CC BY
26
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Экспериментальные исследования
© А.В.Смирнов, Г.Т.Иванова, О.Н.Береснева, М.М.Парастаева, В.Г.Сиповский, М.И.Зарайский, И.Ю.Сабурова, Е.Б.Сиповская,
И.Г. Каюков, 2009
УДК 616.61-002.17]-092.4
A.B. Смирнов1,2, Г.Т. Иванова3, О.Н. Береснева1, М.М. Парастаева1,
B.Г. Сиповский1, М.И. Зарайский4, И.Ю. Сабурова4, Е.Б. Сиповская1, И.Г. Каюков1,5
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ИНТЕРСТИЦИАЛЬНОГО ПОЧЕЧНОГО ФИБРОЗА
A.V. Smirnov, G.T. Ivanova, O.N. Beresneva, M.M. Parastaeva, V.G. Sipovskiy, M.I. Zarayskiy, I.J. Saburova, E.B. Sipovskaya, I.G. Kayukov
EXPERIMENTAL MODEL OF INTERSTITIAL RENAL FIBROSIS
1 Научно-исследовательский институт нефрологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова, 2кафедра пропедевтики внутренних болезней Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова, 3лаборатория экспериментальной и клинической кардиологии Института физиологии им. И.П. Павлова РАН, "лаборатория молекулярной диагностики научно-методического центра Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова, 5кафедра нефрологии и диализа Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова, Россия
РЕФЕРАТ
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Оценить последствия односторонней обструкции мочеточника (ООМ) у крыс линии Wistar. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. Односторонняя перевязка мочеточника левой почки выполнена у 6 крыс линии Wistar. Срок наблюдения после ООМ составил 14 сут. У экспериментальных животных измерены масса почек и уровень среднего артериального давления (АД), проведено светооптическое морфологическое исследование и определен уровень экспрессии нуклеарного фактора транскрипции (ЫРкБ) в почечной ткани. РЕЗУЛЬТАТЫ. Не выявлено существенного изменения величины среднего АД у крыс через 2 нед после операции по сравнению с дооперационным уровнем. Масса левой почки возрастала после операции почти в 4,5 раза относительно контрольной правой почки. Относительный уровень экспрессии нуклеарного фактора транскрипции ЫРкВ в опытных левых почках в 1,5 раза превышал таковой в контралатеральных органах. Отмечено истончение коркового и медуллярного слоев, дилатация просвета проксимальных канальцев с уплощением и слущиванием эпителия, дистрофия эпителия проксимальных канальцев, накопление клеток лимфоцитарно-макрофагального ряда с разрастанием нежно-волокнистой соединительной ткани в эктрацеллюлярном матриксе, отек межтубулярной стромы. В клубочках, вовлеченных зонально, определяется расширение мочевого пространства капсулы Боумена, сдавление и частично спадение капиллярных петель. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Полученные данные свидетельствуют о том, что односторонняя перевязка мочеточника у крыс через 14 сут приводит к отчетливым повреждениям почечной ткани, которые в основном локализуются в тубулоинтерстициальном компартменте.
Ключевые слова: почки, односторонняя обструкция мочеточника, тубулоинтерстициальный фиброз. ABSTRACT
THE AIM. Assess the impact of unilateral ureteral obstruction (UUO) in Wistar rats. MATERIAL AND METHODS. Unilateral ureteral ligation left kidney performed in 6 Wistar rats. Time of observation after the UUO was 14 days. Experimental animals to measure the mass of the kidneys and the level of mean arterial pressure (BP), held light microscopic morphological study and determined the level of expression of the nuclear transcription factor (ЫРкВ) in renal tissue. RESULTS. No significant change in the mean arterial pressure in rats 2 weeks after surgery compared with preoperative levels. Mass left kidney increased after the operation almost 4.5 times for the control right kidney. The relative level of expression of the nuclear transcription factor NF^ in experimental left kidney in 1.5 times higher than in the contralateral organs. It is noted thinning of the cortical and medullary layers, dilatation of the lumen of proximal tubules with flattening and desquamation of the epithelium, degeneration of the epithelium of proximal tubules, the accumulation of lymphocytes-macrophages with the growth of connective tissue in extracellular matrix and stromal edema. In glomeruli involved, area-defined expansion of the urinary space of Bowman capsule, compression and partial collaps of the capillary loops. CONCLUSION. These data suggest that the unilateral ureteral ligation in rats after 14 days leads to a distinct damage of kidney tissue, which are mainly localized in the tubulointerstitial compartment. Key words: kidney, unilateral ureteral obstruction, tubulointerstitial fibrosis.
ВВЕДЕНИЕ
Прогрессирование хронической болезни почек до стадии V (терминальная почечная недостаточ-
Каюков И.Г. 197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д.17, СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, Нефрокорпус. Тел.: (812)-3463926; факс: (812)-2349191; E-mail: kaukov@nephrolog.ru
ность - ТПН) тесно ассоциировано с развитием тубулоинтерстициальных повреждений. Воспалительные изменения в тубулоинтерстициальном компартменте, ведущие к формированию фиброза, являются важным фактором неизбежной утраты функции почек у пациентов с самыми разными
заболеваниями этого органа. Поэтому изучение механизмов развития тубулоинтерстициального почечного фиброза и поиск путей замедления его формирования остается весьма актуальной задачей [1, 2]. Многие стороны данной проблемы могут быть изучены только в эксперименте с использованием соответствующих моделей. Для решения данных задач одним из наиболее адекватных подходов считается односторонняя обструкция мочеточника (ООМ) у экспериментальных животных. Данная модель характеризуется тем, что в ней на формирование интерстициального почечного фиброза не оказывают влияние такие провоцирующие факторы, как уремия или артериальная гипертензия. Кроме того, она может служить удобным средством для изучения эффективности различных противофибротических воздействий [1-6]. В данной связи мы предприняли попытку оценить последствия односторонней перевязки мочеточника у крыс линии ^^аг.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Методика выполнения оперативного вмешательства. Для создания модели были использованы самцы крыс 'М81;аг массой тела 230-250 г (питомник «Колтуши» РАН). Под общей анестезией («Рометар», (0,05 мл) в сочетании с «Золетил» (0,3 мл), внутрибрюшинно) выполняли перевязку левого мочеточника. На мочеточник накладывали 2 лигатуры (использовали нерассасывающийся шелк 2/0 «БПкаш»). Участок мочеточника между лигатурами перерезали. Во избежание побочного эффекта на развитие фиброза антибиотик в постоперационный период не применяли. Правую почку (с неповрежденным мочеточником) использовали в качестве контроля.
В ходе эксперимента животных содержали на стандартном лабораторном пищевом рационе и свободном доступе к воде. Срок после ООМ составлял 14 сут.
За 1 сут до проведения операции, а также накануне забоя у ненаркотизированных крыс измеряли среднее системное артериальное давление (АД) манжеточным методом. Во время забоя у крыс регистрировали массу левой и правой почки, производили забор почечной ткани для последующих молекулярно-диагностических и гистологических исследований.
Эксперименты проводили в соответствии с международными стандартами по работе с лабораторными животными.
Гистологические исследования. Для свето-оптической микроскопии кусочки почечной паренхимы из срединной части фиксировали в формали-
не (10%, рН 7,4) в течение 1 сут. Парафиновые срезы 3-5 мкм были депарафинизированы по стандартной методике, окрашены гематоксилином и эозином, реактивом Шиффа (ШИК-реакция), трихромальной окраской и исследованы в светооптическом микроскопе «MICROS 200А» (Австрия).
Исследование экспрессии NFkB. Получение материала и его характеристика. В качестве основного материала для исследования использовали участок почечной ткани крысы. Забор материала производили в стерильных условиях в пластиковые автоклавированные микропробирки «Эп-пендорф», емкостью 1,5 мл с добавлением 0,2 мл 0,1 М раствора EDTA. Далее материал гомогенизировался с помощью одноразовых лезвий до кашицеобразного состояния. Полученный материал
140, 120 100 80604020 0-
Исходно 14 суток Срок наблюдения
Рис.1. Среднее артериальное давление (ось ординат - мм рт. ст.) у крыс Wistar (14 сут после ООМ).
Рис. 2. Изменение массы левой почки крыс через 2 нед после перевязки мочеточника.
rl^.J'* tU
Рис.3. Нормальная гистеоархитектоника с четким делением на корковое, мозговое вещество и чашечно-лоханочную систему. Окраска ПАС-реакция. Ув. х 500.
■ЩШ
Рис. 4. Дилатация просвета проксимальных канальцев с уплощением эпителия канальцев (стрелка). Окраска ПАС-реакция. Ув. х 30.
Рис. 5. В эктрацеллюлярном матриксе наблюдается инфильтрация лейкоцитами (лимфоцы и макрофаги) с разрастанием нежноволокнистой соединительной ткани и отеком межтубулярной стромы (стрелки). Окраска ПАС-реакция. Ув. х 450.
отмывали в ТЕ и PBS буферах и использовали для выделения тотальной РНК.
Выделение тотальной РНК. Тотальная РНК выделялась фенол-хлороформным методом, с помощью набора «Рибо-золь-А» (Амплисенс, Москва), согласно прилагаемой инструкции.
Приготовление кДНК. Приготовление кДНК проводили с помощью реакции обратной транскрипции (набор «Реверта-Л-100», «Амплисенс», Россия) в модификации для рандомизированных олигопраймеров, с использованием обратной транскриптазы M-MLV. Применение данного протокола позволило использовать полученную кДНК как единую мишень для последующих амплифи-каций.
Рис. 6. Расширение мочевого пространства капсулы Боу-мена, сдавление и частичное спадение капиллярных петель клубочков (стрелка). Окраска ПАС-реакция. Ув. х 150.
Проведение реакции амплификации (ЯеаШтеРСЯ-протокол). Реакция амплификации и детекция результатов проводились с использованием прибора ДТ-96 (ДНК-Технология, Москва). Для каждой пробы ставили по две раздельные реакции для гена №кВр65 и гена вАРОП соответственно. Для проведения ПЦР-анализа использовалась реакционная смесь фирмы «Синтол» (Москва) с интеркалирующим красителем БУВЯОКЕЕЫ. Состав реакционной смеси в конечном объеме 25 мкл был следующий: 2,5 мкл 10х реакционного буфера, 2,5 мкл MgCl2 (25 мМ), 2,5 мкл смеси нукле-отидов трифосфатов (2,5 мМ), пара праймеров по 10 пмоль/мкл каждого, 0,2 мкл раствора Taq-поли-меразы 5 Ед/мкл и 4 мкл кДНК. Праймеры были
Зависимость флюоресценции канала FAM от номера цикла
Номер лунки Идентификатор пробирки Ct, FAM Ct, Hex Результат
Н6 WAT NKFB 29,9 - +
Н7 WATGAPDH 28,0 - +
* Ручной (пороговый) метод анализа (B,F) Threshold_FAM = 42,2 Threshold_HEX = 0,0
2 500
2 00
£1 500
500
г—
«(NKFB)
1 \ V- / / 1
Ct (GAPDH)
V \ \
\ \ //
V У
1 6 11 16 21 26 31 36 41 Номер цикла
Рис. 7. Протокол автоматического определения О: на приборе ДТ-96.
1.5
1.45
i 14
>s 8 1-35
I л 0) & 1.3
® ц
h s о 1.25
и л . „
0 X S 1.2
О |1.15
* 1.1
1.05
1 2 1 - контрольный орган; 2 - опытный орган
Рис.8. Относительный уровень экспрессии гена ЫРкВ в почках крыс через 14 дней после ООМ.
синтезированы в НПФ «ЛИТЕХ» (Москва). Последовательности используемых праймеров были следующие:
№кБрб5Р: 5-вТТСАСАОАССТООСАТСС-3; №кБрб5Я: 5-ТвТСАСТАООСОАОТТАТАОС-3; вАРВН-Р: 5-ТООАААТСССАТСАССАТСТ-3; вАРОИ-Я: 5-ОТСТТСТОООТООСАОТОАТ-3. Контроль контаминации реактивов проводился при помощи обязательной постановки отрицательного контроля (Н20 вместо кДНК). Типовая программа амплификации состояла из начальной денатурации - 95°С - 300 с и 35 циклов (95°С - 15 с, 61°С - 40 с). Учет результатов проводился прибором автоматически в режиме «качественный логарифмический обсчет». Вычисление относительного уровня экспрессии гена №кБ проводилось по полуколичественному протоколу методом 2_ААС4 [7].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Проведенное исследование не выявило существенного изменения величины среднего АД у крыс через 2 нед после операции по сравнению с исходным дооперационным уровнем (рис.1).
Масса левой почки возрастала после операции почти в 4,5 раза относительно контрольной правой почки (рис.2).
Контралатеральные почки без обструкции мочеточника имели нормальную гистеоархитектони-ку с четким делением на корковое, мозговое вещество и чашечно-лоханочную систему (рис. 3).
После 2 нед унилатеральной обструкции отмечается истончение коркового слоя и значительное истончение медуллярного слоя. Микроскопически выявляется дилатация просвета проксимальных канальцев с уплощением, а местами и слущивани-ем эпителия в просвет канальцев (рис. 4). В клетках эпителия проксимальных канальцев выявляются признаки дистрофии, очагово, вплоть до некро-биотических изменений. В эктрацеллюлярном матриксе кортикального и медуллярного слоев наблюдается накопление клеток лимфоцитарно-мак-рофагального ряда с разрастанием нежно-волокнистой соединительной ткани, расширением капиллярной сети, отеком межтубулярной стромы (рис. 5) и замещением канальцевых структур. В клубочках, вовлеченных зонально в вышеизложенные изменения, определяется расширение мочевого пространства капсулы Боумена, сдавление и частично спадение капиллярных петель (рис. 6).
Исходными данными для вычисления уровня относительной экспрессии гена NFkBp65 служили расчетные номера циклов амплификации, соответствующие логарифмической фазе накопления ПЦР-продукта в пробах - Ct (threshold cycle - рис. 7).
Далее полученные результаты нормализовались по уровню экспрессии референц-гена GAPDH, а затем подвергались сравнению между опытной и контрольной группами с использованием метода 2-Ада. Результаты сравнения представлены на рис.8. Относительный уровень экспрессии нукле-арного фактора транскрипции №кВ в опытных левых почках в 1,5 раза превышал таковой в кон-тралатеральном органе (см. рис. 8).
ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты нашего исследования, в принципе, согласуются с данными тех авторов, которые занимаются проблемой изучения путей развития ту-булоинтерстициального почечного фиброза на фоне ООМ [1-6]. Существенно, что мы смогли подтвердить нарастание в ткани почки, подвергнутой односторонней перевязке мочеточника, нарастание
активности №кБ - важнейшего модулятора деятельности многих генов, контролирующих экспрессию соответствующих цитокинов, многие из которых обладают профибротическим и провоспали-тельным действием. Изменения, выявленные при патоморфологическом, светооптическом анализе экспериментального материала также в основном соответствуют ранее описанным [4, 8]. Однако в известных работах изменения клубочков либо не описываются, либо указывается отсутствие их повреждений. Наш эксперимент приводил к появлению в гломерулах хотя и умеренных, но довольно заметных патоморфологические изменений. Они могут быть связаны с нарушениями пассажа мочи по канальцам нефрона при обструкции мочеточника и сопровождаются нарушением процесса клубочковой ультрафильтрации. В любом случае экспериментальные исследования по проблеме развития повреждений почечной ткани после ООМ должны быть продолжены.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные данные свидетельствуют о том, что односторонняя перевязка мочеточника у крыс через 14 сут приводит к отчетливым повреждени-
ям почечной ткани, которые в основном локализуются в тубулоинтерстициальном компартменте.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Klahr S, Morrissey J. Obstructive nephropathy and renal fibrosis: The role of bone morphogenic protein-7 and hepatocyte growth factor. Kidney Int Suppl
Am J Physiol Renal Physiol
J Pharmacol Sci
Nephrol Dial Transplant
Kidney Int Kidney Int
Diagn Mol Pathol
J Am Soc Nephrol
Поступила в редакцию 10.11.2009 г. Принята в печать 23.11.2009 г.
