CC BY
46
УДК 574.96:612,11/12±616.15
ВЗАИМОСВЯЗЬ АМИДИРОВАННОСТИ И ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ МОДИФИКАЦИЙ СЫВОРОТОЧНОГО АЛЬБУМИНА ПРИ ЕГО ИНКУБАЦИИ В СРЕДЕ ФЕНТОНА
© 2011 г. О.А. Дурканаева, А.А. Булгакова, И.А. Сорокина, А.И. Лукаш
Южный федеральный университет, Southern Federal University,
ул. Б. Садовая, 105/42, г. Ростов н/Д, 344006, B. Sadovaya St., 105/42, Rostov-on-Don, 344006,
decanat@bio. sfedu.ru decanat@bio. sfedu.ru
Исследован характер изменений амидированности и окислительных модификаций сывороточного альбумина при его инкубации в среде Фентона. Выявлены возможные взаимосвязи между содержанием амидных групп и их фракций и окислительными преобразованиями белка в экспериментах in vitro. Изучено влияние металл-катализируемых окислительных модификаций бычьего сывороточного альбумина (карбонилирование, окисление триптофана, образование битирозиновых сшивок), индуцированных системой Фентона, генерирующей активные формы кислорода, на амидированность белка. Выдвинуто предположение о вероятной принадлежности а-амидов, образующихся при окислительном расщеплении пептидных связей, к фракции легкогидролизуемых амидных групп.
Ключевые слова: посттрансляционные модификации белков, амидированность, окислительные модификации белков, карбонилирование.
The character of changes in amidation and oxidative modifications of serum albumin at it's incubation in Fenton reaction was researched. The goal of the present work was to define possible interaction between the content of amide groups and their fractions and oxidative transformations of the protein in in vitro experiments. The influence was investigated of metal-catalyzed oxidative modifications of bovine serum albumin (carbonylation, oxidation of tryptophan, formation of bityrosyl cross-links) induced by Fenton's system generating reactive oxygen species towards the amidation of protein. A suggestion was put forward about possible reference of a-amides formed at oxidative split ofpeptide bonds to the group of easily hydrolyzed of amide groups.
Keywords: posttranslational modification of proteins, amidation, oxidative modifications of proteins, carbonylation.
Посттрансляционные модификации (ПТМ) играют важную роль в процессах созревания, функционирования и деградации белков. Немаловажное значение в ПТМ структуры белковой молекулы наряду с другими модификациями, охватывающими широкий спектр химических превращений, имеет неферментативное дезамидирование остатков аспарагина и глутамина в полипептидной цепи [1]. Установлена разная устойчивость амидов к кислотному гидролизу: фракция легкогидролизуемых амидных групп (ЛАГ) принадлежит преимущественно аспарагину, а трудногидро-лизуемых (ТАГ) - глутамину [2]. Причины разной скорости кислотного гидролиза аспарагина и глутамина в белках обусловлены свойствами остатков этих аминокислот и влиянием ближайшего окружения. Гидролиз амидов, протекающий вследствие значительной лабильности амидных групп белковосвязан-ного аспарагина и глутамина, рассматривают как «молекулярные часы», определяющие продолжительность функционирования белковой молекулы [3]. Де-замидированные белки легче расщепляются тканевыми протеиназами, что рассматривается как способ выведения дефектных «старых» белковых молекул.
В нашей лаборатории на протяжении многих лет развивается представление, согласно которому механизм старения белковых молекул предопределен генетически заданной первичной структурой белка и связан с распределением и свойствами амидов дикар-боновых аминокислот аспарагина и глутамина в полипептидной цепи [4]. Неферментативное дезамиди-рование - функциональный процесс, происходящий при старении белков как в моделях на индивидуальных белках при физиологических условиях, так и in vivo. Функциональной биохимией накоплен большой материал о модификации амидных групп белков тканей при экстремальных и патологических состояниях организма [5]. В [5, 6] показано увеличение содержа-
ния дезамидированных белков при старении в популяции дрожжевых клеток, тканях белых крыс и хрусталике глаза крупного рогатого скота. Ранее было показано спонтанное отщепление амидных групп и в белках (лактоферрине, альбумине, у-глобулине, РНК-азе) в условиях, моделирующих физиологические.
Однако в процессе функционирования в клетках и биологических жидкостях неизбежны окислительные модификации радикалов аминокислот активными формами кислорода. Нами показаны изменения окислительных модификаций суммарных белков ряда тканей белых крыс с возрастом, которые сопровождались увеличением их амидированности [6]. Цель настоящей работы -выявление возможной взаимосвязи между содержанием амидных групп и их фракций и окислительными преобразованиями белка в экспериментах in vitro. Изучалось влияние металл-катализируемых окислительных модификаций бычьего сывороточного альбумина (БСА) (кар-бонилирование, окисление триптофана, образование битирозиновых сшивок), индуцированных системой Фентона, генерирующей активные формы кислорода, на амидированность белка.
Материалы и методы
Объект исследования - БСА («Диа-М», Россия). Для инициации его окислительной модификации использовали среду Фентона, состоящую из 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), Fe2+0,3TA комплекса (10-5мМ, 10-4мМ, 10-3мМ), который готовили ex tempore, и Н2О2 [7]. С целью исследования степени окислительной деструкции белка в зависимости от количества вносимых реагентов и времени инкубации компоненты среды были взяты в трёх концентрациях (10-5, 10-4, 10-3мМ). Концентрация белка в пробах составляла 1 мг/мл. Пробы инкубировали при 37 °С в течение 15 мин, 1 и 2 ч.
Количество суммарных амидных групп (САГ) и фракций амидов - ЛАГ и ТАГ (которые выделяют аммиак при гидролизе в 1 н Н^04 при 100 °С в течение 15 мин и 3 ч соответственно [8]) определяли флуорометрическим методом [9] на спектрофлуори-метре «Shumadzu» (США) (Хвозб = 413 нм и Хэмиссии = 476 нм) и выражали в мкмоль азота аммиака на 1 г белка. По содержанию амидов данных фракций в первом приближении можно судить о количестве Абп и в1п в белке [8].
Степень окислительной модификации белков (ОМБ) определяли по методу Левина [10] в модификации Е. Дубининой [7]. Метод оценки ОМБ основан на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, количественный прирост которых регистрировали на спектрофотометре «Васктап» (США) при Х=370 нм.
Уровень карбонильных групп рассчи- 16
тывали, используя коэффициент молярной
-1 .-1
Фракции ТАГ при данных условиях инкубации достоверно не изменяются.
В то же время инкубация БСА в 10-4 мМ среде Фентона отражалась на уровне ЛАГ и САГ значительно слабее.
Инкубация БСА в 10-5 мМ среде Фентона не вызывала статистически достоверных изменений в уровне его амидированности.
Об окислительной модификации БСА судили по изменениям карбонильных групп, образованию бити-розиновых сшивок и изменению флуоресценции триптофана.
Наиболее информативным показателем при анализе металл-катализируемого окисления белков является образование карбонильных производных, которые в присутствии 2,4-ДНФГ образуют 2,4-динитрофенил-гидразоны, регистрируемые при длине волны 370 нм (рис. 2).
экстинции (Е), равный 22 000 моль'см при Х=363 нм для 2,4-ДНФГ-производных.
После инкубации интенсивность ОМБ оценивали также по степени образования битирозиновых сшивок и снижению флуоресценции триптофана. Измерения проводились на спектрофлуориметре «Shumadzu» (США). Изменения триптофана регистрировались при Хвозб=295 нм и Хисп=340 нм. Образование битирозина регистрировались при Хвозб=325 нм и Хисп=415 нм [11].
Данные, представленные в работе, являются средними величинами 8^10 повторных определений.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью ^критерия Стью-дента. Статистические взаимосвязи между показателями оценивались применением корреляционного анализа [12].
Результаты и обсуждение
Исследована динамика содержания амидных групп БСА в зависимости от времени инкубации и концентрации реагентов среды Фентона с целью выявления взаимосвязи амидированости и индуцированных металл-катализируемых ОМБ.
Инициация реакции Фентона внесением в инкубационную смесь Н2О2 (10-3 мМ) и инкубация в течение 15 мин способствует увеличению степени ами-дированности БСА на 8,5 %. Дальнейшее увеличение времени инкубации БСА в среде Фентона до 2 ч предположительно сопровождается деградацией белка, что нашло своё отражение в повышении содержания фракции ЛАГ на 15,1 % (рис. 1).
Динамика содержания САГ в БСА аналогична изменению уровня амидных групп во фракции ЛАГ на протяжении временных периодов инкубации в среде Фентона.
а
и X о
а
14
12 10
8-
2-
-2
Рис.
Е>гч им
0мин 1Б мин 1 н
Д I Д I
ЛАГ
ТАГ САГ
Фракции амидных групп
1. Содержание амидных групп и их фракций при индуцированном средой Фентона [10-3] металл-катализируемом окислении БСА; • - достоверные различия (р < 0,05) по отношению к контролю (без среды Фентона);
Н - фракция ЛАГ; И - фракция ТАГ; И - САГ
Концентрация реагентов среды Фентона, N
Рис. 2. Зависимость уровня содержания карбонильных групп в БСА от времени инкубации в среде Фентона и от концентрации реагентов среды; • - достоверные различия (р < 0,05) по отношению к контролю (без среды Фентона);
Н - 10"5 мМ; В - 10"4 мМ; Ш - 10"3 мМ
Карбонильные группы образуются при окислении лизина, аргинина, гистидина, пролина, треонина, глута-миновой и аспарагиновой кислот [13]. Нами установлен 10-кратный прирост карбонильных групп к 15 мин инкубации в среде Фентона (10-3 мМ). Дальнейшее увеличение срока инкубации до 2 ч сопровождается приростом содержания карбонильных групп еще на 42 %, что в 15 раз выше контрольного значения.
Окисление остатков лизина, аргинина, гистидина, треонина непосредственно приводит к образованию альдегидных и кетонных производных, окислительные модификации пролина, глутаминовой и аспара-гиновой кислот способствуют разрыву полипептидной цепи с образованием пирувильной группы из N концевой аминокислоты. Окислительный разрыв полипептидной цепи белка по пути а-амидирования также может приводить к образованию 2-кетоациль-ного производного из М-концевой аминокислоты [14].
Известны 4 механизма разрыва пептидной связи, вызванного активными формами кислорода: расщепление алкоксильных производных пептидов через а-амидный путь, диамидный путь, окисление боковых частей глутамильных и аспартильных остатков и окисление боковой части остатка пролина. Диамид-ный путь разрыва полипептидной цепи, а также окисление боковых частей глутамильных и аспартильных остатков и окисление гистидина способствуют нарастанию уровня амидных групп в продуктах окислительной деструкции белка [14, 15].
На основе полученных результатов можно сделать вывод, что увеличение времени инкубации БСА в среде Фентона и повышение концентрации реагентов среды сопровождается повышением содержания карбонильных групп в данном белке.
Сопоставление результатов по изменениям амиди-рованности и окислительным модификациям позволяет предположить, что фракция ЛАГ представлена в белках остатками аспарагина, а также другими амид-ными производными разнообразной этиологии, образующимися в ходе окислительной деградации полипептидной цепи.
Динамика битирозиновых производных соответствует динамике карбонильных групп при инкубации в среде Фентона с коэффициентом корреляции между данными показателями - 0,91.
Внесение в инкубационную смесь Ре2+-ЭДТА (10-3 мМ) инициирует реакцию Фентона, генерирующую свободнорадикальные процессы и мгновенное (0 мин) окисление триптофана, что выражается в снижении интенсивности флуоресценции на 57 % и свидетельствует о хорошей доступности триптофана к окислительному воздействию. К 2 ч инкубации БСА в среде Фентона степень окисления триптофановых остатков изменяется еще на 43 %, что выражается в снижении интенсивности флуоресценции на 75 % по отношению к контролю.
При этом необходимо отметить, что коэффициент корреляции между количеством ЛАГ и степенью окислительных повреждений белка (содержанием карбонильных групп, тирозина и триптофана) очень высок и равен 0,99, 0,88 и -0,94 соответственно, что, по-видимому, свидетельствует о принадлежности а-амидов,
Поступила в редакцию_
образующихся при окислительном расщеплении пептидных связей, к фракции ЛАГ.
Таким образом, БСА, инкубированный в 10-3 мМ среде Фентона, в большей степени подвержен структурным перестройкам, вызванным фрагментацией белковой молекулы вследствие окисления и увеличением амидных групп по сравнению с белком, инкубированным в среде Фентона с меньшими концентрациями реагентов.
Установленное в настоящей работе возрастание амидированности при стимуляции окислительной деструкции БСА в эксперименте in vitro указывает на возможную причину увеличения содержания амидов в белках некоторых тканей животных с возрастом, показанных нами ранее [6].
Литература
1. Robinson A., Robinson R. Molecular clocks // Proc. Naatl. Sci. USA. 2001. Vol. 98. P. 944 - 949.
2. Wright H.T. Nonenzymatic deamidation of asparaginyl and glutaminyl residues in proteins // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 1991. Vol. 26. P. 1 - 52.
3. Robinson N., Robinson A. Molecular clocks. Deamida-tion asparaginyl and glutaminyl residues in peptidues and proteins. Ontario, Canada. 2004. P. 19 - 43.
4. Аспарагинзависимая селективная автофрагментация белка на примере рибонуклеазы / Л.П. Олехнович [и др.] // Докл. АН СССР. 1985. Т. 281, № 1. С. 217 - 220.
5. Взаимодействие неферментативных процессов деза-мидирования и гликирования и их влияние на устойчивость к протеолизу и функциональную активность алкогольде-гидрогеназы / И.Н. Назарова [и др.] // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. 2005. Спецвыпуск. С. 48 - 51.
6. Сорокина И.А., Лукаш А.И., Дурканаева О.А. Возрастные изменения амидированности и карбонилирования белков тканей белых крыс // Изв. вузов. Сев.-Кавк. регион. 2009. № 1. С. 74 - 78.
7. Окислительная модификация белков плазмы крови больных психическими расстройствами (депрессия, деперсонализация) / Е.Е. Дубинина [и др.] // Вопр. мед. химии. 2000. Т. 46, № 4. С. 398 - 409.
8. Пушкина Н.В. Неферментативное дезамидирование и автофрагментация лизоцима и альбумина в условиях, моделирующих физиологические // Укр. биохим. журн. 1988. Т. 60, № 4. С. 9 - 14.
9. Sugawara K., Oyama F. Fluorogenic reaction and specific microdetermination of Ammonia // J. Biochem. 1981. Vol. 5. P. 771 - 774.
10. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins / R. Levine [et al.] // Met. Enzymol. 1990. Vol. 186. P. 464 - 478.
11. ОМБ: окисление триптофана и образование битиро-зина в очищенных белках с использованием системы фен-тона / Е.Е. Дубинина [и др.] // Биохимия. 2002. Т. 67, вып. 3. С. 413 - 421.
12. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1973. 170 с.
13. Chakravart B., Chakravart D.N. Oxidative modification of proteins: age-related changes // Gerontology. 2007. Vol. 53. P. 128 - 139.
14. Berlett B.S., Stadtman E.R. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress // The J. of Biological Chemistry. 1997. Vol. 272, № 33. P. 20313 - 20316.
15. Лущак В.И. Свободнорадикальное окисление белков и его связь с функциональным состоянием организма // Биохимия. 2007. Т. 72, вып. 8. С. 995 - 1017.
24 мая 2011 г.
