CC BY
0INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
ВЛИЯНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ
МИКРОВОДОРОСЛЕЙ
1Кадирова Г.Х., 2Комолова Ш., 3Шонахунов Т.Э.
1Доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Института микробиологии АН
РУз
2Базовый докторант Ташкентского Государственного Политехнического Университета 3Младший научный сотрудник Института Микробиологии Академии Наук Республики
Узбекистан https://doi.org/10.5281/zenodo.13846965
Аннотация. В этой работе изучено влияние ионов тяжелых металлов Cu2+, Co2+ и Pb2+ на рост и развитие и морфологические свойства местных штаммов микроводорослей рода Chlorella, Scenedesmus, Nostoc и Anabaena. Было выявлено, что на 7 сутки культивирования микроводорослей Chlorella vulgaris 4 и Anabaena variabilis 17 показатели оптической плотности (ОП540) культур в присутствии ионов Cu2+ в концентрации 118,0 мг/л и 354,0 мг/л повышается на 21 и 38,4% и 66,8 и 95,5%, соответственно. В присутствии ионов свинца на 7 сутки культивирования рост и развитие Scenedesmus quadricauda в концентрации 95,9 мг/л и 287,7 мг/л увеличивается на 43,7% и 57,6% к контролю, соответственно. Также было установлено, что размер клеток Chlorella vulgaris 4 в присутствии ионов Cu2+ в концентрации 59,0 мг/л уменьшается от 1,5 до 2,5 мкм в диаметре. Следует отметить, что при более высокой концентрации меди в составе питательной среды в концентрации 118,0 мг/л клетки Chlorella vulgaris 4увеличивается на 3 - 5 мкм в диаметре по отношению к контролю.
Ключевые слова: микроводоросли, тяжелые металлы, медь, кобальт, свинец, устойчивость, оптическая платность, морфология клеток
Abstract. This work studied the effect of heavy metal ions Cu2+, Co2+ and Pb2+ on the growth and development and morphological properties of local strains of microalgae of the genus Chlorella, Scenedesmus, Nostoc and Anabaena. It was found that on the 7th day of cultivation of microalgae Chlorella vulgaris 4 and Anabaena variabilis 17, the optical density (OD540) of the cultures in the presence of Cu2+ ions at a concentration of 118.0 mg /1 and 354.0 mg /1 increased by 21 and 38.4% and 66.8 and 95.5%, respectively. In the presence of lead ions on the 7 th day of cultivation, the growth and development of Scenedesmus quadricauda at a concentration of 95.9 mg /1 and 287.7 mg /1 increased by 43.7% and 57.6% of the control, respectively. It was also found that the size of Chlorella vulgaris 4 cells in the presence of Cu2+ ions at a concentration of 59.0 mg/l decreases from 1.5 to 2.5 цт in diameter. It should be noted that at a higher copper concentration in the nutrient medium at a concentration of 118.0 mg/l, Chlorella vulgaris 4 cells increase by 3-5 цт in diameter relative to the control.
Keywords: microalgae, heavy metals, copper, cobalt, lead, stability, optical density, cell morphology
Введение
На сегодняшний день к тяжелым металлам (ТМ) относят более 40 элементов периодической системы Д.И. Менделеева с атомной массой свыше 50 атомных единиц: V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Mo, Cd, Sn, Hg, Pb, Bi и др. Несмотря на значительную работу
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
ученых и органов власти по снижению опасного влияния различных загрязнителей на качество жизни населения, проблемы выявления рисков для состояния общественного здоровья продолжают оставаться актуальными. На сегодняшний день одним из самых опасных поллютантов являются ТМ и наблюдение за концентрациями которых обязательны во всех экологических нишах [1-5]. В связи с несовершенными системами очистки ТМ попадают в окружающую среду, в том числе и в почву, загрязняя и отравляя ее. Следует отметить, что экологически чистым и экономически дешевом методом является биологические методы, то есть использование для ремедиации окружающей среды от ТМ -микроорганизмов, таких как бактерии, актиномицеты, грибы, водоросли, цианобактерии, а также лишайники, растения и т. д.
Микроводоросли — это фотосинтетические микроорганизмы, использующие солнечный свет для преобразования CO2 из атмосферы в органический углерод. Существуют эукариотические микроводоросли, такие как зеленые микроводоросли [6], красные микроводоросли [7], диатомовые [8] и прокариотические цианобактерии [9]. Металлы в малых концентрациях необходимы клеткам микроводорослей для выполнения клеточных функций. Они действуют как компоненты фотосинтетических белков переноса электронов (Cu, Fe) и фотосинтетических центров окисления воды (Mn) или являются составными частями витаминов (Co) [10]. Они также служат кофакторами для ферментов, участвующих в фиксации CO2 (Zn в карбоангидразе), транскрипции ДНК (Zn в РНК-полимеразе) и усвоении фосфора (Zn в щелочной фосфатазе) или ассимиляции N2 (Mo, Fe, V в нитрогеназе) и восстановлении нитрата (Mo в нитрате и Fe в нитритредуктазе) [11-13]. Однако высокие концентрации этих металлов и других несущественных ТМ (Hg, As, Cd, Pb, Cr) вызывают негативные эффекты (нарушение фотосинтетического механизма, блокирование деления клеток, ингибирование активности ферментов) в клетках микроводорослей [14]. Металлы также влияют на морфологию клеток микроводорослей. Накопление кадмия (Cd) в клетках Chlamydomonas acidophila привело к увеличению размера клеток и разложению полифосфатных телец [15]. Присутствие свинца (Pb) в культуре Chlorella sorokiniana приводило к деформированию хлоропластов и образованию колоний клеток Chlorella, имеющих липидные капли цитоплазмы [16].
Целью исследования является изучение влияния ионов тяжелых металлов Cu2+, Co2+ и Pb2+ на морфологические свойства и рост развитие местных штаммов микроводорослей.
Материалы и методы исследования
Объекты и образцы исследования. Объектом исследования являются местные штаммы микроводорослей рода Chlorella, Scenedesmus Nostoc и Anabaena выделенные из водных и почвенных образцов Узбекистана [17-19].
Культивирование микроводорослей. Микроводоросли рода Chlorella, Scenedesmus выращивали на минеральной среде «Чу-13» следующего состава, г/л: KNO3 - 0,2, K2HPO4
- 0,04, MgSO4 х 7H2O - 0,1, CaChx6H2O - 0,08, цитрат железа - 0,01, лимонная кислота -0,1. Микроэлементы, мкг/л: B - 0,5, MnSO4 х 7H2O - 0,5, CuSO4 х 5H2O - 0,02, CoCh х 2H2O
- 0,02, Na2MoO4 х 2H2O - 0,02; при pH - 7,5. Цианобактрии рода Nostoc и Anabaena на среде Bg-110 [20]. Культивирование микроводорослей проводилось в аэробных условиях при температуре 28°C в режиме круглосуточного освещения люминесцентными лампами. Резистентность микроводорослей к ионам ТМ определяли при их культивировании на соответствующих жидких питательных средах с добавлением в среду культивирования
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
различных концентраций Cu2+, Co2+ и Pb2+. Морфологические признаки микроводорослей под воздействием ТМ изучали у молодых (24-28 часовых) и 3-5-суточных культур.
Концентрации ионов тяжелых металлов. При изучении устойчивости микроводорослей использовали концентрации ТМ (Cu2+, Co2+ и Pb2+), которые превышает предельно допустимые концентрации (ПДК) данных металлов в 5, 10 и 30 раза. В качестве солей ТМ использовали CuSO4x5H2O, CoSO4x7H2O и Pb(NOs)2.
Оптическую плотность (ОП540) культур определяли на спектрофотометре V-5100 (Китай). Учет результатов проводили в 1, 3, 5 и 14 сутки культивирования в присутствии различных концентраций ионов тяжелых металлов, сравнивая плотность культур в опытных и контрольных вариантах.
Результаты и их обсуждение
Ранее нами были выделены местные штаммы микроводорослей рода Chlorella, Scenedesmus, Nostoc и Anabaena из различных почвенных и водных образцов Республики [17-19].
В этой работе изучено влияние ионов тяжелых металлов Cu2+, Co2+ и Pb2+ на рост и развитие и морфологические свойства местных штаммов микроводорослей рода Chlorella, Scenedesmus, Nostoc и Anabaena. Результаты определения оптической плотности (ОП540) микроводорослей в процессе культивирования под воздействием различных концентраций солей ТМ (меди и свинца) приведены в таблицах 1 и 2. Согласно таблицы 1 на 7 сутки культивирования микроводорослей Chlorella vulgaris 4 и Anabaena variabilis 17 показатели ОП540 культур в присутствии ионов Cu2+ в концентрации 118,0 мг/л и 354,0 мг/л повышается на 21 и 38,4% и 66,8 и 95,5%, соответственно. В присутствии ионов свинца на 7 сутки культивирования рост и развитие Scenedesmus quadricauda в концентрации 95,9 мг/л и 287,7 мг/л увеличивается на 43,7% и 57,6% к контролю, соответственно. Однако, при культивировании S. quadricauda в течение 14 суток при тех же условиях значение ОП540 культуры снижается на 12,1% и 36,5%. В течение 14 суток культивирования при более низкой концентрации свинца (48,0 мг/л) рост и развитие этой культуры практически остается на уровне контрольного варианта (табл.2). Аналогичные результаты получены при изучения образования биомассы исследуемыми микроводорослями в присутствии различных концентраций кобальта (119,2 мг/л; 238,5 мг/л и 715,5 мг/л) в составе питательной среды. Известно, что микроводоросли способны справляться с присутствием ТМ в окружающей среде, что делает их перспективными микроорганизмами для изучения с целью будущего применения в области биоремедиации. Загрязняющие вещества могут трансформироваться, храниться или далее метаболизироваться в клетках микроводорослей [21].
Проведенными микроскопическими исследованиями было вывлено, что у исследуемых наиболее резистентных микроводоролслей обнаружено некоторые морфологические изменения в клетках штаммов. В следующей серии экспериментов изучали морфологические характеристики культур в присутствии различных концентраций ионов ТМ. Контролем служили: 1) питательная среда с исследуемой культурой, не содержащая ионы ТМ (Cu2+ и Co2+); 2) культуры, выращенные в питательной среде содержащая ионы ТМ. Известно, что изменение биосинтетических процессов и морфологических изменений у микроорганизмов под влиянием ТМ носит различный характер. В наших исследованиях отмечено, в частности такие ТМ, как Со и Cu снижали
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
содержание фотосинтетических пигментов и нарушали ультраструктуру клеток одноклеточных зелёных микроводорослей Chlorella vulgaris 4 и цианобактерий Nostoc calcicola (рис.1, 2). Как видно из рисунка 1 размер клеток Chlorella vulgaris 4 в норме составляет от 4 до 8 мкм в диаметре, а в присутствии ионов Cu2+ в концентрации 59,0 мг/л размер клеток культуры уменьшается от 1,5 до 2,5 мкм в диаметре.
Таблица 1
Оптическая плотность (ОП540) микроводорослей при различных концентраций ионов
Œ2+
№ Культуры Cu2+, мг/л
59,0 118,0 354,0 59,0 118,0 354,0
7 сут 14 сут
1 Контроль 0,494±0,03 0,756±0,02
Chlorella vulgaris 4 0,545±0,03 0,598±0,03 0,684±0,02 0,745±0,02 0,812±0,03 0,421±0,03
2 Контроль 0,346±0,03 0,695±0,02
Scenedesmus quadricauda 0,489±0,03 0,584±0,02 0,664±0,01 0,694±0,02 0,595±0,03 0,446±0,03
3 Контроль 0,338±0,02 0,546±0,03
Anabaena variabilis 17 0,448±0,03 0,564±0,02 0,661±0,03 0,614±0,03 0,812±0,03 0,624±0,03
4 Контроль 0,386±0,03 0,616±0,01
Nostoc calcicola 0,479±0,02 0,613±0,03 0,724±0,01 0,564±0,03 0,714±0,03 0,586±0,03
Таблица 2
Оптическая плотность (ОП540) микроводорослей при различных концентраций ионов
Pb2+
№ Культуры Pb2+, мг/л
48,0 95,9 287,7 48,0 95,9 287,7
7 сут 14 сут
1 Контроль 0,379±0,03 0,712±0,02
Chlorella
vulgaris 4 0,487±0,02 0,635±0,01 0,765±0,03 0,725±0,03 0,786±0,03 0,446±0,02
2 Контроль 0,434±0,01 0,667±0,03
Scenedesmus
quadricauda 0,512±0,02 0,624±0,02 0,684±0,03 0,674±0,02 0,586±0,03 0,423±0,03
3 Контроль 0,423±0,02 0,596±0,03
Anabaena
variabilis 17 0,486±0,03 0,584±0,01 0,686±0,03 0,597±0,03 0,541±0,03 0,512±0,02
4 Контроль 0,386±0,03 0,616±0,02
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" 25-26 SEPTEMBER, 2024
Nostoc
calcicola 0,485±0,02 0,604±0,03 0,568±0,03 0,528±0,02 0,628±0,03 0,543±0,02
Следует отметить, что при более высокой концентрации меди в составе питательной среды в концентрации 118,0 мг/л клетки Chlorella vulgaris 4 увеличивается на 3 - 5 мкм в диаметре по отношению к контролю (рис.1). Наример, накопление кадмия (Cd) в клетках Chlamydomonas acidophila привело к увеличению размера клеток и разложению полифосфатных телец [15]. Следует отметить, что при наличие в составе среды ионов кобальта в концентрации 238,5 мг/л и 715,5 мг/л клетки Chlorella vulgaris 4 теряет свою четкую овальную форму и приобретает неправильную форму. Следовательно, клетки увеличиваются на 2 -2,5 мкм и становятся более округлой формы.
а б в г
Рис. 1. Микрофотографии Chlorella vulgaris 4 под влиянием различных концентраций
ионов тяжелых металлов Cu2+: а) контроль, б) 59,0 мг/л; в) 118,0; г) 354 мг/л
(Увеличение:10х100)
Клетки азотфиксирующих местных штаммов цианобактерий Nostoc calcicola в контрольных культурах имеет структурированный вид, т.е. на поле зрения под микроскопом видны хорошо развитые трихомы, гетероцисты и акинеты (рис.7). В присутствии ионов Со2+ в концентрации 715,5 мг/л, клетки в трихомах Nostoc calcicola укарачиваются, на поле зрения под микроскопом гетероцист меньше, а акинетов больше, чем в контрольных культурах (рис.2). В последнее время по всему миру было выделено значительное количество штаммов цианобактерий, которые используются для очистки загрязненных систем in-vitro или in-vivo. Следовательно, цианобактерии подвергаются многочисленным стрессам, таким как гербициды, засоление, температура, pH и ТМ. В такой среде тяжелые металлы либо адсорбируются, либо детоксифицируются, либо улетучиваются цианобактериями из субстрата, где они растут [22]. Все штаммы цианобактерий имеют специфическую химическую природу по сравнению с другими микробами, и их поверхностные качества играют положительную роль в механизме адсорбции. Поверхности адсорбентов модифицируются, чтобы стать положительно или отрицательно заряженными, чтобы повысить эффективность адсорбционного удаления [23,24]. Заключение
В последние годы в связи с увеличением загрязнениия Земли ТМ исследователи уделяют большое внимание их детоксикации. В этой сязи микроводоросли с их повсеместной природой, очевидно, могли бы быть экономически эффективным и альтернативным инструментом для очистки загрязненных сред от ТМ. Полученные результаты свидетельстует о том, что местные штаммы микроводорослей могут играть значительную роль в механизме сорбции ТМ. Проведенные исследования показывает, что
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
рост и развитие микроводорослей наблюдался во всех вариантах концентраций солей ТМ (Cu2+, Co2+ и Pb2+) в питательной среде на протяжении всего периода культивирования, следовательно, добавление этих металлов в указанных концентрациях не оказывает летального действия на исследованные микроводоросли. Таким образом, местные штаммы микроводорослей Chlorella vulgaris 4, Scenedesmus quadricauda, Anabaena variabilis 17 и Nostoc calcicola продемонстрировали устойчивость к стрессу от тяжелых металлов.
Рис. 2. Микрофотографии цианобактерий Nostoc calcicola под влиянием концентраций ионов тяжелых металлов Со2+: а) контроль б) 715,5 мг/л
(Увеличение:10х100)
REFERENCES
1. Hazrat Ali & Ezzat Khan (2017): What are heavy metals? long-standing controversy over the scientific use of the term 'heavy metals'—proposal of a comprehensivedefinition, Toxicological & Environmental Chemistry, DOI: 10.1080/02772248.2017.1413652
2. John H. Duffus "HEAVY METALS"—A MEANINGLESS TERM? (IUPAC Technical Report) Pure Appl. Chem., Vol. 74, No. 5, pp. 793-807, 2002.
3. Tchounwou PB, Yedjou CG, Patlolla AK, Sutton DJ. Heavy metal toxicity and the environment. Exp Suppl. 2012; 101:133-64. doi: 10.1007/978-3-7643-8340-4_6. PMID: 22945569; PMCID: PMC4144270.
4. Джувеликян Х.А., Щеглов Д.И., Горбунова Н.С. Загрязнение почв тяжелыми металлами. Способы контроля и нормирования загрязненных почв: учебно-методическое пособие для вузов. Воронеж: Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета, 2009. 22 с.
5. Важные аспекты организации деятельности государственных инспекторов в сфере переработки отходов // Вестник экологии. 2018. № 1. С. 49.
6. Leliaert F., Smith D.R., Moreau H., Herron M.D., Verbruggen H., Delwiche C.F., de Clerck O. Phylogeny and molecular evolution of the green algae. CRC Crit. Rev. Plant Sci. 2012; 31:1-46. doi: 10.1080/07352689.2011.615705.
7. Scott J.L., Baca B., Ott F.D., West J.A. Light and electron microscopic observations on Erythrolobus coxiae gen.et sp. nov. (Porphyrideophyceae, Rhodophyta) from Texas U.S.A. Algae. 2006; 21:407-416. doi: 10.4490/ALGAE.2006.21.4.407.
8. Mann D.G. The species concept in diatoms. Phycologia. 1999; 38:437-495. doi: 10.2216/i0031-8884-38-6-437.1.
б
а
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS"
_25-26 SEPTEMBER, 2024_
9. Komarek J. Cyanobacterial taxonomy: Current problems and prospects for the integration of traditional and molecular approaches. Algae. 2006; 21:349-375. doi: 10.4490/ALGAE.2006.21.4.349.
10. Andersen R.A. Algal Culturing Techniques. Elsevier Academic Press; San Diego, CA, USA: 2005.
11. Sunda W.G. Feedback interactions between trace metal nutrients and phytoplankton in the ocean. Front. Microbiol. 2012 doi: 10.3389/fmicb.2012.00204
12. Bothe H., Schmitz O., Yates M.G., Newton W.E. Nitrogen fixation and hydrogen metabolism in cyanobacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2010; 74:529-551. doi: 10.1128/MMBR.00033-10.
13. Vega J.M., Herrera J., Aparicio P.J., Paneque A., Losada M. Role of molybdenum in nitrate reduction by Chlorella. Plant Physiol. 1971; 48:294-299. doi: 10.1104/pp.48.3.294.
14. Monteiro C.M., Castro P.M.L., Malcata F.X. Metal uptake by microalgae: Underlying mechanisms and practical applications. Biotechnol. Prog. 2012; 28:299-311.
15. Nishikawa K., Yamakoshi Y., Uemura I., Tominaga N. Ultrastructural changes in Chlamydomonas acidophila (Chlorophyta) induced by heavy metals and polyphosphate metabolism. FEMS Microbiol. Ecol. 2003; 44:253-259. doi: 10.1016/S0168-6496(03)00049-7.
16. Carfagna S., Lanza N., Salbitani G., Basile A., Sorbo S., Vona V. Physiological and morphological responses of lead and cadmium exposed Chlorella sorokiniana 211-8K (Chlorophyceae) Springerplus. 2013; 2:147. doi: 10.1186/2193-1801-2-147.
17. Шакиров З.С., Кадырова Г.Х., Сафаров И.В. Таксономия и некоторые свойства местных микроводорослей // Доклады Академии Наук РУз. - 2013. №5. С. 42-44.
18. Кадырова Г.Х. Таксономия и некоторые свойства местных азотфиксирующих цианобактерий рода Nostoc // Доклады АН РУз. -Ташкент, 2012. -№1. -С.71-75.
19. Кадырова Г.Х., Коробкова Е.С. Идентификация цианобактерий рода Anabaena выделенных из ризосферы хлопчатника // Украинский микробиологический журнал. -Киев, 2013. -Т.75. -№1. -С.27-32.
20. Stanier R.Y., Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Bazire G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales)// Bacterial Rev. -1971. -V.35. -N.2. -P. 171-205.
21. Barra, Lucia, and Silvestro Greco. 'The Potential of Microalgae in Phycoremediation'. Microalgae - Current and Potential Applications, IntechOpen, 12 Dec. 2023. Crossref, doi:10.5772/intechopen.1003212.
22. J.S. Singh, D.P. Singh, S. Dixit Cyanobacteria: an Agent of Heavy Metal removal. Bioremediation of Pollutants IK International Publisher, New Delhi (2011), 223-243.
23. J.S. Choi, Y.H. Park, S. Kim, J. Son, J. Park, Y.E. Choi Strategies to control the growth of cyanobacteria and recovery using adsorption and desorption Bioresour. Technol., 365 (2022), Article 128133, 10.1016/j .biortech.2022.128133
24. Bekhoukh, M. Kiari, I. Moulefera, L. Sabantina, A. Benyoucef New hybrid adsorbents based on polyaniline and polypyrrole with silicon dioxide: synthesis, characterization, kinetics, equilibrium, and thermodynamic studies for the removal of 2, 4-dichlorophenol. Polym. (Basel), 15 (9) (2023), p. 2032. 10.3390/polym15092032
