CC BY
35
УДК 616.1/.9-055.5/7-092]-085:616-092:591.481.1:616-001-092.9.259 Бшошицький В.В.
Лшувальний вплив 1зоформи s3 аполшопротешу Е на патоф1з1олог1чн1 мехашзми вторинного ураження головного мозку при експериментальнш черепно-мозковш травм1
1нститут нейрохiрургii ím. акад. А.П. Ромоданова НАМН Укра!ни, вщдшення нейротравми, м. Ки!в
Мета. Вивчити терапевтичш можливосл застосування 1зоформи еЗ аполiпопроте'iну Е, синтез яко'i в нервовш тканинi индукований методом генно! терапп, при експериментальнiй черепно-мозковiй травмi (ЧМТ) i на пiдставi аналiзу даних лiтератури пояснити можливi мехашзми його лшувально! дп.
Методи. Структурш та функцiональнi змiни оцiнювали у дорослих щурiв-самцiв лшп Вiстар на 10-ту добу пiсля тяжко! дифузно! ЧМТ, вщтворено! на моделi «ударного прискорення» падаючим вантажем. Шсля ЧМТ комплекс катюнних лiпосом ДОТАП i 25 мкг плазмщного вектора pCMV-APOE3 вводили в шлуночок мозку за допомогою осмотичних помп ALZET. Оцшювали СА1 поля гiпокампа за допомогою свилово! та електронно! мшроскопп, морфометрп, iммуноцитохiмiчного i конфокально-мiкроскопiчного дослiдження з використанням селективних маркерiв нейронiв (NeuN) i астроцитiв (GFAP). Функцiональний результат травми оцшювали в тест «вщкрите поле».
Результати. За даними експериментального дослщження, лiпосомальна трансфекцiя геном апоЕЗ надае позитивний лiкувальний ефект на структуру i ультраструктуру гшокампа, зменшуе загибель нейронiв, ступiнь дифузного ушкодження аксонiв, глiоз i мiкроглiальну реакцш, а також сприяе регресу посттравматичного стресу i тривожносп.
Висновок. За даними лггератури, можливими мехашзмами лшувально! дН АпоЕЗ е вплив аполшопротешу Е на нормалiзацiю лiпiдного компонента нервових клiтин, роль аполшопротешу Е в регуляцп дальних реакцiй i запально! вiдповiдi ЦНС на травму, антиоксидантш ефекти аполшопротешу Е, участь аполшопротешу Е в регуляцп процеыв смертi клiтин, вплив аполшопротешу Е на експресш шших генiв i регуляцiя геномно! вщповвд клiтин ЦНС на травму.
Ключов1 слова: черепно-мозкова травма, генна тератя, аполтопротегн Е, Í30ifiopMa е3, мехатзм лшувальног дп.
Вступ. Черепно-мозкова травма (ЧМТ) е основною причиною смерт та iнвалiдизацi! потерпших молодого вшу як у розвинутих кра!нах, так i в тих, що розвиваються [1]. За даними сучасних ешдемюлопч-них дослщжень, щороку в свт ЧМТ виникае майже у10 млн. потерпших [2]. Летальшсть за тяжких форм ЧМТ становить 35-40% [1], ознаки стшких насшдгав черепно-мозкового ушкодження, включаючи невро-логiчнi, когштивш, психiчнi та психiатричнi розлади, тшьки в США виявляють майже у 2% населення [3].
Наведена статистика шдкреслюе нагальну потребу у застосуванш ефективних методiв лiкування, яю могли би суттево знизити летальшсть та зменшити вираженiсть наслiдкiв травми у потерпших. Незва-жаючи на досягнення фундаментальних i клШчних дослщжень, а також успiхи в розвитку штенсивно! терапп в останнi роки, доводиться констатувати вщ-сутнiсть специфiчно! фармакотерапп ЧМТ, яка вщ-повщала б таким вимогам. Виправити ситуацш може розумiння клiтинних та молекулярних механiзмiв, що е шдГрунтям патофiзiологiчних процесiв, якi вщбува-ються шсля ЧМТ, i розробка лiкувальних засобiв з вiдповiдними мiшенями терапевтичного впливу [1].
Мета роботи: вивчити терапевтичш можливосл iзоформи еЗ аполшопротешу Е (АпоЕ — бiлок; апоЕ — ген), синтез яко! у нервовш тканиш iндукований методом генно! терапп, при експериментальнiй ЧМТ i на пiдставi даних лiтератури пояснити можливi механiзми !! лiкувально! дi!.
Матер1али i методи дослщження. Дослiдження проведено на дорослих (6-8 мф щурах-самцях лiнi! Wistar, масою тiла — 350-400 г, розведення вiварiю 1нституту нейрохiрургi!, якi розподiленi на 4 групи.
- Контроль — група штактних тварин (5 ЩУPiв).
- Пл — в лiвий бiчний шлуночок мозку тваринам встановлювали канюлю, яку з'еднували з встанов-леним шд шкiру спини резервуаром (осмотичною помпою), що забезпечував шфузш протягом 25 год, з швидюстю 1 мкг/год, для внутршньошлуночково! iнфузi! катюнних лшосом з плазмiдним вектором, який шс ген апоЕЗ (5 щурiв).
- ЧМТ — група тварин з експериментальною ЧМТ (5 щурiв).
- ЧМТ+Пл — тваринам завдавали експеримен-тально! ЧМТ (у такий самий споыб, як i в груш ЧМТ) i протягом кшькох хвилин встановлювали канюлю (як i в груш Пл) (6 тварин).
Тяжко! ЧМТ завдавали щурам шляхом вшьного падшня вантажу вагою 450 г з висоти 1,5 м. Моде-лювання експериментально! ЧМТ i вы подальшi хiрургiчнi манiпуляцi!, пов'язаш з встановленням канюлi та введенням вщповщних розчинiв, викону-вали шд загальним наркозом, який забезпечували внутршньом'язовою iн'екцiею розчину кетамiну в дозi 0,7 мг/кг. Як лiкувальний препарат дослщжували комплекс катiонних лiпосом DOTAP Methosulfate (ви-робництво Sigma, США) i 25 мкг плазмщного вектора pCMV- SPORT6 (виробництво Invitrogen, США), що мiстив ген апоЕЗ людини, шд контролем цитомега-ловiрусного промотору.
Проводили морфолопчне дослiдження (свгглооп-тичне, електронно-мшроскошчне, iмуногiстохiмiчне з конфокальною мшроскошею, морфометричне), вивчали розлади дослiдницько! поведшки та емоцш-ного стану тварин. Для порiвняльного гiстологiчного
© Бшошицький В.В.
дослщження 3MÍH структури мозку у тварин рiзних груп rn^pÍB умертвляли через 10 дiб шсля травми шляхом внутршньоочеревинно! ш'екцп летально! дози лопентал-натрш (200 мг/кг). Мозок обережно вилучали з порожнини черепа, макроскошчно оць нювали стан м'яких оболонок, рельеф, наявшсть крововиливiв, локалiзацiю видимих вогнищ забою. Мозок фшсували у 4% розчинi параформальдегiду. З фшсованого мозку вирiзали фронтальнi блоки, яю обробляли за стандартною методикою. З одержаних блокiв виготовляли серiйнi зрiзи товщиною 5-7 мкм, якi фарбували гематоксилшом i еозином, тiонiном за Шслем. 1ншу частину серiйних зрiзiв викорис-товували для iмуногiстохiмiчного дослщження. Для ультраструктурного дослiдження ультратонкi зрiзи товщиною 60-70 нм контрастували 2% розчином урашлацетату й свинцю цитрату, дослщжували з використанням електронного мшроскопа ПЕМ-125К («Selmi», Укра!на) за прискорювально! напруги 60 кВ. Iмуногiстохiмiчне дослщження включало виявлення нейронiв за маркером NeuN (зелена флуоресценцiя), астроцитiв — за маркером GFAP (червона флуорес-ценщя). Пiсля цього зрiзи дослщжували у конфокальному мiкроскопi FV1000-BX61WI (Olympus, Japan). Морфометричне дослiдження передбачало визначення лшшно! щiльностi (ЛЩ) нейрошв, глiоцитiв — сумарно астроцитiв i ол^одендроцилв та мiкроглiоцитiв зони СА1 гшокампа, тобто, кiлькостi клiтин на одиницю його довжини (1 мм).
Дослiдницьку поведiнку та емоцшний стан щурiв дослiджували на 7-му добу шсля травми (операцп), у контрольних тварин — у тесл «вщкрите поле». Екс-периментальна установка являла квадратну камеру розмiрами 90x90 см з пластмасовими чорними слн-ками заввишки 49 см, освилену единим iнтенсивним джерелом свiтла (електричною лампою). Пластикову пiдлогу апарата розкреслено на 36 однакових квад-ралв розмiрами 15x15 см. Квадрати видшяли як пери-ферiйнi, прилеглi до стшок камери (20), та центральш (16). У квадратах у шаховому порядку просвердлеш 16 отворiв дiаметром 1 см, що iмiтували шрки. Тва-рину вмiщували в кут установки i спостермли за li поведiнкою протягом 5 хв. Дослiдницьку поведiнку оцiнювали, пiдраховуючи кiлькiсть квадраив, якi тварина перетинала всiма чотирма лапками протягом перюду спостереження (дослщжували загальну юль-кiсть, а також юльюсть периферiйних i центральних квадралв окремо), кiлькiсть вертикальних стiйок i заглядань у шрки. Для додатково! оцшки емоцiйного стану тварин оцшювали кiлькiсть епiзодiв грумiнгу (активно! поведшки тварин, спрямовано! на очищення поверхш тiла, тобто вмивання, вилизування шерсл) i кiлькiсть епiзодiв дефекацi! (фекальних болюыв) впродовж 5 хв.
Статистична обробка даних проведена з вико-ристанням непараметричного методу оцшки Ман-на-У!тнi.
Результати та ix обговорення. Через 10 дiб шсля ЧМТ вщзначене порушення цитоархггектошки гiпокампа. За даними морфометричного аналiзу ЛЩ нейронiв щурiв зменшилася в 1,4 разу. На цьому фош виявлеш змiни якiсного складу !х популяцi! — збiльшення кiлькостi гшерхромних деструктивних форм (з 7,8 до 55,4%) та зменшення незмiнених форм (з 89,2 до 55,4%). ЛЩ макроглюцилв збшьшилась на
41%, мшроглюцилв — у 4,5 разу. Виявлеш значш деструктивно-дистрофiчнi змiни в ycix клiтинних еле-ментах rinoKaMna: набряк перикапшярних структур, пошкодження аксошв i мieлiну (аж до його дезагре-гацп, порушення ламелярно! структури, формування здутлв i випинань), порушення синаптичного апарату, а також дистрoфiчнi змши у виглядi значного накопи-чення лшофусцину й залишкових тiлець у нейронах i глioцитaх. Пiд впливом генно! терaпi! вiдзнaчене зменшення вираженосл деструктивнo-дистрoфiчних змiн, зумовлених ЧМТ. ЛЩ нейрошв зменшувалась значно менше (на 24%), покращувався якiсний склад популяцп (43,8% незмiнених i 53,7% — гшерхромних нейрошв). ЛЩ макроглюцилв збшьшувалась на 23%, мiкрoглioцитiв — у 3,7 разу. Структура аксошв i мieлi-нових оболонок значною мiрoю нoрмaлiзувaлaсь, змен-шилась кiлькiсть лшофусцину й залишкових тшець у нейронах i перикaпiлярних нiжкaх aстрoцитiв.
Характерним проявом ураження гшокампа за тяжко! дифузно! ЧМТ в експеримент e aктивiзaцiя нейрoн-глiaльних вiднoсин. За даними iмунoцитoхiмiч-ного кoнфoкaльнo-мiкрoскoпiчнoгo дoслiдження виявлено гшертрофш тiл aстрoцитiв, збiльшення !х об'ему, кiлькoстi вiдрoсткiв aстрoцитiв та !х рoзмiрiв, посилення розгалуження вщростюв, змiни характеру розгалуження вiдрoсткiв астроциив з зiрчaстoгo на кущастий. При цьому тша aстрoцитiв наближалися до шару нейрошв, збшьшувалася площа контакту нейрошв та астроциив, вщростки астроцилв рясно проникали мiж нейронами шрамщного шару. Лшосо-мальна трaнсфекцiя клггин головного мозку плазмщ-ним вектором, що несе ген iзoфoрми е3 апоЕ людини, позитивно впливала на структуру й ультраструктуру гiпoкaмпa, у тому чи^ зменшуючи кiлькiсть астро-цилв у його рaдiaльнoму шaрi та нoрмaлiзуючи !х структуру (форма розгалуження вщростюв у групi ЧМТ+Пл переважно зiрчaстa, як у кoнтрoлi).
Результати дослщження дoслiдницькo! поведш-ки та емоцшного стану свiдчили, що щури групи Контроль впродовж 5 хв вщвщували у середньому (65,4±7,33) квадрати «вщкритого поля». У тварин групи ЧМТ травма спричиняла значне пригшчення спонтанно! дослщницько! пoведiнки у пoрiвняннi з такою в груш Контролю на 7-му добу шсля ЧМТ. Юльюсть квадраив «вщкритого поля», вщвщаних травмова-ними тваринами протягом 5 хв, становила 22,4±6,07, що складало 34,3% вщ показника в штактних тварин (Р=0,009). Зниження спонтанно! дослщницько! ак-тивнoстi супроводжувалось появою «фризингово!» пoведiнки (freezing — замерзання), коли тварина «за-вмирае» на м^щ, чaстiше в кутку «вщкритого поля» й припиняе дoслiджувaти навколишне середовище. Вважають, що така поведшка вiдoбрaжae шдвище-ний рiвень стресу й тривожносл та не зумовлена недостатшстю сенсорно! або рухово! сфери. Пoдiбних завмирань ми не спостертали у контрольних тварин, якi продовжували безперервно дослщжувати нову обстановку.
Проведення травмованим тваринам генно! те-рaпi!, спрямовано! на шдукцш синтезу в нервовш ткaнинi iзoфoрми е3 АпоЕ (група ЧМТ+Пл), сприяло вщновленню спонтанно! дослщницько! пoведiнки, що вiдoбрaжaлo зниження в них рiвня стресу й тривожносл. Юльюсть вщвщаних квaдрaтiв «вщкритого поля» на 7-му добу шсля травми становила 49,5±6,47,
що, на вщмшу вщ групи ЧМТ, складало 75,7% вщ по-казника у контрольних тварин. I хоча цей показник не сягав норми, тобто, значень у груш Контроль (Р=0,011), вш достовiрно перевищував такий у групi ЧМТ (Р=0,006).
Подальша оцiнка впливу лшосомально! транс-фекцп тканини головного мозку плазмщним вектором з геном апоЕЗ на виражешсть стресу й тривожностi у щурiв з ЧМТ стосувалась оцшки !х звикання до ново! обстановки, що характеризувалося актившшим дослiдженням центрально! частини «вщкритого поля». За нашими даними, перебування в перифершних квадратах «вщкритого поля» вiдповiдало закономiр-ностям, характерним для загально! кiлькостi вщвща-них квадратiв. Так, середня юльюсть периферiйних квадратiв, вiдвiданих щурами групи ЧМТ на 7-му добу шсля травми, становила 21,0±6,28, що складало 35,2% вщ показника в груш Контроль (59,6±7,09) (Р=0,009). Проведене тваринам групи ЧМТ+Пл лшування спри-яло збшьшенню кiлькостi вiдвiданих периферiйних квадрапв на 7-му добу пiсля травми до 46,8±7,19 (79,3% вiд показника в штактних тварин), хоча й без достовiрно1 нормалiзацi! (Р=0,018 при порiвняннi з групою Контроль), проте, з достовiрним перевищен-ням показника у порiвняннi з таким у тварин групи ЧМТ (Р=0,006).
Дещо iнший тренд вщзначений щодо вiдвiдання тваринами центральних квадралв «вiдкритого поля». У порiвняннi з групою Контроль (число вщвщань центральних квадратiв 5,8±2,95), травма спричинила такий рiвень стресу й тривожносл, що на 7-му добу спостертали вiдсутнiсть звикання до нового середо-вища — (1,8±0,84) вiдвiдування (Р=0,016). У той же час, проведення генно! терапi! з використанням гену апоЕЗ сприяло збiльшенню кiлькостi вщвщаних центральних квадратiв до 4,33±1,21, що не вiдрiзнялось вiд показника в штактних тварин (Р=0,411) i достовiрно перевищувало данi в груш ЧМТ (Р=0,011).
Пiд час вивчення шших аспектiв дослiдницько! поведiнки щурiв, зокрема, вертикально! активностi, встановлено, що юльюсть вертикальних стшок в груш ЧМТ на 7-му добу шсля травми становила 7,6±2,88, у Контролi — 19,6±2,79 (Р=0,009). Проведене лшування тварин групи ЧМТ+Пл сприяло вщновленню вертикально! активностi — (15,3±3,88) стiйки (рiзниця з показником у груш Контролю недостовiрна, Р=0,10) з достовiрною вiдмiннiстю вiд показника в груш ЧМТ (Р=0,014).
Подiбнi змiни виявлеш й щодо показника «за-глядання в шрки». Порiвняно з Контролем (5,2±2,77 епiзоди протягом 5 хв) цей патерн дослщницько! поведiнки достовiрно гальмувався на 7-му добу шсля ЧМТ (0,6±0,55 епiзоди, Р=0,009). Лiпосомальна трансфекцiя тканини головного мозку щурiв з ЧМТ плазмiдним вектором, що несе ген апоЕЗ, сприяла вiдновленню цього показника в груш ЧМТ+Пл (3,2±1,17 епiзодiв заглядання в шрки; рiзниця з показником в груш Контролю недостовiрна, Р=0,235) з достовiрною вiдмiннiстю вiд результатiв у груш ЧМТ (Р=0,006).
У дослщженш не виявлений вплив як ЧМТ, так i проведеного нами лшування, на такi показники емоцiйного стану тварини, як «грумшг» i юльюсть фекальних болюив.
Таким чином, генна терашя, спрямована на шдук-цш синтезу iзоформи е3 АпоЕ головному мозку щурiв
при експериментальнiй ЧМТ, справляе позитивний вплив на структуру й ультраструктуру гшокампа, зменшуе загибель нейрошв, ступiнь дифузного уш-кодження аксональшв, глiоз та мiкроглiальну реакцш, а також сприяе регресу посттравматичного функцю-нального дефiциту.
Незважаючи на те, що вплив АпоЕ на переб^ рiзних захворювань ЦНС, у тому чи^ ЧМТ, вiдомий досить давно, автори оглядiв лiтератури i експеримен-тальних робiт, опублiкованих у 2007-2011 рр., наголо-шують, що точш механiзми, за допомогою яких АпоЕ впливае на обмеження структурних проявiв i функ-цiональних наслщюв ЧМТ та iнших нейродегенера-тивних захворювань, сьогодш недостатньо дослiдженi [4-8]. Найбшьш доведеним поясненням ефектiв АпоЕ можуть бути вплив на нейрогенез, запальну вщповщь, процесинг амшо!ду-Р i метаболiзм нейронiв [4].
Роль АпоЕ в нормалiзацi! балансу лiпiдiв у нервовш тканинi доведена в оглядi лiтератури Р^. Hauser та спiвавторiв [5]. Автори вiдзначають, що насичення тканини головного мозку лшопротешами, що м^тять АпоЕ, означае його участь у транспорт й обмт холестерину в ЦНС. Холестерин необхщний для утворення синапыв, формування дендритiв, тривало! потенцiацi! та керування ростом аксошв. Холестерин, доставлений у нейрони в складi АпоЕ-вмiсних лiпопроте!нiв, активуе формування синапыв, стимулюючи бiогенез синаптичних везикул та роботу апарату, необхщного для !х вивiльнення. Шсля пошкодження нейрону, його загибелi, травматичного пошкодження головного мозку велика юльюсть холестерину втрачаеться внаслщок деградацп мембран i мiелiну. У вщповщь на це синтез АпоЕ посилюеться в астроцитах i макрофагах — клиинах, у яких вiн пер-винно задiяний у процесах перерозподшу й клiренсу холестерину та залишюв лiпiдiв. Накопичено значну доказову базу, що свщчить про критично важливу роль АпоЕ у вщповвд ЦНС на травму переважно шляхом транспортування холестерину та лшвдв з вогнища ушкодження, а також сприяння репарацп нервово! тканини.
D.T. Laskowitz, М.Р. Vitek [6] детально проаналь зували результати власних дослщжень i данi лиера-тури, що стосуються ролi АпоЕ в регуляцп глiальних реакцiй i запально! вiдповiдi ЦНС на травму. У до-слiдженнях in vitro АпоЕ у фiзiологiчнiй концентрацi! модифiкуе активацш астроцитiв i мiкроглi!, а також секрецш ними медiаторiв запалення. Зокрема, АпоЕ пригшчуе секрецiю фактору некрозу пухлин-а (ФНП-а) в культурi мiкроглiоцитiв людини. Такий ефект е алель-специфiчним i iзоформа-специфiчним, що шд-тверджуеться бiльш вираженим нейрозапаленням у трансгенних тварин з генотипом апоЕ4, порiвняно з апоЕЗ, при моделюванш системно! запально! реакцi! у мишей. При подальшому використаннi трансгенних тварин при експериментальнш ЧМТ виявлеш гiршi наслiдки травми в АпоЕ-дефщитних мишей i вiдзначено, що ключовим чинником, який визначае такий результат, е дизрегулящя дальних функцiй i нейрозапально! вiдповiдi. Автори дiйшли висновку, що провщною складовою захисних властивостей АпоЕ при ЧМТ е модифшащя запально! вщповвд в головному мозку.
У юлькох дослiдженнях продемонстровано участь АпоЕ у функцюнуванш системи антиоксидантного
захисту головного мозку. Так, у фiзioлoгiчнiй кон-центрацп АпоЕ значно знижуе Н202-шдуковану за-гибель нервових клиин [9]. Антиоксидантний ефект цього бшка виявився aлель-специфiчним. Захисна ефектившсть iзoфoрм АпоЕ зменшувалась у порядку 82>е3>е4, при цьому протекторш влaстивoстi iзoфoрми е2 були удвiчi бiльшими, нiж е4 [10]. При дослщженш мaкрoфaгiв з генотипом апоЕ4 у клiтиннiй культурi встановлено шдвищену oксидaцiю мембран, бiльшу продукцш реактивних сполук кисню й азоту у вщповщь на стимуляцiю токсинами — бaктерiaльним лiпoпoлiсaхaридoм i пара-метоксиамфетамшом [11].
У дoслiдженнях oстaннiх роюв вiдзнaченo на-явнiсть прямо! антиапоптозно! дi! АпоЕ. Зокрема, H. Hayashi i спiвaвтoри [12] показали, що АпоЕ3, зв'язуючись з бiлкoм рецептору лшопроте!шв низь-ко! щiльнoстi (low-density lipoprotein receptor-related protein), гальмуе апоптоз нейрошв через включення шляху внутршньоклиинно! сигнaлiзaцi!, який пе-редбачае активацш прoте!нкiнaзи С5 та iнaктивaцiю глшоген-синтазно! кiнaзи 3р. Iншi дoслiдники [13] показали, що експреая гена апоЕ е реaкцieю на ш-дукцш апоптозу в культурi нейрональних клиин i може вiдoбрaжaти роль АпоЕ у клiренсi апоптозних тiлець з застосуванням мехaнiзмiв взaeмoдi! мiж АпоЕ та вщповщними рецепторами.
Також показано, що апоЕ-генотип i, отже, ек-спресiя тих чи шших iзoфoрм вiдпoвiднoгo бшка реaлiзують прoтектoрнi влaстивoстi АпоЕ через посилення чи гальмування експресп багатьох шших гешв. F. Crawford i спiвaвтoрaми [4] з використанням технологи Microarray у мишей з ЧМТ визначили геномну вщповщь гiпoкaмпa на травму залежно ввд апоЕ-генотипу. Показано, що у транс-генних тварин з апоЕ3-генотипом посилюеться експреыя 621 гена, знижуеться — 86, у мишей з генотипом апоЕ4, який пов'язують з менш ефективною вщповщдю нервово! тканини на травму, вщповщно 207 i 74 гешв. Змши експресi! стосувалися груп гешв, що регулюють рухoмiсть клiтин, морфологш тканин, iмунну вiдпoвiдь, мiжклiтинну сигнaлiзaцiю та взaeмoдiю, запальну вiдпoвiдь, рют клiтин та прoлiферaцiю, мета-бoлiзм лiпiдiв i смерть клiтин. Уы цi функцi! зaдiянi в процеа aктивaцi! макро- та мiкрoглi! та регуляцп запально! вiдпoвiдi на травматичне ураження головного мозку.
Шд час розробки сучасних ме-тoдiв лiкувaння ЧМТ, як правило, звертають увагу на наступне. Перешкодою до ефективного лшування травматичного ураження головного мозку часто е значна шльшсть шляхiв зaгибелi клiтин, багато з яких перекриваються, а також рiзнoмaнiт-ш мoлекулярнi мехaнiзми патогенезу i нетривaлi «терaпевтичнi вiкнa» для деяких видiв смертi клiтин [14]. Поряд з нейрoн-специфiчними шляхами патогенезу ЧМТ значну роль
в1Д1грае вторинна неиротоксичшсть, що е насл1дком м1крогл1альних запальних реакцш [15]. Саме цим мож-на пояснити вщсутшсть усшху клш1чних випробувань р1зних засоб1в неИропротекцп при ЧМТ, спрямованих на окрем1 ланки патогенезу смерл кл1тин або на л з них, вплив на яю дуже обмежениИ у час [14]. Бшьше того, вважають, що гальмування одного з шлях1в за-гибел1 кл1тин (некротичного або апоптотичного) може активувати шший [16, 17]. Ця думка шдтверджуеться спостереженнями, що пригшчення апоптозу може сприяти активацп шших, неапоптозних, вар1анлв програмовано! смерл клггин [18]. З огляду на зазна-чене, таю методи лшування ЧМТ в експерименл та клшщ1, спрямоваш на обмежену юльюсть «м1шенеИ», вважають сьогодш симплшацшними, 1 припускають, що усшх матимуть стратег!! лшування, що вплива-ють на р1зш механ1зми загибел1 кл1тин 1 множинш фактори вторинного ураження головного мозку [14, 19]. Таке припущення шдтверджуеться результатами доклш1чних випробувань, в яких оцшювали ефек-тивн1сть при ЧМТ мультипотентних терапевтичних агенлв з пол1функцюнальною активн1стю, зокрема, малих цикл1чних дипептид1в, прогестерону, статин1в, еритропоетину тощо [20]. Зважаючи на позитивний л1кувальний ефект АпоЕЗ при експериментальн1И ЧМТ у нашому досл1дженн1, можемо вважати, що ця 1зоформа АпоЕ належить до таких мультипотентних агенлв. Можливими точками прикладання !х дп можуть бути (див. схему): 1) вплив АпоЕ на нор-мал1зацш л1п1дного компоненту нервових клггин; 2) роль АпоЕ в регуляцп гл1альних реакц1И 1 запально!
I
II
III
IV
Метaбoлiчний стрес (АТФ^, лактатТ) 1онний дисбаланс (Са2+, Na+, K+) Вившьнення цитoкiнiв Порушення гемaтoенцефaлiчнoгo бар'еру Церебральний крововилив Пошкодження мембран Формування вогнищевого забою Первинна aксoтoмiя
Ексaйтoтoксичнiсть
сС^Океидантний стрес (вiльнi радикалиЛ^5
Набряк глш
З
апалення
Некроз
Вторинна aксoтoмiя
Порушення внутрiшньoклiтиннo! сигнaлiзaцil С[]Диференцшована експресiя генiв Апопт
Порушення аксонального транспорту Вaлерiвськa дегенеращя
Формування iнфaркту Атрoфiя мозку Функцюнальний дефiцит
Схема патогенетичних мехaнiзмiв ЧМТ [1, 21]. Чотири фази посттравматичного перюду видшеш для розподшу усiх прoцесiв на негaйнi, гостр^ пiдгoстрi та нaслiдкoвi. Овалами означеш вiдoмi точки прикладання лiкувaльнo! дп АпоЕ.
вщповвд ЦНС на травму; 3) антиоксидантш ефекти АпоЕ; 4) участь АпоЕ у регуляцп процесiв смерт клiтин; 5) вплив АпоЕ на експресш iнших гешв i регулящя геномно! вiдповiдi клiтин ЦНС за !! за-хворювань i пошкодження. Слiд зазначити, що дeякi з цих ефеклв рeалiзуються шляхом ушверсальних клiтинних i тканинних рeакцiй, активацп спiльних каскадiв внутршньоклггинно! та мiжклiтинно! сиг-налiзацil. Тому, iнколи зазначеш мeханiзми вигля-дають настiльки взаемопов'язаними, що !х важко вiддiлити один вщ одного, а запропонований розподш сприяе радше полегшенню класифшацп та викла-дення матeрiалу, нiж дозволяе остаточно пояснити складний молекулярний феномен, яким е роль АпоЕ в життедiяльностi нервово! тканини.
Висновки. 1. Генна терашя шляхом лшосомаль-но! трансфекцп тканини головного мозку плазмiдним вектором, що несе ген апоЕ3, ефективно гальмуе вто-ринне пошкодження гiпокампа за тяжко! дифузно! ЧМТ в eкспeримeнтi, що супроводжуеться меншою виражeнiстю та швидшим регресом функцiональниx наслiдкiв травми.
2. Можливими мехашзмами лшувально! дп АпоЕЗ при ЧМТ е вплив АпоЕ на нормалiзацiю лiпiдного компоненту нервових клггин, роль АпоЕ в регуляцп дальних рeакцiй i запально! вщповвд ЦНС на травму, антиоксидантнi ефекти АпоЕ, участь АпоЕ у регуляцп процеав смерт клiтин, вплив АпоЕ на експресш шших гeнiв i рeгуляцiя геномно! вщ-повiдi клггин ЦНС.
Список лiтератури
1. Pharmacology of traumatic brain injury: where is the "golden bullet"? / K. Beauchamp, H. Mutlak, W.R. Smith [et al.] // Mol. Med. — 2008. — V.14, N11-12. — P.731-740.
2. The impact of traumatic brain injuries: a global perspective / A.A. Hyder, C.A. Wunderlich, P. Puvanachandra [et al.] // NeuroRehabilitation. — 2007. — V.22, N5. — P.341-353.
3. Traumatic brain injury in the United States: a public health perspective / D.J. Thurman, C. Alverson, K.A. Dunn [et al.] // J. Head Trauma Rehabil. — 1999. — V.14, N6. — P.602-615.
4. Apolipoprotein E-genotype dependent hippocampal and cortical responses to traumatic brain injury / F. Crawford, M. Wood, S. Ferguson [et al.] // Neuroscience. — 2009.
— V.159. — P.1349-1362.
5. Hauser P.S. Apolipoprotein E: from lipid transport to neurobiology / P.S. Hauser, V. Narayanaswami, R.O. Ryan // Prog. Lipid Res. — 2011. — V.50. — P.62-74.
6. Laskowitz D.T. Apolipoprotein E and neurological disease: therapeutic potential and pharmacogenomic interaction / D.T. Laskowitz, M P. Vitek // Pharmacogenomics. — 2007.
— V.8, N8. — P.959-969.
7. Apolipoprotein E and central nervous system disorders: reviews of clinical findings / M. Takeda, R. Martinez, T. Kudo [et al.] // Psychiat. Clin. Neurosci. — 2010. — V.64.
— P.592-607.
8. Verghese P.B. Apolipoprotein E in Alzheimer's disease and other neurological disorders / P.B Verghese, J.M
Castellano, D.M. Holtzman // Lancet Neurol. — 2011.
— V.10. — P.241-252.
9. Apolipoprotein E protects against oxidative stress in mixed neuronal-glial cell cultures by reducing glutamate toxicity / Y. Lee, M, Aono, D. Laskowitz [et al.] // Neurochem. Int.
— 2004. — V.44, N2. — P.107-118.
10. Miyata M. Apolipoprotein E allele-specific antioxidant activity and effects on cytotoxicity by oxidative insults and beta-amyloid peptides / M. Miyata, J.D. Smith // Nat. Genet. — 1996. — V.14. — P.55-61.
11. Differential effects of apolipoprotein E3 and E4 on markers of oxidative status in macrophages / L. Jofre-Monseny, S. de Pascual-Teresa, E. Plonka [et al.] // Br. J. Nutr. — 2007.
— V.97. — P.864-871.
12. Apolipoprotein E-containing lipoproteins protect neurons from apoptosis via a signaling pathway involving low-density lipoprotein receptor-related protein-1 / H. Hayashi, R. B. Campenot, D. E. Vance, J. E. Vance // J. Neurosci. — 2007. — V. 27, N8. — P. 1933—1941.
13. Apoptosis induces neuronal apolipoprotein-E synthesis and localization in apoptotic bodies / D.A. Elliott, W.S. Kim, D.A. Jans, B. Garner // Neurosci. Lett. — 2007. — V.416.
— P.206-210.
14. Faden A.I. Neuroprotection and traumatic brain injury: theoretical option or realistic proposition / A.I. Faden // Curr. Opin. Neurol. — 2002. — V.15. — P.707-712.
15. Byrnes K.R. Metabotropic glutamate receptors as targets for multipotential treatment of neurological disorders / K.R. Byrnes, D.. Loane, A.I. Faden // Neurotherapeutics.
— 2009. — V.6. — P.94-107.
16. N-Methyl-D-aspartate antagonists and apoptotic cell death triggered by head trauma in developing rat brain / D. Pohl, P. Bittigau, M.J. Ishimaru [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1999. — V.96, N5. — P.2508-2513.
17. Caspase-mediated degradation of AMPA receptor subunits: a mechanism for preventing excitotoxic necrosis and ensuring apoptosis / G.W. Glazner, S.L. Chan, C. Lu, M.P. Mattson // J. Neurosci. — 2000. — V.20. — P.3641-3649.
18. Bredesen D.E. Key note lecture: toward a mechanistic taxonomy for cell death programs / D.E. Bredesen // Stroke. — 2007. — V.38, N2, suppl. — P.652-660.
19. Raghupathi R. Cell death mechanisms following traumatic brain injury / R. Raghupathi // Brain Pathol. — 2004.
— V.14. — P.215-222.
20. Stoica B.A. Cell death mechanisms and modulation in traumatic brain injury / B.A. Stoica, A.I. Faden // Neurotherapeutics. — 2010. — V.7, N1. — P.3-12.
21. Bramlett H.M. Pathophysiology of cerebral ischemia and brain trauma: similarities and differences / H.M. Bramlett, W.D. Dietrich // J. Cereb. Blood Flow Metab. — 2004.
— V.24. — P.133-150.
Надшшла до редакцгг 10.01.12 Прийнята до публтацп 17.02.12
Адреса для листування:
Быошицький Вадим Васильович 04050, Кигв, вул. Платона Майбороди, 32 1нститут нейрохiрургii ím. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украгни, вiддiлення нейротравми e-mail: headinjury@ukr.net
Белошицкий В.В.
Лечебное воздействие изоформы е3 аполипопротеина Е на патофизиологические механизмы вторичного повреждения головного мозга при экспериментальной черепно-мозговой травме
Институт нейрохирургии
им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины,
отделение нейротравмы, г. Киев
Цель. Изучить терапевтические возможности применения изоформы е3 аполипопротеина Е, синтез которой в нервной ткани индуцирован методом генной терапии, при экспериментальной черепно-мозговой травме (ЧМТ) и на основании анализа данных литературы объяснить возможные механизмы его лечебного действия.
Методы. Структурные и функциональные изменения оценивали у взрослых крыс-самцов линии Вистар на 10-е сутки после тяжелой диффузной ЧМТ, воспроизведенной на модели «ударного ускорения» падающим грузом. После ЧМТ комплекс катионных липосом ДОТАП и 25 мкг плазмидного вектора pCMV-APOE3 вводили в желудочек мозга с помощью осмотических помп ALZET. Оценивали СА1 поля гиппокампа с помощью световой и электронной микроскопии, морфометрии, иммуноцитохимического и конфокально-микроскопического исследования с использованием селективных маркеров нейронов (NeuN) и астроцитов (GFAP). Функциональный исход травмы оценивали в тесте «открытое поле».
Результаты. По данным экспериментального исследования, липосомальная трансфекция геном апоЕ3 оказывает положительный лечебный эффект на структуру и ультраструктуру гиппокампа, уменьшает гибель нейронов, степень диффузного повреждения аксонов, глиоз и микроглиальную реакцию, а также способствует регрессу посттравматического стресса и тревожности.
Вывод. По данным литературы, возможными механизмами лечебного действия АпоЕ3 являются влияние аполипопротеина Е на нормализацию липидного компонента нервных клеток, роль апо-липопротеина Е в регуляции глиальных реакций и воспалительного ответа ЦНС на травму, антиок-сидантные эффекты аполипопротеина Е, участие аполипопротеина Е в регуляции процессов смерти клеток, влияние аполипопротеина Е на експрессию других генов и регуляция геномного ответа клеток ЦНС на травму.
Ключевые слова: черепно-мозговая травма, генная терапия, аполипопротеин Е, изоформа е3, механизм лечебного действия
Поступила в редакцию 10.01.12
Принята к публикации 17.02.12 Адрес для переписки:
Белошицкий Вадим Васильевич 04050, Киев, ул.Платона Майбороды, 32 Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины, отделение нейротравмы e-mail: headinjury@ukr.net
Biloshytsky V.V.
The therapeutic influence of 83 isoform of apolipoprotein E on pathophysiological mechanisms of secondary brain injury evolution after experimental traumatic brain injury
Institute of Neurosurgery
named after acad. A.P. Romodanov NAMS Ukraine, Neurotrauma Department, Kiev, Ukraine
Purpose. To test the therapeutic potential of apolipoprotein E isoform 83, whose synthesis in nerve tissue was induced by means of gene therapy, in an experimental traumatic brain injury (TBI) model, and to substantiate its mechanism of therapeutic action based on current literature data.
Methods. To determine structural and functional changes associated with severe diffuse TBI, adult male Wistar rats were subjected to weight drop impact acceleration injury and evaluated at day 10 after trauma. A mixture of DOTAP liposomes and 25 ^g of recombinant plasmid pCMV-APOE3 cDNA was infused intraventicularly immediately after TBI using ALZET osmotic pumps. The hippocampal CA1 regions were analyzed by means of light and electron microscopy, morphometry, immunocytochemical and confocal analysis using markers selective for neurons (NeuN) and astrocytes (GFAP). The neurofunctional outcome was assessed in an open field test.
Results. The research data have shown that cationic liposome-mediated APOE3 gene transfer has a beneficial effect on hippocampal structure and ultrastructure, diminishes neuronal loss and severity of diffuse axonal injury, gliosis and microglial reaction, as well as aids regression of posttraumatic stress and anxiety.
Conclusion. According to literature data, possible mechanisms of apoE therapeutic action are (1) normalization of neural cellular lipid component, (2) its role in regulating reactive gliosis and inflammatory response of CNS to injury, (3) antioxidant effects of apolipoprotein E, (4) regulation of cell death mechanisms, (5) influence of apolipoprotein E on differential gene expression and regulation of genomic response of CNS cells to injury
Key words: traumatic brain injury, gene therapy, apolipoprotein E, isoform 83, mechanism of therapeutic action.
Received January 10, 2012 Accepted February 17, 2012
Address for correspondence:
Vadym Biloshytsky 04050, 32 Platon Mayborodа St, Kiev, Ukraine Institute of Neurosurgery named after acad. A.P. Romodanov NAMS Ukraine,
Neurotrauma Department e-mail: headinjury@ukr.net
Коментар
до статт'1 Блошицького В.В. «Лкувальний вплив 'зоформи £3 апол'топротешу Е на патоф'зюлопчш механ'зми вторинного ураження головного мозку при експериментальнт черепно-мозковй травмi»
Черепно-мозкова травма (ЧМТ) поадае одне з провщних мюць у структурi захворюваност й смер-тносп в усьому свт. Досягнуте в недавньому мину-лому полтшення наслщюв ЧМТ зумовлене устхами у розвитку штенсивноТ терапií, нейрохiрургiчноí технiки та реабЫтаци. Наступним кроком мае стати розробка ефективноТ фармакотерапiТ ЧМТ, проте, у бшьшосл клiнiчних дослiджень у цьому напрямку бажаш цiлi не досягнут^ що може бути зумовлене недостатшм розумiнням складного багатовимiрного патогенезу ЧМТ.
Стаття е продовженням низки публкацш про мож-ливостi генноТ терапiТ в гострому перiодi ЧМТ, що е новим i сучасним напрямком у нейрохiрургiТ. Стаття побудована за загальноприйнятим планом. Крiм результа^в дослiдження впливу аполiпопротеТну Е,
синтез якого в травмованш ЦНС шдукований методом генноТ терапiТ, на структуры та функцюнальш прояви тяжкоТ ЧМТ в експеримент^ стаття мiстить простору довщку про вплив аполiпопротеТну Е на метаболiзм i функцiю ^тин головного мозку. Аналiзуючи данi л^ератури, автор показуе, що успiх у лкуванш ЧМТ матимуть методи лкування, якi впливатимуть на рiзнi мехашзми загибелi клiтин i численнi фактори вторинного ураження головного мозку. Терапевтичним агентом з подiбною полiфункцiональною актившстю може стати аполiпопротеТн Е.
З огляду на зазначене, подальше вивчення мож-ливостей аполтопротеТну Е як терапевтичного агента i генноТ терапи як методу лiкування ЧМТ е перспек-тивним i потребуе продовження.
М.1.Лсяний, член-кор. НАМН Украни, професор, завдувач вщдшу нейроiмунологií 1нституту нейрох'фургп '¡м. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украни
