CC BY
19УДК 616.831-009.1-053.2/6+616-009.12+616-003
ВЛИЯНИЕ ТКАНЕСПЕЦИФИЧНОГО БЕЛКОВО-ПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА ПРЕПАРАТА «ЦЕЛЛЕКС» НА ПРОЦЕССЫ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ НЕРВОВ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТА
Корсунская Л. Л.3, Муратова Л. Р.1, Власенко С. В.2, Давыдова А. А.4, Ларина Н. В.3
'Ветеринарная клиника «Оберег», 295013, ул. Балаклавская, 99а, Симферополь, Россия;
2ГБУЗРК «Научно-исследовательский институт детской курортологии, физиотерапии и медицинской реабилитации», 97400, ул. Дувановская, 21, Евпатория, Россия;
3 Кафедра нервных болезней и нейрохирургии, Медицинская академия им. С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина, 5/7, Симферополь, Россия;
4 Кафедра патологической анатомии с секционным курсом, Медицинская академия им. С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина, 5/7, Симферополь, Россия;
Для корреспонденции: Власенко Сергей Валерьевич, доктор медицинских наук, старший научный сотрудник ГБУЗРК «Научно-исследовательский институт детской курортологии, физиотерапии и медицинской реабилитации», заведующий специализированным отделением для психоневрологических больных ФГБУ «Евпаторийский военный детский клинический санаторий им. Е. П. Глинки» Минобороны России. E-mail: vlasenko65@rambler.ru
For correspondence: Vlasenko Sergey Valerievich, MD, Senior researcher at the State Scientific and Research Institute ofChildren's Balneology, Physiotherapy and Medical Rehabilitation, Head of the Specialized Department for Psychoneurological Patients of the Yevpatoriya E.P. Glinka Military Children's Clinical Sanatorium» Ministry of Defense of Russia. E-mail: vlasenko65@rambler.ru Information about authors:
Korsunskaya L. L., orcid.org 0000-0003-0958-130X Muratova L. R., orcid.org/0000-0001-7750-2082 Vlasenko S. V., orcid.org/ 0000-0002-1417-1164 Larina N. V., orcid.org/ 0000-0002-6996-4823 Davydova A. A., orcid.org/0000-0002-9709-4263
РЕЗЮМЕ
В условиях лабораторного эксперимента была создана модель полного пересечения седалищного нерва у кроликов породы шиншилла. После восстановления целостности нерва изучались последующие морфологические изменения. Было показано, что процессы регенерации аксонов, ремиелинизации более активно протекали в группе животных, получавших препарат «Целлекс», по сравнению с группой животных, получавших 0,9 % раствор натрия хлорида.
Ключевые слова: седалищный нерв; морфологические изменения; ремиелинизация; «Целлекс».
EXPERIMENTAL MONITORING AND EVALUATION OF THE REGENERATIVE EFFECT OF TISSUE-SPECIFIC PROTEIN-PEPTIDE COMPLEX OF THE DRUG «CELLEX» ON PERIPHERAL NERVES
Korsunskaya L. L., Muratova L. R., Vlasenko S. V., Davydova A. A., Larina N. V.
First Veterinary clinic "Obereg", Simferopol, Russia
Scientific Research Institute of Children's Balneology, Physiotherapy and Medical Rehabilitation, Evpatoria, Russia. Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
SUMMARY
An experimental model of intersection of the sciatic nerve in rabbits of the chinchilla breed was created. After the nerve had completely restored its function, subsequent morphological changes were examined. It has been established that the processes of regeneration of axons and remyelinization are more active in the group of animals taking the drug "Zelleks" than in animals receiving 0.9% sodium chloride solution.
Keywords:. Sciatic nerve; morphological changes; remyelination; "Cellex".
Основным фактором успеха в изучении патогенетических и молекулярных механизмов развития заболеваний центральной и периферической нервной системы, а также в разработке и внедрении новых методов лечения неврологической патологии является
создание удобных и воспроизводимых моделей поражения мозга различного типа.
Эксперимент с использованием лабораторных животных и других живых объектов является одним из ведущих методов познания в современной медицине, фармакологии,
ветеринарии, биологии. Успешность любого эксперимента определяется соблюдением техники и методики эксперимента, а также выбором лабораторных животных [1; 11].
Ввиду ряда преимуществ для создания эксперимента используются кролики породы шиншилла. В первую очередь, это было обусловлено следующими нейрофизиологическими особенностями животных: филогенез центральной нервной системы кролика и человека очень схожи - процесс миелинизации нервного волокна у большинства всех млекопитающих, включая приматов, практически заканчивается к моменту родов, то есть активно протекает в прена-тальном периоде, в отличие от человека и кролика, у которых процессы миелинизации сохраняются в постнатальном периоде. [5; 6; 8; 9; 10].
Таким образом, разработка и внедрение в практику новых экспериментальных моделей неврологических заболеваний позволит значительно сократить время тестирования новых биологически активных соединений в качестве потенциальных лекарственных препаратов, а также позволит выявить ранние и доклинические маркеры различных патологических состояний в неврологии.
Во всем мире отмечается неуклонный рост числа заболеваний нервной системы, относимых вследствие своей распространенности и последствий к категории социально значимых: сосудистые заболевания мозга, нейродегенеративные заболевания, спинальная травма и др., инвалиди-зация вследствие неврологических заболеваний.
Цереброваскулярная патология занимает второе место в ряду основных причин смерти, уступая лишь смертности от заболеваний сердца и опережая смертность от опухолей всех локализаций, и является ведущей причиной инвали-дизации населения, что определяет ее как одну из важнейших медицинских и социальных проблем (Е. И. Гусев, 2002, 2005; В. И. Скворцова, 2006). При церебральных кровоизлияниях отмечается большая летальность, которая, по данным разных авторов, колеблется от 75 до 95 %.
Нейроны являются высокоспециализированными постмитотическими клетками, гибель которых приводит к дезинтеграции иерархических структур мозга, утрате соответствующей специализированной функции и развитию, как правило, необратимого неврологического и/ или психического дефекта. В отличие от кожной раны, которая заживает по первичному натяжению, если ее края привести в соприкосновение, место пореза нерва первичным натяжением не срастается, даже в тех случаях, когда наложены немедленно эпиневральные швы. Моделированием процессов регенерации нервов занима-
лись на протяжении последних десятилетий многочисленные ученые [4; 5; 7]. Срастание разорванных частей нерва и восстановление его функций происходит путем длительного процесса регенерации нервных волокон, причем новообразованные нервные волокна растут из центрального участка поврежденного нерва. В этом приспособительном процессе, по-видимому, большую роль сыграли повреждающие факторы - травмы, в результате которых нарушалась анатомическая целостность нервных стволов конечностей и других периферических нервов. Именно нервные стволы и периферические смешанные нервы обладают наиболее высокой степенью регенерации, в то время как спинной и головной мозг этим свойством обладают значительно меньшей степени. В условиях весьма ограниченных возможностей регенерации нейронов проблема нейропротекции, т. е. защиты нейронов от повреждающего действия каскада нейрохимических реакций при острых катастрофах (инсульт, травма и др.) и хронических патологических процессах в нервной системе, выходит на первый план. Поэтому до настоящего времени актуальными остаются вопросы поиска эффективных методов лечения патологии центральной и периферической нервной систем, стимулирующих их восстановление, активизирующих процессы регенерации, что в целом будет способствовать восстановлению утраченных функций у человека, перенесшего одно из заболеваний нервной системы.
Цель данной работы - изучить влияние препарата Целлекс® на регенераторные процессы, происходящие при экспериментальном моделировании полного пересечения седалищного нерва у кроликов породы шиншилла.
Целлекс® - первый лекарственный препарат, обладающий прямым нейропротективным и нейрорепаративным действием, проявляющимся в восстановлении регенеративного потенциала клеток мозга (стимуляции экспрессии нейро-нальных генов, миграции нейрональных стволовых клеток и нейробластов к очагу повреждения) за счет наличия органоспецифических сигнальных белков - факторов роста, факторов дифференцировки нервных клеток и регулятор-ных пептидов. Исследуемый препарат принципиально отличается от нейротропных средств из группы ноотропов (нейрометаболических стимуляторов), которые могут улучшать регенерацию повреждённых нервных тканей только косвенно, за счёт положительного влияния на метаболизм, микроциркуляцию и другие функциональные показатели. Препарат зарегистрирован в Российской Федерации с показанием к применению - острые нарушения мозгового кровоо-
бращения ишемического и геморрагического характера в острую и раннюю реабилитационную стадию (Г. А. Суслова, А. А. Королев, 2010).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование проведено в соответствии с юридическими и этическими нормами, предусмотренными Хельсинкской декларацией, действующим законодательством РФ, а также принципами Надлежащей клинической практики (ССР). Заключение комиссии по биоэтике ГБУЗРК «Научно-исследовательский институт детской курортологии, физиотерапии и медицинской реабилитации» от 09.02.2017.
В ходе исследования проведены меры по обеспечению и контролю качества. В рамках исследования проводились мониторинговых визиты, на которых осуществлялась оценка соответствия хода исследования требованиям, изложенным в протоколе исследования, проверка первичной документации, индивидуальных регистрационных карт (ИРК).
Диагноз и основные критерии включения:
1. кролики-самцы;
2. порода «шиншилла»;
3. масса тела от 1,5 до 2 кг;
4. возраст от 6 месяцев до 1 года;
5. содержание животных в стандартных условиях вивария (12-часовой световой день, свободный доступ к воде и пище, температура воздуха 23-25°С).
Критерии невключения в исследование:
1. кролики-самки;
2. другая порода;
3. масса тела до 1,5 и свыше 2 кг;
4. возраст до 6 месяцев и старше 1года;
5. содержание животных в нестандартных условиях вивария.
После прохождения процедур скрининга и соответствия критериям включения/невключения животные относились к одной из двух групп лечения:
1. основная группа (ОГ) (группа Цел-лекс®) - 10 кроликов с моделью полного пересечения седалищного нерва с последующим его сшиванием также получали 10-дневный курс инъекций препарата Целлекс;
2. группа контроля (ГК) - 10 кроликов проходили аналогичный курс подкожного введения 1 мл 0,9 % физиологического раствора.
В исследование были включены 40 (100 %) кроликов породы «шиншилла» мужского пола.
Различий по полу между основной и контрольной группами не было.
Средний возраст животных, включенных в исследование, составил 9,58±1,97, средний возраст животных ОГ - 9,6±1,96 месяцев,
КГ - 9,65±1,88. Статистически значимых различий между основной и контрольной группами не наблюдалось (p>0,05, t-критерий).
При обработке и анализе материала использован комплексный подход с использованием современных методов, которые включали в себя: гистологический (окраска гематоксилином и эозином), гистохимический (окраска пикрофуксином по Ван-Гизон), морфометрический и статистический.
Для обзорной световой микроскопии патологических процессов ткань седалищного нерва размером 1х1х0,5 см фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина. Ткань обезвоживали в батарее спиртов восходящей концентрации (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 96 % -1, 96 % - 2 и абсолютный спирт), просветляли в ксилоле, выдерживали в насыщенном при +37°С растворе парафина в ксилоле, помещали в парафин при +56°С, с последующей заливкой в смесь парафина и воска и изготовлением парафиновых блоков. Из парафиновых блоков готовили серийные срезы толщиной 4-5 мкм. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Просмотр и цифровые фотографии микропрепаратов осуществляли с помощью светового микроскопа «OlympusCX-41».
Патогистологическое исследование осуществляли на базе кафедры патологической анатомии с секционным курсом Медицинской Академии имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ имени В. И. Вернадского».
С целью выявления коллагеновых волокон и оценки склеротических процессов в нервной ткани был применен гистохимический метод исследования с пикро-фуксином (окраска по способу Ван-Гизон).
Морфометрическое исследование включало измерение процента площади, занимаемой коллагеновыми волокнами, в 10 произвольно выбранных полях зрения при увеличении 400 при окраске пикрофуксином по Ван-Гизон с помощью программы Software DP-SOFT и последующей статистической обработкой.
Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли цифровой камерой OLYMPUSC 5050Z, установленной на микроскопе «OlympusCX-41».
Статистическая обработка данных выполнена с помощью пакета прикладных программ «StatisticaforWindows» v. 7.0, StatSoftlnc. Сравнение между группами проводили непараметрическими методами с использованием критерия Манна - Уитни. Статистически значимыми считались отличия при р<0,05 (95 %-й уровень значимости) и при р<0,01 (99 %-й уровень значимости).
2018, т. 8, № 1
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В исследуемом материале ГК отмечались умеренно выраженные деструктивно-дистрофические процессы в сочетании с нарушением гемодинамики и воспалительными изменениями.
Наблюдались хаотичное расположение волокон, очаги дегенерации волокна, распад аксонов и миелина, выраженная липоидная дегенерация аксонов и различные изменения в миелино-вой оболочке, в том числе неравномерное распределение и переменная толщина ее (рис. 1).
при окраске по Ван-Гизон окрашивалась в малиновый цвет (рис. 3).
Рис. 2. Фокальная деградация миелиновой оболочки, на фоне фиброза и отека. Окраска гематоксилин и эозин. Ув. 100.
Во всех наблюдениях ГК отмечалось очаговое разрастание соединительной ткани, которая
Рис. 1. Выраженные дистрофические изменения в нервном волокне. Окраска гематоксилин и эозин. Ув. 200.
В некоторых участках нормальная структура миелиновой оболочки почти полностью исчезла, оставив нечеткий контур и заметный отек нерва (рис. 2).
Рис. 3. Умеренная позитивная реакция коллаге-новых волокон в материале ГК. Окраска пикро-фуксином по Ван-Гизон. Ув. 100.
При морфометрическом исследовании материала ГК было выявлено, что коллагено-вые волокна занимают 11,13±0,8 % площади в 10 произвольно выбранных полях зрения.
Во всех наблюдениях ГК отмечались признаки расстройства кровообращения в виде полнокровия, отека и петехиальных кровоизлияний (рис. 4).
Рис. 4. Полнокровие микрососудов на периферии дистрофически измененного нервного волокна животного ГК. Окраска гематоксилин и эозин. Ув. 200.
Обращала на себя внимание очаговая лим-фогистиоцитарная инфильтрация с примесью нейтрофильных гранулоцитов (рис. 5).
В основной группе волокна седалищного нерва также очагово имели нерегулярное расположение, признаки отека и вакуолизации, мие-линовая оболочка характеризовалась умеренно выраженной очаговой липоидной дистрофией (рис. 6).
Рис. 5. Периневральный полосовидный воспалительный инфильтрат в исследовании группы сравнения. Окраска гематоксилин и эозин. Ув. 100.
Рис. 7. Очаговая лимфогистиоцитарная инфильтрация около шовного материала. Окраска гематоксилин и эозин. Ув. 100.
Рис. 6. Очаговая липоидная дистрофия миелино-вой оболочки седалищного нерва у животного
ОГ. Окраска гематоксилин и эозин. Ув. 100.
Лимфогистиоцитарная инфильтрация в наблюдениях ОГ имела очаговый слабовыра-женный характер, локализовалась преимущественно вокруг шовного материала (рис. 7).
Кроме того, в исследованиях ОГ вокруг шовного материала обнаруживались множественные гигантские многоядерные клетки инородных тел (рис. 8) на фоне слабовыра-женной лимфогистиоцитарной инфильтрации.
Гемодинамические расстройства в наблюдениях ОГ носили слабовыраженный характер. При окраске пикрофуксином по Ван-Гизон в материале животных ОГ отмечалось очаговое разрастание соединительной ткани (рис. 9).
При морфометрическом исследовании материала ОГ было выявлено, что коллагено-вые волокна занимают 12,03±0,6 % площади в 10 произвольно выбранных полях зрения.
Рис. 8. Скопление гигантских многоядерных клеток инородных тел вокруг шовного материала. Окраска гематоксилин и эозин. Ув. 400.
Рис. 9. Очаговая умеренновыраженная позитивная реакция коллагеновых волокон в материале ОГ. Окраска пикрофуксином по Ван-Гизон. Ув. 100.
2018, т. 8, № 1
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, гистологическая картина ткани седалищного нерва кроликов при экспериментальном моделировании пересечения характеризовалась разнообразными морфологическими проявлениями различной степени выраженности. Отмечались умеренно выраженные деструктивно-дистрофические изменения в сочетании с нарушением гемодинамики и умеренно выраженной воспалительной реакцией.
В ОГ дистрофические изменения ткани седалищного нерва носили слабовыраженный очаговый характер, регенерация аксонов и ми-елинизация их проходила более активно, чем в группе сравнения, а степень выраженности воспалительных и гемодинамических нарушений была значительно ниже. Также обращало на себя внимание формирование кластеров гигантских многоядерных клеток инородных тел вокруг шовного материала. Такие микроскопические изменения, вероятно, можно объяснить тем, что препарат «Целлекс», обладая свойством тормозить имуногенную цитотоксичность макрофагов, приводит к снижению интенсивности аль-теративно-экссудативного компонента воспалительного процесса и повышает потребность в фагоцитозе, что и приводит к формированию гигантских многоядерных клеток инородных тел.
Кроме того, выявлено, что всех наблюдениях, которые относились и к основной группе, и к группе сравнения имел место очаговый умеренно выраженный фиброз, морфометрические показатели которого статистически не отличались.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors have no conflict of interest to declare.
ЛИТЕРАТУРА
1. Каркищенко Н. Н., Грачева С. В. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях. М.: Профиль, 2010.
2. Суслова Г. А., Королев А. А. Оценка эффективности реабилитационных мероприятий в остром периоде церебрального ишемического инсульта. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2010;8:60-61.
3. Donzelli R., Capone C., Sgulo F. G., Mariniello G., Maiuri F. Vascularizednervegrafts: anexperimentalstudy. NeurolRes. 2016;38(8):669-677.
4. Daoudi K., Chgoury F., Rezzak M., Bourouah O., Boussadda L., Soukri A., Sabatier J. M., Oukkache N. Consequences of Androctonusmauretanicus and Buthusoccitanus scorpion venoms on electrolyte levels in rabbits.Heliyon. 2017;3(1):221.
5. Harel S., Shapira Y., Tomer A., Donahue M. J., Quilligan E. Vascular-induced intrauterine growth retardation: relations between birth weight and the
development of biochemical parameters in young rabbits. Israel J Med Sci.1985;(2):829-832.
6. Hasegawa M., Houdou S., Mito T., Takashima S., Asanuma K., Ohno T. Development of myelination in the human fetal and infant cerebrum: a myelin basic protein immunohistochemical study. Brain Dev. 1992;14:1-6.
7. Khammy M. M., Angus J. A., Wright C. E. Eur J Pharmacol. Vascular reactivity of rabbit isolated renal and femoral resistance arteries in renal wrap hypertension.2016;773:32-41.
8. Kinney H. C., Brody B. A., Kloman A. S., Gilles F. H. Sequence of central nervous system myelination in human infancy. II. Patterns of myelination in autopsied infants. J Neuropathol Exp Neurol.1988;47:217-234.
9. Marthens E., Harel S., Zamenshof S. Experimental intrauterine growth retardation. Biol Neonate.1975;26:221-231.
10. Paus T., Collins D. L., Evans A. C., Leonard G., Pike B., Zijdenbos A. Maturation of white matter in the human brain: a review of magnetic resonance studies. Brain Res Bull.2001;54:255-266.
11. Reichert P., Kielbowicz Z., Dzi^giel P., Pula B., Kuryszko J., Wrzosek M., Kielbowicz M., Gosk J. Collateral sprouting axons of end-to-side nerve coaptation in the avulsion of ventral branches of the C5-C6 spinal nerves in the brachial plexus. Folia Neuropathol.2015;53(4):327-342.
REFERENCES
1. Karkishchenko N. N., Gracheva S. V. Guide for the care and use of laboratory animals and alternative simulation models in the biomedical sciences. M: Profile, 2010..
2. Suslova G. A., Korolev A. A. Evaluation of the effectiveness of rehabilitation measures in the acute period of cerebral ischemic stroke. Journal of Neurology and Psychiatry named after S. S. Korsakov. 2010;8:60-61.
3.Donzelli R., Capone C., Sgulo F. G., Mariniello G., Maiuri F. Vascularizednervegrafts: anexperimentalstudy. NeurolRes. 2016;38(8):669-677
4.Daoudi K., Chgoury F., Rezzak M., Bourouah O., Boussadda L., Soukri A., Sabatier J. M., Oukkache N. Consequences of Androctonusmauretanicus and Buthusoccitanus scorpion venoms on electrolyte levels in rabbits. Heliyon. 2017;3(1):221.
5. Harel S., Shapira Y., Tomer A., Donahue M. J., Quilligan E. Vascular-induced intrauterine growth retardation: relations between birth weight and the development of biochemical parameters in young rabbits. Israel J Med Sci. 1985; 21: 829-832.
6. Hasegawa M., Houdou S., Mito T., Takashima S., Asanuma K., Ohno T. Development of myelination in the human fetal and infant cerebrum: a myelin basic protein immunohistochemical study. Brain Dev. 1992;14:1-6.
7. Khammy M. M., Angus J. A., Wright C. E. Eur J. Pharmacol. Vascular reactivity of rabbit isolated renal and femoral resistance arteries in renal wrap hypertension. 2016;773:32-41.
8. Kinney H. C., Brody B. A., Kloman A. S., Gilles F. H. Sequence of central nervous system myelination in human infancy. II. Patterns of myelination in autopsied infants. J NeuropatholExpNeurol. 1988;47:217-234.
9. Marthens E., Harel S., Zamenshof S. Experimental intrauterine growth retardation. Biol Neonate. 1975;26:221-231.
10. Paus T., Collins D. L., Evans A. C., Leonard G., Pike B., Zijdenbos A. Maturation of white matter in the
human brain: a review of magnetic resonance studies. Brain Res Bull. 2001;54:255-266.
11. Reichert P., Kielbowicz Z., Dzi^giel P., Pula B., Kuryszko J., Wrzosek M., Kielbowicz M., Gosk J. Collateral sprouting axons of end-to-side nerve coaptation in the avulsion of ventral branches of the C5-C6 spinal nerves in the brachial plexus.FoliaNeuropathol. 2015;53(4):327-42.
