ВЛИЯНИЕ ТИПА АНТИКОАГУЛЯНТА НА ГОМОГЕННОСТЬ АУТОЛОГИЧНОЙ ПЛАЗМЫ, ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ, ПОЛУЧАЕМОЙ ПУТЕМ ДВУХЭТАПНОГО ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ ИЗ МАЛОГО ОБЪЕМА КРОВИ ДЛЯ ЛЕЧЕБНЫХ ЦЕЛЕЙ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 617.3

ВЛИЯНИЕ ТИПА АНТИКОАГУЛЯНТА НА ГОМОГЕННОСТЬ АУТОЛОГИЧНОЙ ПЛАЗМЫ, ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ, ПОЛУЧАЕМОЙ ПУТЕМ ДВУХЭТАПНОГО ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ ИЗ МАЛОГО ОБЪЕМА КРОВИ ДЛЯ ЛЕЧЕБНЫХ ЦЕЛЕЙ

А. С. Ясюкевич,

Г. М. Загородный, канд. мед. наук, доцент,

Н. П. Гулевич, А. А. Пучко

Республиканский научно-практический центр спорта

Аннотация

В статье описан метод получения гомогенной аутологичной плазмы, обогащенной тромбоцитами, получаемой путем двухэтапного центрифугирования из небольшого объема крови. Данный метод был разработан на основании результатов серии опытов получения обогащенной тромбоцитами плазмы с использованием различного типа антикоагулянтов. По результатам исследования был определен оптимальный вид антикоагулянта, режимы центрифугирования и способы введения получаемой плазмы Была изучена местная и общая реакция пациентов на введение обогащенной тромбоцитами плазмы, приготовленной с использованием различного типа антикоагулянтов.

THE IMPACT OF THE ANTICOAGULANT TYPE ON THE HOMOGENEITY

OF AUTOLOGOUS PLATELET-ENRICHED PLASMA OBTAINED

BY TWO-STAGE CENTRIFUGATION FROM SMALL AMOUNTS OF BLOOD FOR THERAPEUTIC PURPOSES

Abstract

The article describes a method for obtaining homogeneous autologous plasma enriched with platelets, extracted by two-stage centrifugation from a small amount of blood. This method was developed based on a series of experiments to obtain platelet-enriched plasma using various types of anticoagulants. The results of the study determined the optimal type of anticoagulant, centrifugation modes and ways of injecting the obtained plasma. The local and general reaction of patients to the introduction of platelet-enriched plasma prepared with various types of anticoagulants was studied.

Введение

Обогащенная тромбоцитами плазма (ОТП, PRP-platelet rich plasma) содержит концентрацию тромбоцитов 1 млн/мкл и более. Получить ОТП можно только из несвернувшейся крови, т.е. из крови, в которую накануне добавлен антикоагулянт [1-3].

Антикоагулянты - вещества, тормозящие свертывание крови. По химической структуре и механизму действия выделяют несколько групп антикоагулянтов:

- прямого быстрого действия. Наибольшее распространение из них получил гепарин. Механизм его действия основан на способности угнетать активность фермента тромбина, вызывающего переход растворимого в плазме фибриногена в нерастворимый фибрин;

- непрямого действия: синтетические производные 4-гидроксикумарина, например дикумарин, фенилиндандиона-фенилин (II), омефин (III) и др. Они угнетают синтез факторов свертывания крови, действуют как антагонисты витамина К [4, 5].

Особая группа антикоагулянтов - соединения редкоземельных элементов (Sc, La и др.), которые снижают свертывание крови как при прямом контакте с ней, так и при введении в организм [6].

Антикоагулянты для забора и/или хранения крови, использования ее компонентов содержатся в специальных емкостях (пакеты, шприц-пробирки и т. д.), которые тормозят свертывание крови, что обеспечивает отсутствие изменений ее компонентов. Свертывание крови предотвращается путем связывания ионов кальция. Твердые или жидкие антикоагулянты, находящиеся в вакуумных пробирках, должны быть смешаны с кровью немедленно после забора крови [7].

Вакуумные шприц-пробирки производятся из пластика и стекла. Недостатком пластиковых пробирок является то, что при длительном хранении некоторые жидкие наполнители в них могут испаряться, поэтому в случаях длительного неиспользования необходимо использовать только стеклянные пробирки. Все вакуумные пробирки стерильные и предназначены для одноразового использования, выпускаются разных объемов - от 1,8 до 10 мл. Объем забираемой пробы обеспечивается точно дозированным вакуумом, под действием которого кровь поступает в пробирку в процессе венепункции. В качестве наполнителей в вакуумных пробирках используются активаторы свертывания (тромбин, кремнезем), антикоагулянты (ЭДТА, цитрат натрия, гепарин и т.д.), разделительные гели и др. Колпачок вакуумной пробирки закодирован цветом, который говорит о типе антикоагулянта [7].

Зарубежные патенты на использование аутологичной плазмы предполагают технологии с использованием пластикового мешка с антикоагулянтом. Однако такой мешок не помещается в стандартную лабораторную центрифугу, обычно используемую в лечебных учреждениях. Поэтому вакуумные шприц-пробирки наиболее удобны для приготовления ОТП в поликлинических условиях.

Концентрация тромбоцитов напрямую коррелирует как с объемом собранной крови, так и с центробежной силой устройства [8].

Результаты активации тромбоцитов in vivo часто искажаются активацией, вызванной in vitro во время препаративных процедур. Учеными изучена активация тромбоцитов ex vivo (базальная) и in vitro (индуцированная тромбином) в образцах цельной крови цитрата

натрия, этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и цитрата теофиллина, дипиридамола, аденозина (CTAD). Средняя плотность тромбоцитов составила 25,7 + /- 0,9 г/дл (цитрат натрия), 27,9 + /0,9 г /дл (ЭДТА) и 24,8 + /- 1,2 г/дл (CTAD). Добавление тромбина вызывало достоверное значительное изменение МРС для цитрата натрия (21,9 + /- 1,9 г/дл) и EDTA (23,2 + /- 0,9 г/дл); при этом изменений не выявлено в пробирке с CTAD. Процент тромбоцитов, экспрессирующих анти-CD62P, увеличивался в образцах с цитратом натрия (с 9,2 + /- 7,0 до 55,5 + /- 23,1%) и с ЭДТА (с 1,9 + /- 1,7 до 64,6 + /- 12,4%); однако, с CTAD значительных изменений не было. Тромбоциты в CTAD, будучи защищенными, оставались «функциональными» после его удаления. CTAD демонстрирует ингибирование активации тромбоцитов in vitro и может быть полезным для стабилизации активации тромбоцитов ex vivo [9, 10].

Среднее значение pH и концентрация ионизированного Ca значительно выше у 3,8 % цитрата натрия, чем у ACD-A. Агрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ и гамма-тромбином, была заметно снижена в ACD-A по сравнению с цитратом натрия. Вместе с тем исследовано влияние антикоагулянтов ACD-A, EDTA и гепарина на регенеративное качество PRP. ЭДТА вызывала набухание и активацию тромбоцитов, но давала наибольшее количество тромбоцитов. Не наблюдалось значительных различий в уровнях PDGF-BB среди протестированных антикоагулянтов. ACD-A дает большую возможность количественного определения и лучшую морфологию тромбоцитов при исследовании мазка [8, 11, 12].

Непрерывное встряхивание на мешалке не вызывает значительного изменения процентного содержания CD62-положительных тромбоцитов во время хранения.

Целью исследования является получение гомогенной взвеси аутологичных тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме, пригодных для ex tempore введения спортсменам с травмами.

Задачи:

1. Определить опытным путем критические параметры гомогенности аутологичной плазмы, обогащенной тромбоцитами, получаемой путем двухэтапного центрифугирования из малого объема крови.

2. Определить оптимальный антикоагулянт.

3. Выбрать оптимальный шприц и размер игл для приготовления ОТП.

4. Оценить реакции спортсменов на введение плазмы.

Материалы и методы

В наших исследованиях использовали лабораторную центрифугу Thermo IEC centra CL3R с радиусом центрифугирования 14 см и наборы вакуумных шприц-пробирок:

1) BD Vacutainer (размер - 16/100 мм) с крышкой Hemogard 8,0 мл без антикоагулянта;

2) BD Vacutainer 6,0 мл с буферным раствором 3,2 % цитрата натрия (соотношение кровь/цитрат - 9/1).

В настоящее время по рекомендациям Института клинических лабораторных стандартов (CLSI) предпочтительным является применение 3,2 % (0,109 М) цитрата натрия. Исследования показали, что использование 3,8 % (0,129 М) приводит к удлинению протромбинового времени [7, 13];

3) BD Vacutainer 8,0 мл с разделительным гелем и гепарином лития в качестве антикоагулянта. Антикоагулянт гепарин инактивирует тромбопластин, снижает образование и активность тромбина, активирует антитромбины и тем самым блокирует каскад свертывания крови. Литий гепарин нанесен на сепарационные гранулы; концентрация гепарина соответствует 16 МЕ на 1 мл крови. Сепарационные гранулы во время центрифугирования образуют слой между плазмой и клетками, облегчая дальнейшее аликвотирование плазмы [4, 6];

4) BD Vacutainer 4,0 мл содержащих антикоагулянт К3ЭДТА (этилендиаминтетраацетат нанесен на внутренние стенки пробирки в виде равномерного мелкодисперсного напыления, благодаря чему он полностью легко растворяется при перемешивании). В качестве антикоагулянта этилендиаминтетрауксусная кислота трикалиевая кислота ингибирует агрегацию тромбоцитов более эффективно, чем раствор кислой цитратной декстрозы, что приводит к более высокому неагрегированному выходу тромбоцитов и конечному содержанию PDGF-BB, однако есть данные о негативном влиянии на стенки тромбоцитов [13];

5) BD Vacutainer 8,5 мл с раствором ACD - A: (Тринатрия цитрат (2.59 мг/мл), лимонная кислота (0.94 мг/мл), декстроза (2.88 мг/мл), сорбат калия (0.024 мг/мл). Цитрат связывает ионы кальция, благодаря чему кровь не свертывается, а декстроза и буферы поддерживают метаболизм тромбоцитов. При этом ACD-A ингибирует агрегацию тромбоцитов обратимо, при этом не повреждается клеточная мембрана. Именно этот антикоагулянт используется в банках крови для хранения тромбоцитарной массы для инфузий [7]. Цитрат фосфат декстрозный антикоагулянт (CPD) также может быть использован, однако следует принимать во внимание, что по сравнению с ACD-A он на 10 % менее эффективен;

6) BD Vacutainer 6,0 мл с раствором ACD - B: (Тринатрия цитрат (2.20 мг/мл), лимонная кислота (0.80 мг/мл), декстроза (2.45 мг/мл), сорбат калия (0.033 мг/мл);

7) 3,5мл шприц-пробирки VACUETTE premium с антикоагулянтом СТАД (цитрат натрия (0.105 М), теофиллин, аденозин и дипиридамол. Три последние вещества предотвращают активацию тромбоцитов за счет повышения концентрации ЦАМФ (циклоаденозинмонофосфата), что препятствует как агрегации тромбоцитов, так и высвобождению БАВ, например, тромбоцитарных факторов свертывания. «Стабилизация» тромбоцитов за счет СТАД предотвращает искусственное высвобождение тромбоцитарных факторов в плазму

[4, 11].

Подсчет количества тромбоцитов и других форменных элементов крови осуществлялся на профессиональном анализаторе «Micros 60 OT» (Horiba ABX) непосредственно после каждого этапа эксперимента и для каждого антикоагулянта.

Оценку гомогенности ОТП производили:

- визуально;

- под оптическим микроскопом «BA410E Motic China Group».

При работе с кровью руководствовались положениями Инструкции о порядке предоперационной заготовки аутологичной крови и ее компонентов, утвержденной приказом Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 03.09.2012 № 981. Все пациенты предоставляли данные обследования крови на ВИЧ, ВГВ, ВГС, сифилис. От каждого спортсмена было получено информированное согласие. Каждая процедура приготовления PRP сопровождалась задокументированным проведением этих исследований.

Забор крови осуществлялся утром натощак из кубитальной вены после двойной обработки антисептиком «Септоцид-Р плюс» в условиях специального кабинета при постоянной температуре окружающей среды 21-24°C. Температурный режим забора крови для приготовления ОТП был определен согласно рекомендациям AABB (American Association of Blood Banks, 2012) [4]. Одновременно с опытными исследованиями проводился общий анализ крови для исключения лейкоцитоза (менее 9х109/л) и определения исходного уровня тромбоцитов (не менее 150х109/л). За две недели до забора крови был исключен прием антикоагуляционных и/или антитромботических препаратов (например, аспирина и гепарина), а также нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВС), чтобы не были нарушены агрегационные свойства элементов крови.

Результаты и обсуждение

Объем забираемой крови в среднем составлял 20-35 мл для каждого из выбранных антикоагулянтов, что необходимо для получения 2,0 мл конечного продукта. Одна доза для инъекций - 2,0 мл - тот объем ОТП, чаще всего используемый для локальной инъекционной терапии травм и заболеваний опорно-двигательного аппарата [1, 7].

После первого центрифугирования (250-400G, 5-8 минут) инъекционным шприцом 5,0 мл «Луер» с иглой 22 G, отступая 2-3 мм от слоя эритроцитов, осуществлялся забор плазмы в шприц-пробирку 8,0 мл без антикоагулянта. Попадание эритроцитов нежелательно, т.к. они при повторном центрифугировании адсорбируют на своей поверхности около 20 % тромбоцитов, образуя плохо дезагрегируемые гранулы [14]. Далее переходили ко второму этапу центрифугирования (2100 G 15 минут), после которого производили ресуспендирование тромбоцитарно-фибринового сгустка двумя (2-я) миллилитрами плазмы (остальную часть удаляли) до гомогенного состояния. При этом нами рассмотрены три метода ресуспендирования [14].

Ручной метод, предложенный R. Dhurat, заключаюется в аккуратном встряхивании и перемешивании оставшейся плазмы и осадка до гомогенного состояния [5].

Автоматический метод заключается во встряхивании и перемешивании оставшейся плазмы с помощью термошейкера для пробирок «Biosan PST-60 HL plus» при 37°С и 700 об/мин 30 минут до гомогенного состояния.

Предложенный нами ручной метод ресуспендирования заключается в заборе плазмы в количестве 2,0 мл в шприц и повторном струйном выпускания ее по стенкам пробирки в осадок до исчезновения видимых глазом сгустков, но без образования пены, т.к. при вспенивании основная часть тромбоцитов переходит из жидкой части плазмы в пену, образуя конгломерат, который длительно не оседает обратно. Использование инъекционного шприца 2,0 мл обусловлено тем, что его диаметр позволяет проходить в пробирку размером 16/100 мм (используется при втором центрифугировании независимо от типа антикоагулянта). Производили замену иглы шприца на 20 G, т.к. при меньшем диаметре иглы возникала вероятность обтурации иглы сгустками или образования пены, как следствие турбулентного тока плазмы из шприца в пробирку и обратно. Некоторые авторы (Lippi G, Salvagno G. и др.) не рекомендуют использовать иглы с малым диаметром ввиду возможного негативного влияния на мембраны тромбоцитов. Авторы в своих исследованиях пропускали ОТП, помеченную моноклональными антителами CD62P, через иглы диаметром больше 30 G и меньше [14, 15]. Часть ОТП оставляли в пробирке и использовали для контроля. Качественные и количественные показатели тромбоцитов оценивали на анализаторе FC-500 cytometer (Beckman Coulter). Не было выявлено статистически значимых различий (повреждений мембран тромбоцитов) в контрольной и опытной пробах.

Для гепарина лития, 3,2 % цитрата натрия и ACD - B не удалось достичь гомогенного состояния плазмы при ресуспендировании осадка после второго центрифугирования ни одним из вышеописанных способов: в плазме оставались видимые глазом сгустки. Можно предположить, что натрия цитрат связывает ионы кальция в мощный хелатный комплекс [5], что в дальнейшем делает невозможным их участие в процессах активации мембран тромбоцитов и, как следствие, дегрануляции а-гранул.

Для антикоагулянтов К3ЭДТА, СТАД и ACD - A после повторного центрифугирования автоматический способ ресуспендирования с помощью термошейкера для пробирок «Biosan PST-60 HL plus» и ручной метод [14] были не эффективны, однако удалось достичь визуально гомогенного состояния плазмы, с концентрацией тромбоцитов более 1000х109/л, после ресуспендирования по предложенной нами и описанной выше методике. Отсутствие сгустков было проверено и подтверждено на оптическом микроскопе BA410E Motic после предварительного окрашивания по Романовскому-Гимзе.

Оптимальные режимы, при которых возможно получение 2,0 мл ОТП, соответствовали критериям: минимальный объем забираемой крови (20 мл для К3ЭДТА, 21 мл для СТАД и 35 мл для ACD - А), минимальное время центрифугирования и наименьшее относительное центробежное ускорение (ОЦУ). Было проведено по три серии опытов для каждого параметра и антикоагулянта. Результаты опыта представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Комплексная характеристика параметров центрифугирования для антикоагулянтов К3ЭДТА, СТАД и АСБ-А

Относительное центробежное ускорение в G АСБ-А СТАД К3ЭДТА

е и & ^ В иц ро тб к % ео * £ ет - 7—1 И о р Л и интре е це 8 - 1-4 елсо о с 3 м м е б О , л к ^ § о м 1 5, ™ Ё 21 обм ео ир га й от & 8 1 ^ Ф § ин К о & 9 и со ц о и & - I туин и м 5 1 ад о 0 1 2 е 1 И о р £ у и ирнте е ц е - 2 л сл 0 1 1 ц о б м о р т е, 1 И 0 р £ у и ирнте е ц е - 1 д ей в о р £ у и ирнте е ц 0 и 1 1 е л с о С 3 м л с м е ^ б О и1 § 1 ю 3 1 ти ад & о ° 2 Ю СЧ | ер К К 3 Л § § £ * Ф X К V ро % £ ес д- о V с? ад 0 0 1 2 е ин § к ри к § £ £ и р рнт е ц е - 2 ол 8 о # а к £ ти я о ео = * ? & 1т е л с о с л и 0 р 1 # и итрне е це 2 - 1 елс о с 1 ! м е б О И И № и0 м1 ю й ^ £ ад а 0о 0б ^ 8 2о е рт к ь 3 £ га Б О ей & V ^ Я ^ ей ¡3 £ о нс £ ° <ь> а -н 2- н е и £ § д ^ £ р0 н1 е2 ц е - 2

250g -8 мин. 634±14 1,4 9±3 1288±34 - - - - 600±25 1,1 10±2 1399±38

300g -7 мин. 459±19 1,4 11±5 1276±41 - - - - 589±19 1,2 12±4 1240±29

300g -8 мин. - - - - 329±23 0,8 12±5 1250±3 3 - - - -

350g -6 мин. 368±17 1,4 7±2 1285±27 - - - - 445±15 1,2 11±3 1307±43

350g -7 мин. - - - - 348±27 0,7 16±5 1176±3 1 - - - -

400g -5 мин. 466±21 1,2 7±2 928±32 - - - - 653±24 1,2 10±3 1500±34

Из таблицы 1 видно, что для антикоагулянта К3ЭДТА получение ОТП возможно на всех предложенных режимах. Оптимальным ОЦУ для первого центрифугирования является 400G 5 минут. Для антикоагулянта АСБ - А на режиме 400G 5 минут не удалось достичь концентрации тромбоцитов 1000х109/л, т.е. получить ОТП. Режимы 250G 8 минут, 300G 7 минут и 350G 6 минут соответствуют

заявленным критериям. Оптимальные режимы для СТАД: на первом этапе - 300G 8 минут и 350G 7 минут, на втором - 2100G 15 минут.

Полученные данные в отношении антикоагулянтов показывают, что К3ЭДТА имел значительно большие ингибирующие эффекты на свертывание и агрегацию тромбоцитов, чем ACD - A и СТАД, что в результате приводит к более высокой концентрации тромбоцитов в конечном продукте при меньшем объеме забираемой крови.

Введение ОТП осуществлялось под ультразвуковым контролем. Непосредственно перед введением производили активацию тромбоцитов 2 % раствором хлорида кальция 0,1 мл на 2,0 мл ОТП. PRP-терапия (при внесуставном введении) является достаточно болезненной процедурой для пациента, а использование анестетиков и их влияние на функцию и структуру тромбоцитов изучено недостаточно. Так, Bausset O. еt all., провели исследования влияния лидокаина на тромбоциты и пришли к выводу о негативном воздействии на агрегационные и некоторые другие свойства [15]. Поэтому локальные анестетики нами не использовались.

Оценивали болевой синдром от введения плазмы по визуальной аналоговой шкале боли - ВАШ (VAS). Данные представлены в таблице 2, где были указаны: выраженность боли, место введения и тип антикоагулянта, используемый при приготовлении ОТП.

Таблица 2 - Среднеарифметическое значение субъективного ощущения боли в момент введения ОТП по шкале ВАШ_

Антикоагулянт для ОТП Среднеарифметическое значение ВАШ

при внутрисуставном введении при локальном (внесуставном) введении

ACD-A (15 пациентов) 2,1 6,5

К3ЭДТА (10 пациентов) 5,6 8,4

СТАД (7 пациентов) 1,9 6,8

Из таблицы 2 видно, что боль при введении обогащенной тромбоцитами плазмы, приготовленной с использованием антикоагулянта ACD-A и СТАД, была достоверно значительно ниже, чем при введении обогащенной тромбоцитами плазмы, приготовленной с использованием антикоагулянта К3ЭДТА, как для внутрисуставного введения, так и при локальной инъекционной терапии. Полагаем, что это можно объяснить раздражающим действием 3-х замещенной калиевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты на ткани организма.

Заключение

ACD-A в качестве антикоагулянта для приготовления ОТП наиболее предпочтителен. Болевая реакция при введении плазмы на его основе значительно меньше, чем при использовании К3ЭДТА, а стоимость шприц-пробирок с ACD-A значительно ниже, чем СТАД. ACD-A оптимально поддерживает метаболизм тромбоцитов и ингибирует их агрегацию обратимо, не повреждая клеточной

мембраны; связывает кальций крови, не нарушая соотношения форменных элементов и плазменных факторов свертывания. Именно этот антикоагулянт используется в банках крови для хранения тромбоцитарной массы для инфузий.

Вывод:

Актуальными параметрами для получение гомогенной ОТП ручным способом из малого объема крови являются:

- двухэтапное центрифугирование;

- оптимальное количество вакуумных шприц-пробирок с антикоагулянтом ACD-A, СТАД или К3ЭДТА. Так, для получения 2,0 мл конечной плазмы необходимо 35 мл крови (пять шприц-пробирок) для антикоагулянта ACD-A, 20 мл крови (пять шприц-пробирок) для К3ЭДТА и 21 мл крови (семь шприц-пробирок) для СТАД;

- ресуспендирование осадка, которое целесообразно выполнять с помощью инъекционного шприца 2,0 мл с заменой иглы 23 G на 20 G.

Для всесторонней оценки эффективности использования антикоагулянтов и плазмы в целом целесообразны дальнейшие клинико-экспериментальные исследования.

Список использованных источников

1. Отечественный и зарубежный опыт применения PRP-терапии в медицине и спортивной практике (обзор литературы) / Г.М. Загородный [и др.] // Прикладная спортивная наука. - 2017. -№ 1(5). - С. 83-91.

2. Mlynarek, R.A. Platelet-Rich Plasma (PRP) in Orthopedic Sports Medicine / R.A. Mlynarek, A.W. Kuhn, A. Bedi // Am J Orthop (Belle Mead NJ). - 2016. - N 45(5). - Р. 290-326.

3. Marx, R. Platelet-reach plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP? / R. Marx / / Implant dentistry. - Vol. 10, N 4. - 2001. - Р. 225-228.

4. Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma Based Coagulation Assays and Molecular Hemostasis Assays; Approved Guideline [Electronic resource] / Dorothy M. Adcock [et al.]. - 5 th ed. // Clinical and Laboratory Standards Institute. - 2018. -Vol. 28, N 5. - Mode of access: http://www.renam.ru/citrat-natriya-vybor-koncentracii- 3-2-ili-3-8.

5. Dhurat, R. Principles and Methods of Preparation of Platelet-Rich Plasma: A Review and Author's Perspective / R. Dhurat, M.S. Sukesh // J Cutan Aesthet Surg. - 2014. - N 7(4). - Р. 189-197.

6. Чазов, Е.И. Антикоагулянты и фибринолитические средства / Е.И. Чазов, К.М. Лакин // Фармакология и токсикология. - 1981. -№ 4. - С. 484-493.

7. Организация преаналитического этапа при централизации лабораторных исследований / А.А. Кишкун [и др.] // Реальные клинико-диагностические лабораторные услуги: степень соответствия стандартам лабораторной медицины, качество, себестоимость и цена: Общерос. науч.-практ. конф., Москва, 2-4 окт. 2012 г. - Режим

доступа: http: / / www.transfusion.ru / 2016/08-31-2.pdf. - Дата доступа: 01.10.2020.

8. Fadadu, P. Review of concentration yields in commercially available platelet-rich plasma (PRP) systems: a call for PRP standardization Reg Anesth Pain Med / Р. Fadadu, А. Mazzola. - 2019. Apr 16 PMID: 30992411.

9. Ahnadi, Ch. Assessment of platelet activation in several different anticoagulants by the Advia 120 Hematology System, fluorescence flow cytometry, and electron microscopy / Ch. Ahnadi, Е. Chapman, М. Lépine. - 2003. - № 90(5). - Р. 940-948.

10. Zeiler, T. The effect of ASA on platelet activation during apheresis and on in-vitro properties of stored platelet concentrates / Т. Zeiler, D. Gritzka // Transfusion. - 2004. - N 44(9). - Р. 1300-1305.

11. Aizawa, H.A Comparative Study of The Effects of Anticoagulants on Pure Platelet-Rich Plasma Quality and Potency / Н. Aizawa, Н. Kawabata, А. Sato // Biomedicines. - 2020. - Vol. 25, N 8(3). - Р. 42.

12. Callan, M. Effects of anticoagulant on pH, ionized calcium concentration, and agonist-induced platelet aggregation in canine platelet-rich plasma / М. Callan, F. Shofer, L. James // Am J Vet Res. - 2009. -N 70(4). - Р. 472-477.

13. Optimized preparation method of platelet-concentrated plasma and noncoagulating platelet-derived factor concentrates: maximization of platelet concentration and removal of fibrinogen / J. Araki [et al.] // Tissue Eng Part C Methods. - 2012. - Vol. 18(3). - Р. 176-185.

14. Influence of the needle bore size on platelet count and routine coagulation testing / G. Lippi [et al.] // Blood Coagul Fibrinolysis. -2006. - N 17(7). - Р. 557-561.

15. Impact of local anaesthetics and needle calibres used for painless PRP injections on platelet functionality / О. Bausset [et al.] // Muscles Ligaments Tendons. - 2014. - N 4(1). - Р. 18-23.

13.11.2020