CC BY
76
Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского)
федерального университета
137
Влияние трансплантации мононуклеаров пуповинной крови человека на регенерацию почки крысы после унилатеральной обструкции мочеточника
А.В. Табанакова 12, Т.С. Йылмаз 2, И.Ф. Файрушина 12, А.А. Гумерова 1, А.П. Киясов 1
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань
2 Казанский государственный медицинский университет, Казань
Influence of the human umbilical cord blood mononuclear cells transplantation on regeneration of the rat kidney after unilateral ureteral obstruction
A.V. Tabanakova 12, T.S. Yilmaz12, IF. Fairushina 12, A.A. Gumerova 1, A.A. Kiassov1
1 Kazan State Medical University, Kazan
2 Kazan Federal University, Kazan
Клеточная терапия с использованием стволовых клеток может стать эффективным и патогенетически обоснованным методом лечения хронической болезни почек (ХБП) при развитии интерстициального фиброза, который является следствием повреждения канальцевого аппарата почки. Ранее было показано, что трансплантированные стволовые клетки костного мозга участвуют в восстановлении клеток канальцев [1]. В то же время потенциал гемопоэтических стволовых клеток в регенерации канальцевого аппарата почки не изучен. Целью исследования стало изучение участия мононуклеаров пуповинной крови человека в регенерации канальцевого аппарата почки крысы на модели унилатеральной обструкции мочеточника.
18 лабораторным крысам проводили унилатеральную обструкцию мочеточника слева. Экспериментальной группе (n = 9) сразу после операции вводили по 3х106 монону-клеаров пуповинной крови человека в хвостовую вену, контрольной группе (n = 9) — эквивалентный объём 0,9% NaCl. Эксплантацию органов производили через 3, 6, 14 сут. после операции. Парафиновые срезы почки окрашивали иммуногистохимически с антителами к C-kit (маркёру стволовых и прогениторных клеток), ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA) для оценки их пролиферативной активности и а-гладкомышечному актину (a-SMA) для выявления миофибробластов. Сравнительный анализ оперированных почек экспериментальной и контрольной групп крыс показал, что на всех сроках в первой группе количество пролиферирующих клеток в канальцах и интерстиции было выше, чем в почках животных контрольной группы. К 14 сут. значительно возросло количество пролиферирующих клеток в клубочках почек после обструкции в экспериментальной группе. В то же время, на всех исследованных сроках количество a-SMA^-клеток в первой группе было значительно ниже, по сравнению с контрольной. В контралатеральных почках статистически значимых различий в экспрессии PCNA и a-SMA не было выявлено. Экспрессия C-kit в оперированных почках не отличалась от таковой в контралатеральных, а также в почках здоровых животных. Таким образом, введение мононуклеаров пуповинной крови человека при унилатеральной обструкции мочеточника стимулирует пролиферативную активность клеток клубочков, канальцев и интерстиция, уменьшая активацию миофибробластов и риск развития фиброза почки.
Ключевые слова: почка, регенерация, унилатеральная обструкция мочеточника, интерстициальный фиброз, моно-нуклеары пуповинной крови, трансплантация.
Stem cell therapy may provide effective and patogenetically proved treatment of chronic kidney disease caused by interstitial fibrosis after tubule damage. It was reported that transplanted bone marrow stem cells participate in tubule regeneration [1]. At the same time the potential of hematopoietic stem cells in tubule regeneration is not well investigated. The purpose of the study was to evaluate the participation of human cord blood stem cells in rat kidney tubule regeneration after unilateral ureteral obstruction. 18 laboratory rats were subjected to left unilateral ureteral obstruction (UUO). 3x106 of human cord blood mononuclears (n = 9) or equivalent volume of saline (n = 9) were injected into rat's tail vein. Kidney tissue was collected at the end of the 3, 6 or 14 day after operation. Paraffin-embedded slices were stained with mononuclear antibodies against C-kit (stem and progenitor cell marker), proliferating cell nuclear antigen for the cells proliferative capacity evaluation (PCNA) and а-smooth muscle actin (a-SMA) for myofibroblasts detection. Number of proliferating cells in tubuli ad interstitium was considerably larger in the obstructed kidney of the transplantation group, as well as the number of proliferating cells in the glomeruli at 14 day after operation. At the same time number of a-SMA-positive cells in the transplanted group was significantly lower compared with sham-transplanted group. There were no differences in expression of these markers in the contralateral kidneys. UUO had no impact on C-kit expression in kidney tissue. Thus, transplantation of human cord blood mononuclear cells in UUO stimulates proliferative activity of tubular cells and interstitium, reduces myofibroblast activation and risk of kidney fibrosis.
Key words: kidney, regeneration, unilateral ureteral obstruction, interstitial fibrosis, cord blood mononuclear cells, transplantation.
e-mail: [email protected]
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013
138
Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского)
федерального университета
Одной из актуальных проблем современной нефрологии является поиск новых, патогенетически обоснованных и эффективных методов лечения интерстициального фиброза почки, развивающегося вследствие повреждения канальцевого аппарата. Интерстициальный фиброз почек — один из ведущих патогенетических механизмов в развитии хронической болезни почек (ХБП) при таких заболеваниях, как сахарный диабет, подагра, хронический гломе-рулонефрит, рефлюкс-уропатии, врождённая патология мочевыводящих путей. В то же время, исследователями ведётся интенсивное изучение участия стволовых клеток в регенерации органов и тканей и возможности применения этих клеток для патогенетической терапии различных заболеваний [1—4], в том числе заболеваний почек [4, 5]. Одна из основных моделей интерстициального фиброза почек, используемых для изыскания новых методов лечения ХПН — унилатеральная обструкция мочеточника (УОМ). Модель УОМ на крысах легко воспроизводима, развивающиеся при этом в почке морфологические изменения детально изучены морфометрическими и иммуногистохимическими методами, определено количество апоптозных клеток, установлены колебания сухого веса почки в течение 90 сут. от момента обструкции [6, 7]. При унилатеральной обструкции можно наблюдать развитие ХПН поста-дийно в течение первой недели после операции. Большинство современных данных позволяют полагать, что процессы, происходящие в почке крысы после УОМ, идентичны таковым при прогрессировании ХПН у человека [8].
В последнее время, как в эксперименте, так и в клинике, в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) наибольшее значение приобретает пуповинная кровь (ПК) [4, 8]. Это связано как с абсолютной безопасностью забора стволовых клеток и возможностью длительного их хранения [4, 9], так и с рядом качественных свойств самих стволовых клеток. Как известно, ГСК, выделенные из ПК, обладают значительно более высокой пролиферативной и клоногенной активностью [4, 8, 10] и меньшей иммуногенностью по сравнению с клетками, полученными из взрослого организма [4, 9]. В связи с этим целью нашего исследования стало изучение влияния внутривенного введения монону-клеаров пуповинной крови человека на регенерацию почки крысы на модели УОМ.
Материал и методы
Исследование проведено на 18 белых беспородных крысах-самцах весом 180—220 г, находящихся на стандартном рационе вивария и имеющих свободный доступ к воде. Крысам проводили УОМ под эфирным наркозом: после срединной лапаротомии производили перевязку левого мочеточника в его нижней трети шёлковой лигатурой с последующим ушиванием брюшной полости послойно [6—8, 12— 14]. Экспериментальной группе (n = 9) сразу после операции вводили в хвостовую вену по 3х10в моно-нуклеаров, ресуспензированных в 0,2 мл стерильного физиологического раствора, контрольной группе (n = 9) вводили эквивалентный объём 0,9% NaCl. Ксенотрансплантация проведена в связи с невозможностью сбора ПК у крыс.
Выделение мононуклеаров из ПК производили в пробирках объёмом 50 мл. В каждую пробирку нали-
вали по 25 мл фиколла плотностью 1,077 г/мл, на который аккуратно при помощи автоматического дозатора наслаивали равный объём пуповинной крови с антикоагулянтом (соотношение крови и антикоагулянта колебалось в пределах 1:1 —1:3) [4, 8]. Пробирки центрифугировали при 720g 20 мин, получали чёткое разделение крови на 3 фракции: эритроциты, лейкоциты и плазму. Лейкоцитарную фракцию забирали в отдельную пробирку, ресуспендировали раствором Версена в соотношении 1:2 и центрифугивали на 305g 15 мин. Полученный клеточный осадок ре-суспендировали 10 мл раствора Версена и повторно центрифугировали при 305g 15 мин. Таким образом, клеточный осадок был отмыт от фиколла [4, 8].
Через 3, 6, 14 сут. после операции и введения клеток (по 3 крысы на каждый срок) животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом. Выбор экспериментальных сроков обусловлен стадиями патологического процесса в почке после УОМ. На 3 сут. развивается острая стадия почечной недостаточности, через 6 сут. отмечается максимальная пролиферация канальцевого эпителия на модели УОМ, к 14 сут. повышается число a-SMA+-миофибробластов [9]. После выведения животных из эксперимента почки извлекали для морфологического исследования, фиксировали в формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Парафиновые срезы почек крыс окрашивали антителами к C-kit (клон Т595, разведение 1:200, Novocastra, Великобритания;), PCNA (клон PC10, разведение 1:100, DAKO, Дания), a-SMA (клон 1A4, разведение 1:50, DAKO, Дания).
Подсчёт окрашенных клеток проводили «вслепую» три независимых морфолога. Число пролиферирующих РCNA+-клеток подсчитывали в 3 неперекрывающихся полях зрения (увеличение х100) на трёх срезах каждой почки животных экспериментальной и контрольной групп отдельно в клубочках, канальцах, собирательных трубочках, интерстиции. Далее определяли число пролиферирующих клеток на 100 структурных элементов почки. Число a-SMA+-миофибробластов оценивали полуколичественным методом («—» — окрашиваются только клетки стенки сосудов, « + » — окрашиваются 0—25% интерстициальных клеток, «++» — 25—50% клеток, «+ + +» — 50—75% клеток, «+ + + +» — окрашиваются практически все клетки в интерстиции почки).
Результаты
На срезах почек крыс после УОМ морфологически выявлялись признаки, характерные для интерстициального фиброза: дилатация канальцев, атрофия канальцевого эпителия, увеличение содержания в органе интерстициальной ткани, прогрессирующие к поздним экспериментальным срокам, а также атрофия отдельных клубочков (к 14 сут. после УОМ). Сравнительный анализ оперированных почек экспериментальной и контрольной групп крыс показал, что на всех сроках в первой группе количество пролиферирующих клеток в канальцах и интерсти-ции было выше, чем в почках животных контрольной группы (табл., рис. 1А—Д).
К 14 сут. после УОМ значительно повышалось количество пролиферирующих клеток в клубочках почек экспериментальной группы (33,33 и 66,67 клеток на 100 клубочков в оперированной и контралатеральной почке, соответственно). В то же время,
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013
Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского)
федерального университета
139
на всех исследованных сроках количество a-SMA+-клеток в первой группе было значительно ниже по сравнению с контрольной. На раннем сроке (3 сут.) единичные а^МА+-клетки в оперированных почках после введения мононуклеаров ПК выявлялись в сосудах и между канальцами (рис. 2Б), без введения
на том же сроке — в сосудах и между канальцами отмечено до 50—75% позитивных клеток (рис. 2А), на 6 и 14 сут. после УОМ в оперированных почках экспериментальной группы а^МА+-клетки являлись единичными на фоне прогрессирующей дилатации и атрофии канальцев (рис. 2Г, Е).
Среднее число пролиферирующих клеток на 100 структурных элементов почки
Экспериментальные крысы
3 сут. 14 сут.
Контроль Введение ГСК Контроль Введение ГСК
Отделы нефрона Интактные крысы 2 О > о п * У о с Контрлатеральная почка 2 О > о л * У о с Контрлатеральная почка 2 О > о л * У о с Контрлатеральная почка 2 О > о л * У о с Контрлатеральная почка
Клубочки 16,67 0 0 0 0 0 0 33,33* 66,67*
Проксимальные канальцы 4,41 1,12 1,77 16,67* 0,43 4,26 3,1 3,51 3,33
Дистальные канальцы 1,83 0 0,71 9,34* 1,01 18,52 0,5 20,66 3,53*
Собирательные трубочки 2,85 0 2,38* 14,71* 0 33,33 2,12 163,93* 12*
*p<0,05.
Рис. 1. Почка крысы после УОМ, экспрессия PCNA: А - контрольная группа, 3 сут.; Б - 3 сут. после введения мононуклеаров ПК; В, Г - 14 сут. после введения мононуклеаров ПК. Иммуногистохимическая реакция с антителами к PCNA.
Окраска ядер: гематоксилин. Ув.: х100
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013
140
Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского)
федерального университета
Рис. 2. Почка крысы после УОМ, экспрессия a-SMA:
А - контрольная группа, 3 сут.; Б - 3 сут. после введения мононуклеаров ПК; В - контрольная группа, 6 сут.;
Г - 6 сут. после введения мононуклеаров ПК; Д - контрольная группа, 14 сут.; Е - 14 сут. после введения мононуклеаров ПК. Иммуногистохимическая реакция с антителами к a-SMA.
Окраска ядер: гематоксилин. Ув.: А-Г х100; Д, Е х200
В оперированных почках группы крыс, которым введение мононуклеаров ПК не проводилось, количество а^МА+-клеток возрастало на 6 сут. (между канальцами, клубочками и канальцами на «+ + +») и становилось максимальным на 14 сут. после УОМ (между канальцами, клубочками и канальцами на «+ + + +») (рис. 2В, Д). В интактных почках статистически значимых различий в экспрессии PCNA и a-SMA выявлено не было. УОМ не повлияла также на экспрессию C-kit в ткани почки. Таким образом, введение мононуклеаров ПК человека при унилатеральной обструкции мочеточника стимулирует пролифератив-
ную активность клеток клубочков, канальцев и интер-стиция, уменьшая в то же время активность в ткани почки миофибробластов — основного клеточного типа, вырабатывающего макромолекулы соединительной ткани при развитии интерстициального фиброза.
Аналогичные данные по снижению фиброзиро-вания интерстиция почки были получены на модели УОМ, когда экспериментальным животным вводили мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) и эндотелиальные прогениторные клетки из красного костного мозга [1, 13]. Были показаны встраивание и дифференцировка эндотелиальных
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013
Сборник трудов Института Фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского)
федерального университета
141
прогениторов костного мозга мышей в капиллярную сеть почки после их внутривенного введения мышам с УОМ. Клетки встраивались в стенку капилляров и начинали экспрессировать эндотелиальные маркеры (сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), CD31). Уровень фиброза в почке при этом был ниже, чем в контрольной группе [13]. Группой китайских учёных на данной модели было показано встраивание ММСК костного мозга крыс в канальцы коркового вещества почки после внутривенного введения. Клетки были обнаружены по наличию Y-хромосомы. Уровень фиброза в почках крыс после введения ММСК был значительно ниже по сравнению с контрольной группой [1].
На основании результатов проведенного исследования и работ, выполненных другими группами,
ЛИТЕРАТУРА:
1. Liu X., Shen W., Yang Y. et al. Therapeutic implications of mesenchymal stem cells transfected with hepatocyte growth factor transplanted in rat kidney with unilateral ureteral obstruction. J. Pediat. Surg. 2011; 46 (3): 537-45.
2. Almeida-Porada G., Zanjani E.D., Porada C.D. Bone marrow stem cells and liver regeneration. Exp. Hematol. 2010; 38(7); 574-80.
3. Kumar A.H., Caplice N.M. Clinical potential of adult vascular progenitor cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2010; 30(6);
1080-7.
4. Йылмаз Т.С., Мавликеева А.В., Гумерова А.А. и др. Участие мононуклеаров пуповинной крови человека в физиологической регенерации почки крысы. КТТИ 2012; VII(3): 69-71.
5. Zubko R., Frishman W. Stem cell therapy for the kidney? Am. J. Ther. 2009; 16(3): 247-56.
6. Truong L.D., Petrusevska G., Yang G. et al. Cell apoptosis and proliferation in experimental chronic obstructive uropathy. Kidney Int. 1996; 50(1): 200-7.
7. Truong L.D., Gaber L., Eknoyan G. Obstructive Uropathy. Experimental models for renal diseases: pathogenesis and diagnosis. Contrib Nephrol. 2011; 169: 311-26.
можно сделать вывод, что различные прогенитор-ные клетки, и, в том числе, мононуклеары ПК человека, трансплантированные в организм крысы после УОМ, способны индуцировать пролиферацию в повреждённой почке, а также значительно подавляют активность миофибробластов, что препятствует развитию фиброза в почке. Применение данных клеток, таким образом, может быть перспективным для разработки методов клеточной терапии заболеваний, сопровождающихся развитием интерстициального фиброза.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского Фонда Фундаментальных Исследований 12-04-97088-р_поволжье_а.
8. Klahr S., Morrissey J. Obstructive nephropathy and renal fibrosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2002; 283(5): F861-75.
9. Cairo M.S., Wagner J.E. Placental and/or umbilical cord blood: an alternative source of hematopoietic stem cells for transplantation. Blood 1997; 90(12); 4665-78.
10. Navarrete C.V., Gomez J., Borras F.E. Cord blood dendritic cells. In: Broxmeyer Hal E., editor. Cord blood: biology, immunology, banking, and clinical transplantation. Maryland: AABB Press Bethesda; 2004. p. 187-98.
11. Ballen K.K. New trend in umbilical cord blood transplantation. Blood 2005; 105: 3786-92.
12. Bascands J.L., Schanstra J.P. Obstructive nephropathy: insights from genetically engineered animals. Kidney Int. 2005; 68(3): 925-37.
13. Ma Y.Y., Sun D., Li J. et al. Transplantation of endothelial progenitor cells alleviates renal interstitial fibrosis in a mouse model of unilateral ureteral obstruction. Life Sci. 2010; 86(21-22): 798-807.
14. Eddy A.A. Molecular insights into renal interstitial fibrosis. J. Am. Soc. Nephrol. 1996; 7(12): 2495-508.
Поступила 0309.2013
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013
