CC BY
53УДК 617.3
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ТИПА РОТОРА ЛАБОРАТОРНОЙ ЦЕНТРИФУГИ НА КОНЦЕНТРАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ПЛАЗМЫ, ОБОГАЩЕННОЙ ТРОМБОЦИТАМИ,
РУЧНЫМ СПОСОБОМ В ПОЛИКЛИНИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ
А. С. Ясюкевич, Н. П. Гулевич,
А. А. Тихоненков, А. В. Ковкова, А. А. Пучко,
Республиканский научно-практический центр спорта
Аннотация
В данной статье автором описано и практически доказано влияние типа ротора лабораторной центрифуги на параметры и характеристики центрифугирования при получении плазмы обогащенной тромбоцитами в лабораторных условиях.. Даны определения таким понятиям, как: скорость осаждения, угловая скорость, фактор разделения и относительное центробежное ускорение, а также приведены основные формулы и номограммы для расчета параметров центрифугирования.
STUDY OF THE EFFECT OF THE TYPE OF ROTOR LABORATORY CENTRIFUGE ON THE CONCENTRATION OF PLATELETS IN BLOOD PLASMA WHILE RECEIVING A PLATELET-RICH PLASMA MANUALLY
IN OUTPATIENT CONDITIONS
Abstract
In this article the author describes and practically proves the influence of the rotor type of laboratory centrifuge on the parameters and characteristics of centrifugation in the preparation of plasma enriched with platelets in a laboratory. The definitions of such concepts as: deposition rate, angular velocity, separation factor and relative centrifugal acceleration, as well as the basic formulas and nomograms for calculating the parameters of centrifugation.
Введение
Центрифугирование - способ разделения неоднородных, дисперсных жидких систем на фракции по плотности под действием центробежных сил [1]. Центрифугирование осуществляют в центрифугах, принцип работы которых основан на создании центробежной силы, увеличивающей скорость разделения компонентов смеси по сравнению со скоростью их разделения только под влиянием силы тяжести. Различают два принципиальных вида лабораторных центрифуг: с горизонтальными роторами и угловыми. Центрифуги, имеющие горизонтальные роторы (бакет-роторы, орбитальные), снабжены подвесными держателями в виде специальных пробирок (патронов) (рисунки 1, 2) или стаканов (контейнеров) (рисунки 3, 4, 5). Каждый стакан может иметь широкий диапазон сменных адаптеров (штативов, вставок) для пробирок и пробирок-шприцов
различных размеров, что значительно расширяет возможность использования каждого ротора.
Рисунок 1 - Горизонтальный ротор (бакет-ротор) на 12 пробирок диаметром до 18 мм (центрифуга ЬМС-3000, ВюБап)
Рисунок 2 - Горизонтальный ротор (бакет-ротор) на 12 пробирок диаметром до 15 мм, (центрифуга ЬМС-3000, ВюБап)
Рисунок 3 - Горизонтальный ротор, 4 стакана с крышками, в каждом стакане
по 6 вакуумных пробирок Уасие^е
Рисунок 4 - Два стакана горизонтального ротора, 2 адаптера (штатива),
7 вакуумных пробирок Vacuette
Рисунок 5 - Горизонтальный ротор, 8 стаканов, в каждом стакане 7
пробирок Vacuette
В горизонтальные роторы пробирки устанавливаются вертикально в патроны или в контейнеры. При центрифугировании они переходят в горизонтальное положение под действием центробежной силы.
В угловых роторах (рисунки 7, 8, 9) центрифужные пробирки находятся под определенным углом к оси вращения (от 20° до 45°).
Рисунок 7 - Угловой ротор с крышкой
Рисунок 8 - Угловой диск-ротор на 8 мест
Универсальные центрифуги имеют специальные роторы: для гема-токритных капилляров, культуральных планшет, 96-луночных планшет, фильтрующих планшет, цитологических держателей. Практически к пробирке любого размера можно подобрать держатель, адаптер, вставку и необходимые условия центрифугирования [2].
Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в центробежном поле. В центробежном поле частицы, имеющие разную плотность, форму или размеры, осаждаются с разной скоростью. Поэтому при центрифугировании крови первым слоем оседают эритроциты, затем на них - лейкоциты, после которых начинается процесс осаждения тромбоцитов [1].
Скорость осаждения, или седиментации, зависит от центробежного ускорения прямо пропорционального угловой скорости ротора
рад/с) и расстоянию между частицей и осью вращения (г, см): g = v2xr. Поскольку один оборот ротора составляет 2п радиан, то угловую скорость можно записать так: v=pxn/60, где п - скорость в оборотах в минуту, п - константа, выражающая отношение длины окружности к длине ее диаметра. Угловая скорость - характеристика скорости вращения тела, измеряется обычно в радианах в секунду, полный оборот
(360°) составляет 2п радиан. Центробежное ускорение тогда будет равно: g=p2xrxn2/900.
Центробежное ускорение обычно выражается в единицах g (ускорение свободного падения, равное 980 м/с2) и называется относительным центробежным ускорением (ОЦУ), т. е. ОЦУ=g/980 или ОЦУ = 1,11х10-5хгхп2.
Относительное ускорение центрифуги (гс^ задается как кратное от ускорения свободного падения Оно является безразмерной величиной и служит для сравнения производительности разделения и осаждения. Относительное ускорение центрифуги (гс^ зависит от частоты вращения и радиуса центрифугирования.
На основании данного уравнения Доулом и Котциасом была составлена номограмма, выражающая зависимость ОЦУ от скорости вращения ротора (п) и радиуса (г). Радиус измеряется в сантиметрах от оси вращения ротора до середины столбика жидкости в пробирке, когда держатель находится в положении центрифугирования. Для определения ОЦУ необходимо с помощью линейки совместить значения радиуса и числа оборотов на соответствующих шкалах номограммы и на шкале центробежного ускорения установить значение § [1].
r - радиус ротора в см, n - скорость вращения ротора в числе оборотов в минуту, RCF (ОЦУ) - относительная центробежная сила в g RCF (от англ. relative centrifuge force) - относительная сила центрифугирования
Рисунок 9 - Номограмма для расчета величины g по радиусу и скорости (об/мин) вращения ротора
В СССР для характеристики разделительной способности центрифуг принят термин «фактор разделения Fr», который выражается отношением сил центробежного поля, создаваемого центрифугой, к отношению сил поля тяжести (ГОСТ 16887-71). Этим термином пользуются и в настоящее время.
Понятия «фактор разделения» и «относительная центробежная сила» равноценны, и их значения могут быть подсчитаны по одной и той же номограмме [1].
PRP-терапия - лечение с помощью аутологичной плазмы крови, обогащенной тромбоцитами. Это направление регенеративной медицины широко используется в общеклинической практике: в травматологии и ортопедии для лечения травм и заболеваний опорно-двигательного аппарата [3-5], в хирургии - для лечения раневых повреждений [6], ожоговых ран [7], трофических язв [8, 9], а также в косметической хирургии [10] и стоматологии [11]. Данная методика не является допингом [12] и разрешена к использованию ВАДА (Всемирное антидопинговое агентство), поэтому в спортивной медицине получила наибольшее распространение [13-21]. PRP - Platelet Rich Plasma - официальное название во всем мире [22]. Обогащенной тромбоцитами плазмой называют плазму, если концентрация тромбоцитов в ней равна 1 000 000/мкл.
Целью исследования является определение опытным путем влияния типа ротора лабораторной центрифуги на концентрацию тромбоцитов в плазме крови при получении обогащенной тромбоцитами плазмы ручным способом в поликлинических условиях.
Материалы и методы. Существуют два принципиально разных вида центрифуг [1] с горизонтальным ротором, пробирки в котором устанавливаются вертикально в патроны или в контейнеры и при центрифугировании они переходят в горизонтальное положение под действием центробежной силы (мы использовали лабораторную центрифугу Thermo IEC centra CL3R с радиусом центрифугирования 14 см); и с угловым ротором (в нашем случае - FENOX MC-24), где пробирки находятся под определенным углом к оси вращения (от 20° до 45°). Мы использовали набор вакуумных шприц-пробирок BD Vacutainer с крышкой Hemogard: 8,0 мл без антикоагулянта; 8,5 мл с раствором ACD - A: тринатрия цитрат (2,59 мг/мл), лимонная кислота (0,94 мг/мл), декстроза (2,88 мг/мл), сорбат калия (0,024 мг/мл);
Забор крови производился у одного и того же человека утром натощак из кубитальной вены после двойной обработки антисептиком «Сеп-тоцид-Р плюс» в условиях специального кабинета при постоянной температуре окружающей среды 21-24°C. Одновременно с опытными исследованиями проводился общий анализ крови для определения исходного уровня тромбоцитов. За две недели до забора крови был исключен прием антикоагуляционных и/или антитромботических препаратов (например, аспирина и гепарина), а также нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВС), чтобы не были нарушены агрегационные свойства элементов крови.
Подсчет количества тромбоцитов и других форменных элементов крови осуществлялся на профессиональном анализаторе «Micros 60 OT».
Результаты и обсуждение
Вначале нами использовалась лабораторная центрифуга с угловым ротором FENOX MC-24 (режимы: быстрый старт - быстрый финиш, быстрый старт - медленный финиш, медленный старт - быстрый финиш и медленный старт - медленный финиш) и набором пробирок 8,5 мл с раствором ACD - A. Общий анализ крови проводился перед каждой серией опытов, уровень тромбоцитов составил от 194х109/л до 199х109/л (в среднем - 197х109/л).
Целью данного этапа являлось:
1) получение плазмы крови с концентрацией тромбоцитов 1 млн в мкл;
2) при невозможности достижения заданной концентрации тромбоцитов - получение промежуточного продукта (Araki J1 et all., [23]), т. е. плазмы крови, концентрация тромбоцитов в которой превышала бы таковую в цельной крови, а ее объем был оптимален для получения 2,0 мл конечного продукта.
На основании анализа литературных данных [3-5, 8, 24-27] мы использовали режимы центрифугирования: 200 g (1000 об/мин), 250 g (1150 об/мин), 300 g (1250 об/мин), 350 g (1350 об/мин), 400 g (1450 об/мин), 780 g (2000 об/мин). Каждый с экспозицией: 5, 8, 10, 12 и 15 минут. Итого - 120 вариантов центрифугирования. Ни в одном из них мы не получили концентрацию тромбоцитов, превышающую таковую в общем анализе крови. Максимальная концентрация тромбоцитов на оптимальных режимах составила 128±14х109/л, при забираемом объеме 1,5 мл. На режимах 200 g - 5, 8, 10 и 12 минут, 250 g - 5,8 и 10 минут, 300 g - 5 и 8 минут, 350 g - 5 минут, 400 g - 5 минут с быстрым финишем, отсутствовала четкая граница разделения, так как эритроциты по инерции смещались обратно в слой плазмы за счет резкой остановки ротора.
Далее нами была использована лабораторная центрифуга Thermo IEC centra CL3R с горизонтальным ротором и набор пробирок 8,5 мл с раствором ACD - A. Условия забора крови те же. На некоторых режимах удалось достичь концентрирования тромбоцитов, оптимальные из них были систематизированы в таблице 1. На данных режимах при включении опции «быстрый финиш» пропадала граница разделения, так как эритроциты по инерции смещались обратно в слой плазмы за счет резкой остановки ротора.
Общий анализ крови проводился перед каждой серией опытов, уровень тромбоцитов составил от 194х109/л до 199х109/л (в среднем -197х109/л).
Данные из оптимальных режимов центрифугирования были занесены в таблицу 1, где отмечались: объем забираемой плазмы, среднее значение содержания тромбоцитов (на каждый режим было поставлено по пять проб).
Таблица 1 - Влияние параметров центрифугирования лабораторной центрифуги Thermo IEC centra CL3R с горизонтальным ротором и радиусом центрифугирования
14 см на концентрацию тромбоцитов после однок ратного центрифугирования
Относительное центробежное ускорение в G (первое центрифугирование) Концентрация тромбоцитов в забираемой части плазмы, 109/л Объем забираемой плазмы, мл
250 g - 8 минут 634±14 1,4
300 g - 7 минут 459±19 1,4
350 g - 6 минут 368±17 1,4
400 g - 5 минут 466±21 1,2
Как видно из таблицы 1, прослеживается определенная закономерность между ОЦУ, временем центрифугирования, объемом забираемой плазмы и концентрацией тромбоцитов в ней. Нарушение линейной зависимости прослеживается на режимах 200 g - 12 минут и 200 g - 15 минут, что может быть объяснено погрешностями ручного забора плазмы. Не удалось достичь концентрации тромбоцитов 1000х109/л после первого центрифугирования с помощью центрифуги с горизонтальным ротором, поэтому возникает необходимость в повторном центрифугировании с целью концентрации тромбоцитов в определенном объеме плазмы.
Критерии отбора режима для повторного центрифугирования на центрифуге Thermo IEC centra CL3R: четкая граница разделения (появлялась при объеме плазмы 0,6 мл и более), примесь эритроцитов не более 0,02х1012/л, увеличение концентрации тромбоцитов в полтора и более раза, в сравнении с уровнем в общем анализе крови. Режимы 250 g -8 минут, 300 g - 7 минут, 350 g - 6 минут соответствуют заявленным критериям и отобраны для повторного центрифугирования. Для каждого режима был использован набор из 5 пробирок 8,5 мл с раствором ACD - A.
Литературные данные относительно режима повторного центрифугирования весьма противоречивы [25, 28-30], поэтому режимы для второго центрифугирования подбирались нами путем постепенного увеличения ОЦУ и экспозиции. Нами не было найдено литературных данных о повторном центрифугировании на центрифугах с угловым ротором. Slichter S.J., и Harker L.A. определили опытным путем, что при относительном центробежном ускорении 300 g и экспозиции более 20 минут жизнеспособность тромбоцитов значительно снижалась [26], поэтому время центрифугирования было ограничено 20 минутами.
После первого центрифугирования был произведен забор плазмы из пяти пробирок по 1,4 мл (итого 7 мл для каждого режима) инъекционным шприцем 10,0 мл, перенесены в шприц-пробирку BD Vacutainer с крышкой Hemogard - 8,0 мл без антикоагулянта. После второго центрифугирования удалось получить 2,0 мл обогащенной тромбоцитами плазмы и достичь ее гомогенного состояния.
По результатам проведенных опытов было выявлено, что оптимальным является режим 2100G 15 минут. Конечные данные были занесены в таблицу 2.
Таблица 2 - Влияние параметров центрифугирования лабораторной центрифуги Thermo IEC centra CL3R с горизонтальным ротором и радиусом центрифугирования 14 см на концентрацию тромбоцитов после первого и повторного центрифугирования
Относительное центробежное ускорение в G Концентрация тромбоцитов в забираемой части плазмы, 109/л Объем забираемой плазмы, мл 2-е центрифугирование 2100g 15 минут, надосадоч-ная часть, концентрация тромбоцитов, 109/л 2-е центрифугирование 2100g 15 минут, концентрация тромбоцитов, 109/л после дезагрегации
250g - 8 минут, первое центрифугирование 634±14 1,4 9±3 1288±34
300g - 7 минут, первое центрифугирование 459±19 1,4 11±5 1276±41
350g - 6 минут, первое центрифугирование 368±17 1,4 7±2 1285±27
Как видно из таблицы 2, получение ОТП возможно на режимах первого центрифугирования 250 g - 8 минут, 300 g - 7 минут, 350 g - 6 минут и в режиме повторного центрифугирования 2100 g - 15 минут.
Выводы
Получить ОТП, т. е. достичь концентрации тромбоцитов 1000х 109/л, ручным способом при однократном центрифугировании, вне зависимости от вида ротора, не представляется возможным. Использование лабораторной центрифуги с горизонтальным ротором и режима «медленный старт - медленный финиш» на первом этапе центрифугирования является предпочтительным. Данный тип центрифуг более эффективен, так как объем забираемой крови (8,5 мл пробирка минус 1,5 мл антикоагулянта) для получения 2,0 мл конечного продукта меньше (35 мл против 84 мл при центрифугировании на центрифугах с угловым ротором). Использование лабораторной центрифуги с угловым ротором является возможным для второго этапа центрифугирования. Опция центрифуги «быстрый финиш» допустима для второго этапа центрифугирования.
Список использованных источников:
1. «Типы роторов» Студопедия 2014-11-16. Режим доступа: http: // studopedia.su / 12_31855_tipi-rotorov.html.
2. «Аппаратура для разделения жидких неоднородных систем методом центрифугирования», Medical-Enc.ru 2007-2017. - Режим доступа: http: // www.medical-enc.ru/oborudovanie/apparatura-dlya-centrifugirovaniya. shtml.
3. Novosti Khirurgii. 2012; Vol 20 (5): 77-81 Platelet-enriched plasma in treatment of posttraumatic chondropathy of the knee joint A. N. Mastykau, V. P. Deykalo, K. B. Balaboshka
4. Сочетанное применение обогащенной тромбоцитами аутоплазмы и биокомпозиционного материала Коллапан в комплексном лечении больных с длительно несрастающимися переломами и ложными суставами длинных костей конечностей / Г. А. Кесян [и др.] / / Вестник травматологии и ортопедии им. Н. Н. Приорова. - 2011. - № 2. - С. 26-32.
5. Platelet-rich plasma injection graft for musculoskeletal injures: a review / S. Sampson [et al.] // Cur Rev Musculoskelet Med. - 2008. -Vol. 1. -P. 165-174.
6. A prospective, randomized, controlled trial of autologous platelet-rich plasma gel for the treatment of diabetic foot ulcers / V. R. Driver [et a!.] // Ostomy Wound Manage. - 2006. - Vol. 52, № 6. - Р. 68-70, 72, 74 passim.
7. Platelet-Rich Plasma combined with skin substitute for chronic wound healing : a case report / R. L. Knox [et al.] // J. of the American Society of Extra-Corporeal Technology. - 2006. - Vol. 38. - P. 260-264.
8. Просянникова, И. В. Аутологичная, богатая тромбоцитами плазма в лечении язвенных поражений кожи нижних конечностей : дис. ... канд. мед. наук / И. В. Просянникова. - ФГУ «Учебно-научный центр» УДП РФ. - 2014. - С. 5-7, 24.
9. Effects of platelet concentrate and a bone plug on the healing of hamstring tendons in a bone tunnel / M. Orrego [et al.] // Arthroscopy. -2008. - Vol. 24. - P. 1373-1380.
10. Use autologous platelet-rich plasma and autolodous platelet-poor plasma in cosmetic surgery / D. Man [et al.] // Plastic&Reconctructive Surgery. - 2001. - Vol. 107, № 1. - P. 239-249.
11. Carlson, N. E. Platelet-rich plasma. Clinical application in den-tisty / N. E. Carlson, R. B. Roach // Dentistry&Medicine. - 2002. -Vol. 133. - P. 1383-1386.
12. WADA 2011 Prohibited List Now Published. - Access mode: https:/ /www.wada-ama.org/en/media/news/2010-09/wada-2011-prohib-ited-list-now-published.
13. Mishra, A. Treatment of chronic elbow tendinosis with buffered platelet rich plasma / A. Mishra, T. Pavelko // Am J Sports Med. - 2006. -Vol. 34. - P. 1774-1778.
14. Platelet-rich Plasma: Current Concepts and Application in Sports Medicine / P. Hall Michael [et al.] // J Am Acad Orthop Surg. - 2009. -Vol. 17. - P. 602-608.
15. Platelet plasma rich products in musculoskeletal medicine: any av-idance? Maffulli N, Del Buonot. Surgeon. - 2012. - Vol. 10 (3). - P. 148-150.
16. Creaney, L. Growth factor delivery methods in the management of sports injuries: The state of play / L. Creaney, B. Hamilton // Br J Sports Med. - 2008 - Vol. 42. - P. 314-320.
17. Use of autologous platelet-rich plasma to treat muscle strain injuries / J. M. Hammond [et al.] // Am J Sports Med. - 2009. - Vol. 37. -P. 1135-1142.
18. Mishra, A. Treatment of tendon and muscle using platelet-rich plasma / A. Mishra, J. Jr. Woodall, A. Vieira // Clin Sports Med. - 2009. -Vol. 28, № 1. - Р. 113-125.
19. Comparison of surgically repaired Achilles tendon tears using platelet-rich fibrin matrices / M. Sánchez. - Am J Sports Med, 2007. -P. 35:245-251.
20. Schneider, B. S. Neutrophil infiltration in exercise injured skeletal muscle / B. S. Schneider, P. M. Tiidus. - Sports Med 2007. - P. 37:837-856.
21. Can platelet rich plasma enhance tendon repair / de Mos M // A cell culture study. - Am J Sports Med, 2008. - P. 36:1171-1178.
22. История развития аутогемотерапии - Режим доступа: http://prp-rost.ru /news/ istoriya-razvitiya-autogemoterapii-/.
23. Optimized preparation method of platelet-concentrated plasma and noncoagulating platelet-derived factor / J. Araki [et al.].
24. Виргульти, А. Физиотерапия и реабилитация / А. Виргульти // Международный симпозиум по спортивной медицине. Минск, 06 апреля 2015 г. /medsport.by/sites/default/files/pdf/3_virgulti_minsk_ott_2015_ rus_0.pdf
25. Мария Халдина, канд. мед.наук, главный врач клиники «БиоМи Вита», Москва «Вестник трихологии» 03.04.2015 стр. 67-71 http://xn--80aefeaxzz9d.xn--p1ai/service/cosmetology/plng
26. Slichter, S. J. Preparation and storage of platelet concentrates. I. Factors influencing the harvest of viable platelets from whole blood / S. J. Slichter, L. A. Harker // Br J Haematol. - 1976 Nov; 34 (3). P. 395-402.
27. Influence of the needle bore size on platelet count and routine coagulation testing / G. Lippi [et al.]. // Blood Coagul Fibrinolysis. - 2006; 17 (7). - P. 557-561.
28. Кон, Е. Внутрисуставные инъекции богатой тромбоцитами плазмы в сравнении с препаратами гиалуроновой кислоты при лечении патологии хряща / Е. Кон, Б. Манделбаун, Р. Буда // The Journal of Arthroscopic and Related Surgery 2011.05.11. - P. 2-5 / http: // www.prplab.ru / docs / vnutrisustavnye - inekcii - bogatoy - trombocitami-plazmy.pdf.
29. Юрченко, М. Ю. Обзор оборудования и методик получения аутогенной обогащенной тромбоцитами плазмы в стоматологии / М. Ю. Юрченко, А. В. Шумский // Новое в стоматологии. - 2003. - № 7. -С. 46.
30. Влияние обогащенной тромбоцитами плазмы на жизнеспособность, скорость роста, морфо-фенотипические и секреторные особенности мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека /
B. Г. Богдан [и др.] // Экспериментальная хирургия. - № 2. - 2013. -
C. 21-28.
26.04.2019
