000. Т. 61, № 10. С. 66-71. 4. Кулинский В. И. Активные формы кислорода и окси-дативная модификация макромолекул: польза, вред и защита // Соросовский образовательный журнал. 1999. № 1. С. 2-7. 5. Федорова М.А., Кулева Н.В. Повреждение актина мышц, вызванное общим рентгеновским облучением // Физиология мышц и мышечной деятельности мат. Ill Всерос. конф. М., 2005. С. 33 6. Фролов А. А.. Федорова М. А., Кулева Н. В. Влияние карнозина на гликоокислительную модификацию актина скелетных мышц и гистонов печени крыс в условиях диабета и преддиабета, индуцированных стрсптозотоцином // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2004. Вып. 2 (№ 1 Г). С. 14-21. 7. Хайт-лина С. Ю. Молекулярные механизмы динамики активных структур клетки: Автореф. докт. дис. СПб., 1997. 42 с. 8. Aksenov М. К, Aksenova М. V., Butterfield D. A. et. al. Protein oxidation in the brain in Alzheimer’s disease// Neuroscience. 2001. Vol. 103. P. 373-383. 9.AldiniG., Dalle-Donne I., Vistoli G. et. al. Covalent modification of actin by 4-hydroxy-trans-2-nonenal (HNE); IC-ESI-MS/MS evidence for Cys 374 Michael adduction // J. Mass Spectrom. 2005. Vol. 40. P. 946-954. 10. Ahmed N.. Agirov O., Minhas H. S. et. al. Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with deri-vatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidil-carbamate and application to Ns-carboxymetyl-lysine and NE-(l-carboxyethyl)lysine-modified albumin // Biochem. J. 2002. Vol. 364. P. 1-14. ll.AmiciA.. Levine R. L, Stadtman E. P. Conversion of amino acids residues in proteins and amino acid homopolimers to carbonyl derivatives by metal-catalysed reactions // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 3341-3346. 12. Berlett B. S., Stadtman E. R. Protein oxidation in aging, disease and oxidative stress // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 20313-20316. 13. Dalle-Donne J., Rossi R., Giustarini D„ Ltisini L., Milzani A.. Di Simplico P.. Colombo R. Actin carbonylation: from a simple marker of protein oxidation to relevant signs of severe functional impairment // Free Rad. Med. 2001. Vol. 31, N 9. P. 1075-1083. 14. Dalle-Donne J.. Rossi P., Milzani A., Di Simplico P., Colombo R. The actin cytoskeletors response tc oxidants: from small heat shock protein phospho-rylation to changes in the redox state of actin itself /7 Free Rad. Med. 2001. Vol. 31, N 12. P. 1624—1632. 15. Dalle-Donne J., Rossi R., Giustarini D.. Di Simplico P., Colombo R., Milzani A. Methionin oxidation as a major cause of the functional impairment of oxidized actin // Free Rad. Med. 2002. Vol. 32, N 9. P. 927-937. 16. Davis K. J. A. Protein damage and degradation by oxygen radicals // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. P. 9895-9900. n.EllmanG.L. Tissue sulfhydryl groups // Arch. Biochem. Biophys. 1959. Vol. 82. P. 70—77. 18. Esteves A. G, Jordan J. Nitric oxide and superoxide, a deadly cocktail U Annal. N.-Y. Acad. Sci. 2002. P. 206-21 1. 19. Hunt V., Dean Т., Wolff P. Hydroxyl radical production and autoxidative glycosylation // Biochem. J. 1988. Vol. 256. P. 205-212. 20. Habeeb A. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenysulfonie acid // Annal. Biochem. 1966. Vol. 14. P. 328-336. 21. Ithaki N. F.. Gill H. H. A micro-biurei method for estimating proteins // Analyt. Biochem. 1964. Vol. 9. P. 401 —408. 22. Kusnetsova I. М.. Yakusheva T. N.. Turoverov К. V. Contribution of separate tryptophan residues to instriusinc fluorescence of actin. Analysis of 3D structure // FEBS Lett. 1999. Vol. 452. P. 205-210. 23. Molitoris B. A. Role of actin cytoskeleton in ischemia-induced cell injury and repair // Pediatr Nephrol. 1997. Vol. 11. P. 761-767. 24. Monnier V. H.. Vshwanath V., Frank К. E.. Elmmets S. A.. Danchot P.. Kolin R. R. Relation between complication of type I diabetes and collagen-linked fluorescence. New England J. Med. 1986. Vol. 314(7). P. 403—408. 25. Olivers C. N.. Bong-whan A., Moennan E. J., Goldstein S.. Stadtman E. R. Age-related changes in oxidized protein //J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262, N 12. P. 5488-5491. 26. Stadt-man E. R.. Olivers C. N. Metal-catalyzed oxidation of proteins // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266, N 4. P. 2005-2008. 27. Stadtman E. R.. Berttlett B. S. Reactive oxygen-mediated protein oxidation in aging and disease /I Chem. Res. Toxicol. 1997. Vol. 10. P. 485—494. 28.SorgO. Oxidative stress: a theoretical model or a biological reality? // C. R. Biologies. 2004, Vol. 327. P. 649-662. 29. Spudich J. A.. Watt S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction // J. Biol. Chem. 1971. Vol. 246. P. 4966-4871.
Статья посту пила в редакцию 1 декабря 2005 г.
