CC BY
24
УДК 616-089.843:591.3:591.88:577.1:591.481.1:616-001-036.17 БАРАНЕНКО Б.О.
ДУ «1нститутнейрох/рургИim. акад. А.П. Ромоданова НАМН Укра1ни», м. Ки/в
ВПЛИВ ТРАНСПЛАНТАЦП ФЕТАЛЬНОТ НЕРВОВОТ ТКАНИНИ НА ДЕГЕНЕРАТИВН ПРОЦЕСИ В ДОФАМНЕРПЧНИХ СИСТЕМАХ ГОЛОВНОГО МОЗКУ ЩУР1В, СПРИЧИНЕН ТЯЖКОЮ ЧЕРЕПНО-МОЗКОВОЮ ТРАВМОЮ
Резюме. Проведено доЫдження вмгсшу дофамту гомованшновог кислоти тарiвня експреси гена Ваху корi лiвоi та правог твкуль, гтоталамуа, гтокамт, стрiатумi та середньому мозку щурiв через 30 дшв тсля експериментальног тяжког черепно-мозковог травми та трансплантаци фетальног нервовог тканини. Встановлено, що тяжка черепно-мозкова травма призводить до зниження вмсту дофамту в стрiатумi, гтоталамуа та корi лiвоi (травмованог) твкул^ а також тдвищення рiвня проапоптичного гена Вах у вах доЫджених структурах головного мозку, що свiдчить про наявтсть деструктивних процеаву мозку тварин у вiддаленому перiодi тсля травми. Трансплантащя фетальног нервовог тканини експеримен-тальним щурам 1з тяжкою черепно-мозковою травмою сприяла нормал1защ до^джуваних показнитв. Ключовг слова: черепно-мозкова травма, трансплантащя, фетальна нервова тканина, дофамiн, апоптоз.
INJ]
М1ЖНАРОДНИЙ НЕВРОПОГ1ЧНИЙ ЖУРНАЛ
INTERNATIONAL NEUROLOGICAL JOURNAL 1
МЕЖДУНАРОДНЫЙ НЕВРОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ /ORIGINAL RESEARCHES/
Вступ
Причиною розвитку рiзноманiтних вщдалених ускладнень тсля черепно-мозково! травми (ЧМТ) се-реднього та тяжкого ступешв тяжкост е тканинний дефь цит, що виникае внаслщок безпосереднього руйнування нервово! тканини в мющ удару, та вторинний тканинний дефщит, який розвиваеться внаслщок порушення мета-болiчних процешв тсля ЧМТ, а саме: змши енергетично-го метаболiзму, iнтенсифiкацiя переокислення лшщв та протеолiзу, що шщшють процеси апоптозу та некрозу [1, 2]. Серед найбтьш чутливих до травмування видтяють дофамшерпчш нейрони головного мозку [3].
У лiтературi наведено даш про рiзний внесок зазна-чених механiзмiв загибелi клiтин тсля травматичного ушкодження мозку [4 — 6]. Вщстрочена загибель нейрошв пiсля ЧМТ бiльш пов'язана з процесами апоптозу нейрошв та тальних клiтин, i саме апоптоз вважаеться визначальним фактором у патофiзiологií травматично! хвороби [7, 8]. Проте бтьшють проведених дослщжень щодо загибелi клггин головного мозку пiсля ЧМТ стосу-ються, як правило, гострого шслятравматичного перiоду, тодi як у вщдалеш термiни цi процеси залишаються менш вивченими.
Ниш продовжуеться пошук молекул, здатних ефективно iнгiбувати каскаднi механiзми загибелi нейрошв та компонент нейроглй. Результата експериментальних дослщжень пщтверджують, що вщновлення функцiй ЦНС тсля ЧМТ вщбуваеться iз залученням особливих компенсаторних ресурав нервово! тканини — нейропластичностi та нейроге-незу [9]. Осыльки саме на запоб1ганш вторинним наслщкам ЧМТ зосереджуе сьогоднi увагу практична медицина, то перспективним пщходом для виршення дано! проблеми е трансплантация фетально! нервово! тканини (ФНТ), адже цей метод вщкривае можливiсть зниження тканинного та клиинного дефiциту, стимуляци нейропластичносп.
Враховуючи важливу роль процесiв апоптозу у пато-генезi черепно-мозково! травми та особливу чутливють до впливу ЧМТ нейронiв дофамiнергiчно! системи мозку
Адреса для листування з автором:
Бараненко Борис Олександрович
04050, Ки!в, вул. Платона Майбороди (Ману!льського), 32 ДУ «1нститут нейроирурги 1м. акад. А.П. Ромоданова НАМН Укра!ни» [email protected]
© Бараненко Б.О., 2013
© «М1жнародний невролопчний журнал», 2013 © Заславський О.Ю., 2013
№ 8(62), 2013
www.mif-ua.com
45
[10,11], ми вважали за доцтьне вивчення р1вня експрес!! проапоптичного гена Bax, а також ум1сту дофам1ну та його основного метабол!ту — гомованшново! кислоти (ГВК) у структурах головного мозку щур1в, яким була нанесена тяжка ЧМТ (тЧМТ), та впливу на ц1 показники трансплан-тац!! фетально! нервово! тканини (тФНТ).
Матер1али i методи досодження
У досл!дженнях використовували самц1в безпородних статевозртих бших щур1в масою 180—220 г, а також ваг!т-них самок i3 18-денними ембр1онами.
Для моделювання тяжко! черепно-мозково! травми застосовували пружинний ударник, модиф1кований для нанесення травм малим лабораторним тваринам [12]. Удар наносили в л1ву т1м'яно-скроневу дшянку. При цьому тварин не ф1ксували.
Для трансплантац!! використовували фетальну нервову тканину сенсомоторно! дтянки кори мозку 18-денних плод!в щур1в. Перед трансплантац!ею видаляли тканин-ний детрит, що утворився у травмован1й дтянц!. У лунку п!сля х!рург!чно! обробки вводили 2 мм3 ембр!онально! нервово! тканини. Трансплантац!ю проводили через 2 години тсля нанесення тЧМТ Для анестез!! застосовували нембутал (4 мг/100 г живо! ваги). Тварин експерименталь-них груп декап1тували через 30 д1б тсля нанесення травми та трансплантат! одночасно з тваринами контрольно! гру-пи. Вилучену п1сля декаттац!! тканину окремих структур головного мозку швидко заморожували у р1дкому азот1.
Визначення вм!сту дофам1ну та ГВК зд!йснювали методом високоефективно! р1динно! хроматограф!! з електрох1м1чним детектуванням [13]. Хроматограф1ю зд1йснювали на м1кроколонковому хроматограф! «Мил-лихром» (Рос!я). 1дентиф!кац!ю п!к!в проводили за часом виходу п!к!в в!дпов!дного стандарту.
Для визначення експресй гена Вах здшснювали екстра-кц1ю РНК фенольним методом за наявност! детергент1в та !нг!б!тор!в нуклеаз [14]; кДНК синтезували з використан-ням 1—2 мкг РНК та 100 нг ол!го(дТ)12-18 в 10 мкл розчину, що м!стив 50 мм Трис-HCl, рН 8,3, 75 мм KCl, 3 мм MgCl2, 50 мм дитютрейтолу, сум!ш! дНТФ (1 ммоль кожного) та 200 од M-Mlv-зворотно! транскриптази (рекомб!нантно!). Для визначення експресй' гена Bax використовували так! праймери: 5'-CACCAGCTCTGAACAGATCATGA -3' та 5'-TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGT-3' [15], продукт ампл!ф!кац!! становив 541 п.н. 35 цикл1в амплiфiкацi! було здйснено при температур! вщпалу 55 °C. В!зуал!зац!я продукт ампл!ф1кац1! проводилася за допомогою електрофорезу в 2% агарозному гел!.
Статистичну обробку даних проводили з використан-ням !-критер!ю Стьюдента.
Результати та ix обговорення
Для в!дпов!д! на питання про стан метабол!зму дофа-м!нерг!чних систем та наявн!сть дегенеративних процес!в у тканин! мозку п!сля тяжко! черепно-мозково! травми та трансплантат! фетально! нервово! тканини ми до-
сл!джували вмiст дофамiну, гомованшново! кислоти, що е продуктом метоксилювання дофамiну, а також рiвень експресй проапоптичного гена Вах в окремих структурах головного мозку щурiв, а саме: у корi лiво! (травмовано!) та право! пiвкуль, гiпоталамусi, гшокамш, стрiатумi та середньому мозку.
Отримат результати вказують на наявнiсгь суттевих дегенеративних процесiв в окремих функцюнальних структурах головного мозку експериментальних тварин у вщдаленому (через 30 д!б) перiодi пiсля травмування. У мющ удару — лiвiй корi через 30 д!б пiсля тЧМТ ушст до-фамiну був на 23 % нижчий за даний показник в штактних тварин, проте ця рiзниця не е статистично значимою; вм!ст гомованiлiново! кислоти у цьому вщщлу мозку знаходився на рiвнi контрольних значень (рис. 1). Щодо експрес!! гена Вах, який е показником активносл апоптотичних проце-с!в, то !! рiвень у тканин! кори травмовано! пiвкулi мозку у 2,3 раза перевищував рiвень контрольних показниюв. У корi право! пiвкулi вмiст дофамiну через 30 д!б пiсля тЧМТ статистично вiрогiдно не вiдрiзнявся в!д умiсту дофамiну у тварин контрольно! групи, тод! як ушст його метаболпу — ГВК у цьому в!ддш мозку травмованих тварин становив лише 62 % в!д контрольних значень, що може розцшювати-ся як компенсаторна реакц!я, спрямована на п!дтримання рiвня нейромедатору за рахунок зменшення швидкостi його розпаду. При цьому рiвень експрес!! проапоптичного гена Вах у корi право! пiвкулi тварин, що пщлягали д!! тЧМТ, значно (в 1,9 раза) перевищував даний показник в штактних тварин, хоча ця рiзниця була дещо менш ви-ражена порiвняно з корою травмовано! твкулг У тварин, яким тсля тЧМТ була iмплантована ФНТ, у тканит кори як лiво!, так i право! пiвкулi головного мозку вщшчаеться уповшнення активностi процесiв апоптозу.
У гшоталамуш щурiв iз ЧМТ через 30 дiб пiсля !! нанесення рiвень дофамiну становив 67 % в!д рiвня контрольних значень. Пропорцшно змiнi вмюту нейромед!а-тора змiнювався i вмют його пох!дно! — ГВК. Iмовiрно, що однiею з причин недостатносл дофамiново! системи в гiпоталамусi при тЧМТ е досить висока штенсивтсть апоптичних процешв у цiй структурi мозку навiть через 30 дiб пiсля '!! нанесення, про що свщчить рiвень експрес!! гена Вах (205 % порiвняно з контрольною групою). Трансплантата фетально! нервово! тканини сприяла шдфимт рiвня дофамшу та ГВК у межах контролю. Рiвень експрес!! гена Вах у гшоталамуш тварин, яким була трансплантована ФНТ, також значно знизився, але все ще перевищував показник контрольно! групи. Враховуючи модулюючий вплив дофамшу на секреторну активтсть гшоталамусу [16], можна зробити висновок, що зниження тсля тЧМТ його вмюту в дан!й структур! мозку е вагомою причиною порушення адекватного реагування функцюнальних систем у вщповщь на зовшшнш вплив. Запобйання таким процесам у цьому вщдш мозку за допомогою тФНТ е перспективним для профтактики розвитку вторинних в!ддалених насл!дк!в ЧМТ, що проявляються у вигляд! ендокринних розлад!в.
180
120
60
%
Дофамш
I
T
I I
T
* i
А
123 123 123 123 123 123 ЛК ПК Гт Гк СМ Стр
180т4
гвк
120
60
X
X
UJ 1 2 3
ЛК
Б
%
2b0-i т
?00
*
150 -
100 X 1
50
(V
1 2 3
В ЛК
л iU i fi iv
ii Iii 11 Ii
Гт Гк
Вах
СМ Стр
I
I
*
I
I
Гт
Гк
СМ Стр
Рисунок 1. Вмст дофамшу (А), гомованЫново! кислоти (ГВК) (Б) та рiвень експресп гена Вах (В) у структурах головного мозку щур1в (ЛК — кора л '1во'1 п1вкул1, ПК — кора правоI п1вкул1, Гт — ппоталамус, Гк — ппокамп, СМ — середшй мозок, Стр — стр'атум) тсля тЧМТ та трансплантацп ФНТ: 1 — контрольн1 тварини, 2 — тварини з тяжкою черепно-мозковою травмою, 3 — тварини з гмплантованою тсля травми фетальною нервовою тканиною; * — Р < 0,05
Одним !з найб!льш поширених ускладнень ЧМТ, особливо серед д!тей, е еп!лепс!я, що може бути пов'язана з в!дносною функцюнальною недостатшстю катехоламшер-пчних нейромед!аторних систем мозку, зокрема дофамшер-пчних. В!доме значення лшб!чно1 системи у формуванш еп!лептиформних сташв тсля черепно-мозково! травми [17]. Тому ми вважали за доц!льне провести дослщження вм!сту дофамшу та гомованшново! кислоти у гшокамш — однш !з важливих структур ще! системи. Зг!дно з наведеними даними, при ЧМТ не спостер1гаеться сгатисгично значимих вiдмiнносгей цих показник!в у групах травмованих та ш-тактних тварин. Р!вень експрес!! проапоптичного гена Вах у гшокамш щур!в, яким була нанесена тЧМТ, перевищував контрольн! значення на 53 %, що е менш вираженими змша-ми пор!вняно з !ншими досл!джуваними структурами мозку, а трансплантац!я ФНТ призводила до його нормал!зацй.
Пiслятравматичнi зм1ни, як свщчать клiнiчнi данi, у ряд! випадк!в можуть провокувати паркшсон!чт явища [18]. Численними дослщженнями доведено, що основне значення в регуляцй рухово! активност! мають дофамшерпчн! системи мозку. Особлива роль в оргашзацй рухово! функцй належить тгрос^атномудофамшерпчному шляхов!. Дегенерац!я цьо-го шляху е основною пстолопчною та бюх!м!чною ознакою парюнсотзму [19, 20]. Зниження дофам!ну в синаптичних зак!нченнях н!гростр!атного шляху мае важливе значення у формуванн рухових розладв. Згщно з отриманими нами даними, тсля тяжко! ЧМТ ум!ст дофамшу та ГВК у статут зазнае суттевих змш Так, р!вень дофамшу через 30 д!б тсля травми знижуеться в 1,6 раза, р!вень ГВК — в 1,3 раза; тФНТ сприяе нормал!зац!! р!вня дофам!ну та ГВК, чого не можна сказати про експресш проапоптичного гена: !! р!вень у стр!атум! травмованих тварин, яким була здшснена трансплантант ФНТ, залишаеться вдвч! вищим за контрольний.
Результати досл!дження вмюту дофамшу, гомовань лшово! кислоти та р!вня експрес!! гена Bax у середньому мозку св!дчать про те, що через 30 д!б тсля травмування суттевих змш у склад! як цих нейромед!атор!в, так ! проапоптичного гена не спостерйаеться, а тФНТ призводить до незначного п!двищення вмюту дофамшу та ГВК.
Таким чином, отримаш дан! свщчать про високу актив-шсть процеав апоптозу у бтьшосп досл!джених структур головного мозку та порушення нейромед!аторного за-безпечення !х функцюнування (особливо стр!атума та г!поталамуса) у в!ддаленому пюлятравматичному перюд!. Введення фетально! нервово! тканини сприяе гальмуванню процешв апоптозу та в!дновленню вм!сту дофамшу в р!зних функцюнальних структурах.
Висновки
1. Тяжка ЧМТ призводить до зниження вмюту дофамшу у функцюнальних структурах головного мозку щур!в через 30 д!б тсля '!! нанесення, а саме: в стр!атуш, гшоталамуш та кор! л!во! (травмовано!) твкул! (в 1,6; 1,5 та 1,3 раза в!дпов!дно).
2. Р!вень експрес!! проапоптичного гена Вах у головному мозку щур!в через 30 д!б тсля тЧМТ перевищуе контрольн! значення у бтьшосп дослщжених структур головного мозку: у л!в!й (травмован!й) кор!, стр!атум! та гшоталамуш — б!льше н!ж на 200 %, у гшокамш та правш кор! твкуль мозку — на 153 та 190 % вщповщно.
3. Трансплантата алогенно! фетально! нервово! ткани-ни сприе п!дтримц! вм!сту дофам!ну у травмован!й п!вкул!, ппоталамуш та стр!атум! в межах, близьких до контрольних, та зниженню (але не повнш нормалгзацй) р!вня експрес!! гена Вах у бтьшосп дослщжених структур головного мозку щур!в.
Список л1тератури
1. Inci S. Time-level relationship for lipid peroxidation and the protective effect ofalpha-tocopherol in experimental mild and severe brain injury / S. Inci, O.E. Ozcan // Neurosurgery. — 1998. — Vol. 43, № 2. — P. 330-335.
2. Sustained sensory/motor and cognitive deficits with neuronal apoptosis following controlled cortical impact brain injury in the
№ 8(62), 2013
www.mif-ua.com
47
mouse / G.B. Fox, L. Fan, R.A. Levasseur, A.I. Faden // J. Neu-rotrauma. — 1998. — Vol. 15, № 8. — P. 599-614.
3. The impact-acceleration model of head injury: injury severity predicts motor ancognitiveperformance after trauma/A. Beaumont,
A. Marmarou, A.Czigner[et al.] //Neurol. Res. — 1999. — Vol. 21, № 8. — P. 742-754.
4. Апоптоз клтин мозку rn^ypie рiзного вку при черепно-мозковш mpaeMi i геннiй терапИ / С.А. Михальський, Т.Ю. Квтницька-Рижова, В.В. Быошицький, С.П. Малише-ва // Пробл. старения и долголетия. — 2011. — Т. 20, № 4. — С. 371-380.
5. Трофимов А.О. Апоптоз нейронов при черепно-мозговой травме / А.О. Трофимов, Л.Я. Кравец // Современные технологии в медицине. — 2010. — № 3. — С. 92-97.
6. Raghupathi R. Cell death mechanisms following traumatic brain injury / R. Raghupathi // Brain Pathol. — 2004. — Vol. 14, № 2. — P. 215-222.
7. Effect of post-traumatic mild hypothermia on hippocampalcell death after traumatic brain injury in rats/F. Jia, Q. Mao, Y.M. Liang, J.Y. Jiang//J. Neurotrauma. — 2009. — № 26. — P. 243-252.
8. Clinical trials in head injury / R.K. Narayan, M.E. Michel,
B. Ansell [et al.]//J. Neurotrauma. — 2002. — № 19. — P. 503-557.
9. Шевага В.Н. Ранние и отдаленные последствия черепно-мозговой травмы: медико-социальные аспекты и возможности нейропротекции/В.Н. Шевага//Здоров'я Украти. — 2009. — № 5. — С. 45.
10. Kobori N. Enhanced catecholamine synthesis in the prefrontal cortex after traumatic brain injury: implications for prefrontal dysfunction /N. Kobori, G.L. Clifton, P.K. Dash// J. Neurotrauma. — 2006. — Vol. 23, № 7. — P. 1094-1102.
11. Impaired dopaminergic neurotransmission in patients with traumatic brain injury: a SPECT study using 123I-beta-CIT and 123I-IBZM /E. Donnemiller, C. Brenneis, J. Wissel[et al.]//Eur. J. Nucl. Med. — 2000. — Vol. 27, № 9. — P. 1410-1414.
Бараненко Б.А.
ГУ «Институт нейрохирургии им. акал. А.П. Ромоданова НАМН Украины», г. Киев
ВЛИЯНИЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ФЕТАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ ТКАНИ НА ДЕГЕНЕРАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ В ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС, ВЫЗВАННЫЕ ТЯЖЕЛОЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМОЙ Резюме. Исследованы содержание дофамина, гомованили-новой кислоты и уровень экспрессии гена Вах в коре левого и правого полушарий, гипоталамусе, гиппокампе, стриатуме и среднем мозге крыс через 30 дней после экспериментальной тяжелой черепно-мозговой травмы и трансплантации фетальной нервной ткани. Установлено, что тяжелая черепно-мозговая травма приводит к снижению содержания дофамина в стриатуме, гипоталамусе и коре левого (травмированного) полушария, а также повышению уровня проапоптического гена Вах во всех исследованных структурах головного мозга, что указывает на наличие деструктивных процессов в мозге животных в отдаленный период после травмы. Трансплантация фетальной нервной ткани экспериментальным крысам с тяжелой черепно-мозговой травмой способствовала нормализации исследованных показателей.
Ключевые слова: черепно-мозговая травма, трансплантация, фетальная нервная ткань, дофамин, апоптоз.
12. Гельфанд В.Б. Закрытая черепно-мозговая травма / В.Б. Гельфанд, М.Д. Маламуд, В.Г. Истратов. — Кишинев: Штиинца, 1986. — 278 с.
13. Бонецкий А.А. Определение катехоламинов плазмы крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на микроколоночном хроматографе «Миллихром»/ А.А. Бонецкий, В.И Федоров //Лаб. дело. — 1989. — № 4. — С. 21-25.
14. Клеменс М. Выделение эукариотической матричной РНК (мРНК) / М. Клеменс // Транскрипция и трансляция. Методы: пер. с англ. [редкол.: Б. Хеймс, С. Хиггинс]. — М.: Мир, 1987. — C. 254-275.
15. Diminished penile expression of vascular endothelial growth factor and its receptors at the insulin-resistant stage of a type II diabetic rat model: a possible cause for erectile dysfunction in diabetes / Jesmin S., Sakuma I., Salahldin A. [etal.]// J. of Mol. Endocrinology. — 2003. — № 31. — P. 401-418.
16. Митюшов М.И. Регуляция нейрогормональных функций гипоталамуса: Актуальные вопросы современной эндокринологии / М.И. Митюшов, А.А. Филаретов. — М.: Наука, 1981. — С. 82-94.
17. Отелин В.А. Функциональная морфология медиаторных систем головного мозга / Отелин В.А. // Журн. невр. и психиатр. — 1998. — № 1. — С. 54-58.
18. Patt S. Neuropathologicalsequelae oftraumatic injury in the brain. An overview/S. Patt, N. Brodhun//Exp. Toxicol. Pathol. — 1999. — Vol. 51, № 2. — P. 119-123.
19. McKeran R.O. The biochemistry of diseases of the central nervous system / R.O. McKeran // Biochemical aspects of human disease [Ed. R.S. Elkells, A.S. Tavil]. — London — Edinburg: Oxford, 1983. — P. 435-480.
20. De Long M.R. Primate models of movement disorders of basal ganglia origin/M.R. De Long// Trends Neurosci. — 1990. — Vol. 13, № 7. — P. 281-285.
Отримано 21.10.13 D
Baranenko B.O.
State Institution «Institute of Neurosurgery named after acad. A.P. Romodanov of National Academy of Medical Sciences of Ukraine», Kyiv, Ukraine
INFLUENCE OF FETAL TISSUES TRANSPLANTATION ON DEGENERATIVE PROCESSES IN DOPAMINERGIC SYSTEMS OF RAT BRAIN CAUSED BY SEVERE TRAUMATIC BRAIN INJURY
Summary. The authors investigated dopamine and homovanillic acid contents and level of Bax gene expression in the left and right hemisphere cortexes, hypothalamus, hippocampus, striatum and midbrain of rats in 30 days after an experimental severe traumatic brain injury and fetal nervous tissue transplantation. It is found that severe traumatic brain injury leads to the decline ofdopamine content in the striatum, hypothalamus and left (damaged) hemisphere cortex, as well as to the increase of proapoptotic Bax gene expression level in all investigated brain structures, that testifies to destructive processes in the brain of animals in a remote period after the injury. Fetal nervous tissue transplantation to experimental rats with severe traumatic brain injury provided the normalizations of investigated indexes.
Key words: traumatic brain injury, fetal nervous tissue, transplantation, dopamine, apoptosis.
