CC BY
26
Введение
Ранее нами сообщалось о стабилизирующем воздействии природного клиноптиллолита на морфофункциональные параметры гомеостаза в условиях перманентного воздействия фтора [3, 4, 5, 10]. Что же касается сведений о влиянии цеолитовых ионообменников на процессы восстановления после воздействия фтора, то таковые отсутствуют. Вместе с тем имеются определенные предпосылки для применения природных клиноптиллолитов в качестве протектора фтористых интоксикаций. Прежде всего это высокая сорбционная активность клиноптиллолитов по отношению к аммиаку - гипераммониемии способствует подавление фтором глутаминсинтетазы [7]. Кроме того, клиноптиллолита являются активными ионообменниками - поглощают водород, но выделяют кальций [8], стабилизация обмена которых имеет ключевое значение в терапии фтористой интоксикации. Указанные обстоятельства и предопределили выполнение данной экспериментальной работы, целью которой является исследование детоксицирующих свойств природного клиноптиллолита.
Материал и методы
Половозрелых самцов крыс линии Вистар подвергали фтористому воздействию путем содержания в электролизных цехах Красноярского алюминиевого завода. Концентрация фтористого водорода в атмосфере рабочей зоны колебалась в пределах 0,2-0,6 мг/м3, температура воздуха - в пределах 22-24 "С. Смягчение адаптации животных к условиям обитания в цехе осуществлено путем последовательного увеличения времени экспонирования - первую неделю по 2,4, 6 и 12 часов в сутки. Затем в течение 1 месяца по 24'часа ежедневно. Крыс 1-й группы содержали в электролизном цехе на стандартном рационе вивария, крыс 2-й группы, находившихся рядом в цехе, - на рационе с добавлением цеолита. Крыс 3-й и 4-й групп после экспонирования в электролизном цехе вывозили за пределы алюминиевого завода и подвергали реабилитации. Продолжительность реабилитационного периода 1,5 месяца. При этом крыс 3-й группы кормили стандартным рационом, а крысам 4й группы добавляли в корм цеолит. В качестве энтеросорбента использовали цеолитизированный туф Холинского месторождения, который содержал, по данным ЯМР-спектроскопии, не менее 55-60 объемных процентов клиноптиллолита. Цеолит добавляли в корм в виде порошка тониной помола 0,1 мм в дозе 2-3% от влажной массы суточного рациона. Группа «цеолитового» контроля составлена из здоровых крыс, которым вводили в корм сорбент на указанных выше условиях. Крыс контрольной группы содержали на стандартном рационе. Каждая экспериментальная группа состояла из 5-7 животных. По окончанию эксперимента крыс под поверхностным эфирным наркозом декапитировали. Активность метаболитов и количество микроэлементов определяли в сыворотке крови на биохимическом анализаторе Abbott Spectrum EPx (США)1. Гистологические срезы печени и почек окрашивали гематоксилин-эозином, по Ван Гизону и выборочно реактивом Шиффа. Морфологические изменения оценивали методами гистостереометрии [1]. ДНК-синтетическую активность гепатоцитов определяли методом люминесцентной фотометрии на микроскопе ЛЮМАМ-ИЗ с применением фотометрической насадки ФМЭЛ-1 в цитологических отпечатках печени, окрашенных аурамином с учетом объема гепатоцеллюлярных ядер [2, 9]. Количество фтора в бедренных костях крыс определяли методом спектрометрии магнитного резонанса ядер (ЯМР)2 на приборах JMN-4H-100 с приставкой BL-20. Достоверность различий средних значений морфометрических и биохимических показателей оценивали по t-критерию Стьюдента.
Результаты. В печени крыс, содержавшихся в периоде постфтористого восстановления на стандартном рационе, объем гепатоцеллюлярной массы существенно меньше, чем в контроле, и, что более важно, существенно отстает от соответствующего показателя у крыс, подвергнутых непосредственному воздействию фтора. О гепатодеструкции свидетельствует и устойчиво высокая активность АЛТ (таблица 1). Атрофия паренхимы печени сопровождается интенсивным склерозом портальных трактов. Т олщина трабекул и диаметр долек достоверно больше, чем у крыс 1-й группы. На кариограмме регистрируется «выход» тетраплоидных форм гепатоцитов. И хотя эта популяция занимает всего лишь 7-8% (в контроле до 13-15%), тем не менее форма кариограммы приближается к нормальному виду, что свидетельствует о частичной дерепрессии ДНК Количество двуядерных гепатоцитов существенно меньше, чем у крыс 1й группы. Это является следствием усиленного цитокинеза, что в ситуации реабилитации, когда отсутствует прямое токсическое токсическое воздействие, имеет адаптивное значение, так как направлено на восполнение количества одноядерных гепатоцитов - главной структурно-функциональной единицы паренхимы печени. Однако следует учесть, что в уеловиях фтористой интоксикации способность к полиплоидизации гепатоцитов остается, по-видимому, недостаточной и как следствие снижается функциональная мощность этих клеток и возрастает интенсивность деструкции. В результате в просвете синусоидных капилляров накапливается детрит, объем которого значительно больше, чем у крыс 1й группы. Большая часть детрита имеет явно гепатоцеллюлярное происхождение - его довольно крупные частицы, по форме напоминающие коагулированный гепатоцит, свободно залегают в просветах капилляров в местах наибольшей метаболической активности, а именно в срединной и перивенулярной зонах печеночной дольки. Синусоидные капилляры расширены, количество эндотелиальных клеток вдвое меньше, чем у крыс контрольной и 1й групп, а количество макрофагов выше, чем в контроле, но достоверно меньше, чем у крыс в периоде непосредственного контакта с фтором.
Важным обстоятельством является повышенный уровень мочевой кислоты, что достаточно надежно свидетельствует о форсированном процессе биосинтеза пуриновых нуклеотидов и согласуется с цитофлюорометрическими данными о дерепрессии синтеза ДНК.
Во все сроки реабилитации повышена активность ЛДГ и наблюдается гипергликемия (таблица І). Такое соотношение показателей углеводного обмена означает, что катаболизм глюкозы в реабилитационном периоде идет по пути анаэробного распада, а также повышенного синтеза жирных кислот, холестерина и кетоновых тел. В пользу этого свидетельствует высокий уровень холестерина (таблица І).
Концентрация креатинина в плазме крови достоверно выше, чем в контроле. Гиперкреатининемия в любой ситуации свидетельствует о снижении скорости клубочко-вой фильтрации. По данным морфологического исследования почек, во все сроки реабилитационного периода регистрируется увеличение размеров боуменовых капсул на фоне достоверной тенденции к спазму гломерулярных капилляров. Одновременно с этим в почках наблюдается достоверное отставание от нормы показателя относительного объема мальпигиевых телец. Т акое соотношение морфометрических показателей гломерулярного аппарата свидетельствует об уменьшении количества фильтрующих нефронов и стремлении функционирующих гломерул к компенсаторной гипертрофии. В морфологическом отношении в почечных тельцах выявляются патоморфологические изменения в виде неравномерного кровенаполнения гломерулярных капилляров и появления в просвете некоторых из них эритроцитарных аглютинатов, склерозирования интерстиция клубочков и уменьшения количества ШИК-позитивного материала (что свидетельствует об ослаблении синтетической активности или же уменьшении количества мезангиальных клеток), накопления активированных макрофагов и детрита в просвете боуменовых капсул. Указанные морфологические особенности характерны для гиперфильтрационной атрофии. Очевидно, что в условиях постфтористого восстановления процессы гиперфильтрации в функционирующих нефронах, количество которых явно недостаточно, сопровождаются функциональным перенапряжением соответствующих структур, и довольно быстро развивается гломерулосклероз. Показатель фракции проксимальных канальцев в раннем периоде постфтористого восстановления достоверно меньше, чем в норме. Однако обширных некрозов канальцевых нефроцитов не наблюдается. Учитывая эту морфологическую особенность, уменьшение объема проксимальных канальцев мы объясняем их коллапсом. В условиях фтористой интоксикации спадение проксимальных канальцев, возможно, является адаптивной реакцией, так как известно, что фтор подавляет активность канальцевых АТФ-аз [ІІ], вызывая тем самым дефицит энергии. Убыль же количества функционирующих проксимальных канальцев (а в почках это основной потребитель энергии) в ситуации энергетического дефицита явно имеет положительное значение. Объем дистальных канальцев выше, чем в контроле. В основном это произошло за счет резкого расширения их просвета. Показатель удельного объема собирательных трубочек меньше, а их просвет больше, чем в контроле. Патологически расширенные дистальные канальцы и собирательные трубочки деформируют гистологический рисунок почки и придают ему своеобразный криброзный или решетчатый вид (рис. І). Интересно, что этот феномен сохраняется на протяжении всего периода экскреции фтора и в этом смысле он может служить достаточно надежным морфологическим маркером темпа восстановления структуры почек в периоде реабилитации после фтористого воздействия. Как указано выше, некроз нехарактерен для канальцевых нефроцитов, тем не менее нефроциты подвергаются деструкции путем мелкозернистой белковой дистрофии и апоптоза. Mоpфологически апоптоподобно измененные нефроциты имеют характерный вид: ядра клеток уменьшены, мембрана сморщена, хроматин представлен плотным конденсатом, цитоплазма проявляет повышенную оксифильность. В просвете канальцев (преимущественно дистальных отделов нефрона) выявляются в большом количестве апоптоподобные частицы и фагирующие клетки (рис. 2). Однако в перитубулярном интерстиции отсутствует лейкоцитарный инфильтрат, что делает данные изменения в канальцевых нефроцитах достаточно специфичными для апоптоза [І2]. Патологическое содержимое обтурирует просвет значительной части канальцев.
Уровни кальция и магния к концу изученных сроков реабилитации достоверно снижаются (таблица І). Возможно, что это происходит вследствие их повышенной экскреции в виде фтористых и фосфорных солей. На это указывает и тенденция к снижению уровня неорганического фосфата в крови. В условиях повышенной активности щелочной фосфатазы это может быть объяснено повышенным выведением фосфатов с мочой.
У крыс, содержавшихся в периоде постфтористой реабилитации на цеолитовом рационе, активность АЛТ хотя и остается выше, чем в контроле, но достоверно ниже, чем у крыс, содержавшихся на стандартном рационе. По данным морфологического исследования, объем гепатоцеллюлярной фракции остается ниже, чем в контроле, но достоверно больше, чем у крыс предыдущей группы. Портальные тракты обильно инфильтрированы лимфоцитами (у крыс предыдущей группы - преимущественно сегментоядерными лейкоцитами), имеют обычную форму, а их объем восстанавливается до контрольного уровня. На кариограмме четко определяются субпопуляции гепатоцитов с тетра- и октаплоидными наборами ДНК. Толщина печеночных балок в пределах контроля, диаметр дольки достоверно меньше, чем у крыс предыдущей группы. Количество двуядерных гепатоцитов также больше, чем у крыс предыдущей группы и вдвое превышает контроль. Синусоидные капилляры остаются расширенными, а количество
эндотелиальных клеток восстанавливается до контрольного уровня. В просвете капилляров достоверно меньше детрита и больше макрофагов.
У крыс, содержавшихся в реабилитационном периоде на рационе с клиноптиллолитом, количество мочевины в крови достоверно выше, чем у крыс 3-й группы. Необходимо учесть, что под влиянием клиноптиллолита показатель рН крови практически на протяжении всего периода восстановления достоверно выше, чем у крыс предыдущей группы (таблица 1). Алкалоз снижает патогенность мочевины - в условиях избытка гидроксильных групп молекулы мочевины проявляют большую стабильность и соответственно в меньшей мере диссоциируют на аммиак и углекислый газ [6].
Активность ЛДТ, концентрации холестерола и триглецеридов достоверно выше, чем у крыс, содержавшихся в реабилитационном периоде на стандартном рационе (таблица 1). Это свидетельствует об усиливающем эффекте цеолитовой энтеросорбции в отношении процессов, восстанавливающих запас энергии.
По данным морфологического исследования почек, клиноптиллолит сдерживает гипертрофию боуменовых капсул и препятствует спазму гломерулярных капилляров. Показатели удельного объема фракций мальпигиевых телец и проксимальных канальцев также находятся в пределах контроля на всем протяжении периода реабилитации. Указанное соотношение морфометрических показателей с учетом стабилизации концентрации креатинина в плазме крови свидетельствует о восстановлении скорости клубочковой фильтрации. Показатель удельного объема дистальных канальцев сохраняется в пределах контроля, а показатель относительного объема собирательных трубочек хотя и ниже, чем в контроле, но достоверно выше, чем у крыс содержавшихся в периоде реабилитации на обычном рационе.
Цеолит оказывает выраженное модулирующее воздействие на обмен кальция и магния - препятствует гипокальциемии, но с достоверным превышением контрольных значений, способствует росту концентрации магния в плазме крови (таблица 1).
Как свидетельствуют результаты ЯМР-спектрометрии, клиноптиллолит замедляет выход фтора из костей. Следует отметить, что фтор в костях присутствует в форме фторапатита и увеличение концентрации этого минерала неизбежно приводит к уплотнению костной ткани. Морфологически это подтверждается достоверным увеличением толщины костных балок в эпифизах бедренных костей. Что же касается механизма замедленного выхода фтора из костей, то, как мы полагаем, это может быть обусловлено такими факторами, как дефицит водорода, избыток гидроксильных групп, а также гиперкальциемия, индуцированные клиноптиллолитом. Все это способствует «запиранию» фтора в костях и соответственно снижению фторного прессинга на внутренние и в частности выделительные органы. Кроме того, защелачивание плазмы крови, а также повышенная концентрация кальция способствуют связыванию фтора с образованием биологически инертного флюорита, наночастицы которого могут свободно проникать через биологические мембраны и прежде всего через гломерулярный фильтр. Указанные обстоятельства, по нашему мнению, имеют ключевое значение в механизмах протекторного влияния клиноптиллолита.
Выводы
Природный клиноптиллолит, используемый в периоде постфтористой реабилитации, оказывает стабилизирующее воздействие на все виды обмена и способствует ускоренному восстановлению структуры центральных органов гомеостаза. Это позволяет рекомендовать клиноптиллолит как эффективный компонент протектора фтористых интоксикаций.
Таблица1. Биохимические показатели крыс Вистар в реабилитационном периоде после фтористого
воздействия (М ± т)
Показатели Крысы контрольных Крысы в периоде реабилитации
групп 7-е сутки 15-е сутки 30-е сутки
Глюкоза 7,29 ± 0,3 11,4 ±0,5* 11,6 + 0,4* 8,8 ± 0,2 9,4
Ммоль/л 8 3 + 0 41 11,4 ±0,3 10,1 ± 0,4 ± 0,6™
Амилаза 1055,4 ± 29,8 1537,8 + 82,6* 1480,0 ± 75,9* 1528,2 ±71,8*
1182,0 + 36,8 1641,0 ± 88,9 1917,0 + 98,0*" 1363,6 ±24,6
Т риглицериды 1,21 ±0,08 0,56 ± 0,06* 0,55 + 0,5* 0,44 ± 0,04*
Ммоль/л 0,50 + 0,06 0,74 ± 0,07™ 0,74 ± 0,06*" 0,69 ± 0,02-
Холестерол 1,11 ±0,02 1,85 ±0,1* 1,82 + 0,1* 1,87 ± 0,1*
1,17 ±0,02 1,91 ± 0,1™ 1,95 ± 0,1*" 1,98 + 0,1-
ТЛТ 56,6 ± 2,9 63,5 + 5,2* 78,5 ± 6,4* 66,8 + 4,8*
Ммоль/л 61,5 ± 3,2 45,7 ±4,2*** 65,5 + 5,2™ 58,0 ± 5,2-
ЛДГ 459,0 ± 22,1 503,2 ± 25,6* 646,0 ± 33,9* 1531,8 + 66,0" |і
1637,6 ± 33,6 1169,8 ±66,8* 901,0 + 55,2™ 1557,5 + 35,0"
Мочевина 3,18 ±0,07 3,8 ± 0,1 3,7 + 0,1 4.5 ± 0,1*
Ммоль/л 2,81+0,06 6,1 ±0,1"* 5,4 + 0,1™
Креатинин 4,03 + 0,5 70,6 + 3,2" 75,0 ± 3,2" 55,3 ± 2,1 "
Мкм/л 6,41 ± 0,8 53,2 ± 2,1— 59,5 + 2,8*" 22,3 + 1,5-
Мочевая кислота 22,0 + 0,8 36,6 +1,2* 29,5 ± 1,7* 38,7 ± 0,6*
Мкм/л 43,8 +1,8 41,0 ±1,8*" 48,5 ± 1,5 60,2 ± 1,8-
Щелочная фосфатаза 553,6 +18,6 940,2 ± 48,0* 1225,3 ±71,3* 1143,8+10,6'
458,0 +16,8 1279,4 + 66,5*" 1256,2 ± 54,0- 1915,0 ± 30,2-
Магний 0,61 ± 0,05 1,21 ±0,03 1,18 + 0,01 1,34 + 0,06
Ммол/л 0,54 ±0,04 1,84 ±0,06 1,60 ±0,03 1,74 ±0,05-
Кальций 2,58 + 0,03 2,84 + 0,7"* 2,22 ± 0,07 2,18 ± 0,07"
2,69 ± 0,06 2,98 ± 0,07 2,85 ± 0,04 2,75 ± 0,07"*
Кислотность плазмы 7,38 ± 0,4 7,22 ± 0,4* 7,28 + 0,4* 7,31 ±0,4'
7,48 ± 0,4 7,38 ± 0,4™ 7,41 ± 0,4- 7,42 + 0,4~
Концентрация атомов фтора в костях мг F19 в Не определяется 1,7 ± 0,01 0,7 ± 0,01 1,3 + 0,01 2,1 +
1 г кости Не определяется 1,9 ±0,01"* 1,3 ± 0,01- 0,01"* \
Примечания.
1 — здесь и далее в таблице в нижнем ряду приведены значения показателей крыс, содержавшихся на рационе с добавлением клиноптиллолита.
* — достоверно для Р < 0,05 и ** — достоверно для Р <0,01 относительно контроля.
*** — достоверно дляР < 0,05 относительно группы крыс, содержавшихся на стандартном рационе.
Рис. 1. Патологическое расширение собирательных трубочек и заполнение его детритом и ультрафильтратом в почке крысы, подвергнутой воздействию фтора.
Увеличение: об. 10, ок. 12,5. Окраска гематоксилином и эозином.
