CC BY
84
Section 2. Biomedical science
Section 2. Biomedical science
Gorbacheva Svetlana Vasilievna, Zaporozhian State Medical University, Associate Professor, Department of Biochemistry and laboratory diagnostics
E-mail: swg18@yandex.ua
Influence of thiol antioxidants on state of neurons antioxidant system in conditions of glutathione system deprivation
Abstract: A decrease of thiols level in antioxidant system of neurons is the reason of early neurodestructive mechanisms development and non-coordination in transport system of nitrogen oxide. Glutathione synthesis deprivation by means ofbuthionine sulfoximine (BSO) introduction caused a formation of pathobiochemical reactions of oxidative and nitrosative stresses in cerebral tissues. Introduction of thiol containing drugs which are donors of thiol groups restricts negative influence on active forms of oxygen and nitrogen by means of cellular thiol redox state regeneration. Keywords: glutathione, buthionine sulfoximine, thiol-disulfide balance, oxidative stress.
Горбачева Светлана Васильевна, Запорожский государственный медицинский университет, доцент кафедры биохимии и лабораторной диагностики
E-mail: swg18@yandex.ua
Влияние тиоловых антиоксидантов на состояние антиоксидантной системы нейронов в условиях депривации глутатионовой системы
Аннотация: Депривация синтеза глутатиона путем введения бутионинсульфоксимина (BSO) вызывала формирование в тканях головного мозга патобиохимических реакций оксида-тивного и нирозативного стресса. Снижение уровня тиолов в антиоксидантной системе нейронов является причиной развития ранних нейродеструктивных механизмов и несогласованности в транспортной системе оксида азота. Введение тиол-содержащих препаратов, являющихся донорами тиоловых групп, ограничивает негативное воздействие на нейроны активных форм кислорода и азота путем восстановления тиолового редокс-статуса клетки.
Ключевые слова: глутатион, бутионинсульфоксимин, тиол-дисульфидное равновесие, ок-сидативный стресс.
Наиболее важную при развитии различных патологий в биологическом плане роль играют окислительно-восстановительные реакции, в ходе которых тиоловые группы легко окисляются с образованием дисульфидных группировок, и вновь регенерируют при их восстанови-
тельном расщеплении. Возникающая на основе этих превращений обратимая тиол-дисульфидная система (ТДС) имеет очень большое значение в регуляции окислительно-восстановительного равновесия в клетках и тканях организма [1, 178-180]. Система глутатиона представленная
36
Influence of thiol antioxidants on state of neurons antioxidant system in conditions of glutathione system deprivation
восстановленным (GSH) и окисленным (GSSG) глутатионом, а также ферментами его метаболизма: глутатионпероксидазой (GPO), глутати-онтрансферазой (GST) и глутатионредуктазой (GR). Она является одной из ведущих антиоксидантных систем в организме и играет ключевую роль при всех физиологических процессах клеток [2, 3-5]. В частности глутатион непосредственно, либо посредством ферментативных реакций, эффективно защищает клетки от свободных радикалов и других реактивных разновидностей кислорода, например, гидроксильного радикала, липид-пероксильного радикала, пероксинитри-та и перекиси водорода. Помимо этого глутатион принимает участие в функционировании глута-редоксин-зависимой системы, играющей важную роль в поддержании внутриклеточного редокс-гомеостаза [3, 255-260].
Восстановленный глутатион, из всех тиол-со-держащих компонентов клетки, является наиболее важным в поддержании внутриклеточного редокс-потенциала. Его значение определяется участием в регуляции редокс-зависимого сигна-линга и активности транскрипционных факторов, а также тем фактом, что он является внутриклеточным антиоксидантом, играя роль «ловушки» свободных радикалов, косубстратом в реакциях детоксикации пероксидов, катализируемых GPO и GST, и выступает в качестве агента, восстанавливающего окисленный глутаредоксин. Сохранение оптимального для клетки соотношения восстановленного глутатиона к окисленному — GSH/GSSG является важным условием для поддержания жизнеспособности клетки [4, 300-301].
Нашими предыдущими исследованиями на моделях in vitro и in vivo было показано значение смещения тиолового статуса в сторону окисленных форм в поддержании механизмов антиоксидантной защиты и выживания нейронов [5, 124-129; 6, 31-35].
Целью настоящего исследования явилось изучение состояния антиоксидантной системы в тканях головного мозга крыс с депривацией системы глутатиона и возможность модуляции возникающих нарушений препаратами, которые являются
донорами SH-групп — тиоцетама, тиотриазоли-на, ангиолина и а-липоевой кислоты.
Методы исследования
Исследования проводились на белых крысах линии Вистар массой 180-210 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Все экспериментальные процедуры и оперативные вмешательства осуществляли в соответствии с «Положением об использовании лабораторных животных в биомедицинских исследованиях». Депривацию глутатионовой системы моделировали путем введения бутионинсульфоксимина (BSO) — селективного ингибитора у-глутамилцистеин-синтазы (y-GCS) в дозе 4 ммоль/кг.
Все животные были распределенны на следующие экспериментальные группы: I — интактные, n=7; II — животные с введением BSO, n=7; III — животные с введением BSO и тиотриазоли-на (50 мг/кг), n=7; IV — животные с введением BSO и тиоцетама (125 мг/кг), n=7; V — животные с введением BSO и ангиолина (50 мг/кг), n=7; VI — животные с введением BSO и а-липоевой кислоты (50 мг/кг), n=7.
Для иммуноферментных и биохимических исследований использованы фрагменты, находящихся в области сенсо-моторной зоны коры головного мозга и гомогенизированные в жидком азоте. Цитозольную фракцию выделяли методом дифференциального центрифугирования (15 000 g) при температуре +4 оС на 0,15 М фосфатном буфере рН 7,8. Содержание нитротирозина определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием стандартного тест-набора «Nitrotirosine ELISA Kit» («HyCult biotechnology») в соответствии с прилагаемой к набору инструкции. Уровень SH-групп, активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы определяли спектрофотометрически [7; 355, 422-424]. Содержание окисленного и восстановленного глутатиона определяли флюорометрически [8, 45]. Состояние антиоксидантной системы оценивали по активности СОД, каталазы, показателям окислительной модификации белка. Определение активности СОД проводили по методике, описанной С. Чевари с соавторами [9, 679-680]. Активность каталазы
37
Section 2. Biomedical science
определяли спектрофотометрически по методу М. А. Королюк [10, 17-19]. Показатели окислительной модификации белка в тканях головного мозга по методу B. Halliwell [11, 264]. Результаты исследования обработаны с использованием статистического пакета лицензионной программы «STATISTICA® forWindows 6.0» (StatSoftInc., № AXXR712D833214FAN5), а также «Microsoft Excel 2010». Статистическую обработку проводили с применением t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна-Уитни. Для всех видов анализа статистически значимыми считали различия с уровнем значимости менее 0,05 (95%) [12, 287].
Результаты исследования
Результаты проведенных исследований указывают на то, что депривация глутатионового звена тиол-дисульфидной системы путем введения BSO вызывает нарушение синтеза глутатиона и разворачивание реакций оксидативного стресса. Торможение синтеза глутатиона в клетке проявлялось снижением уровня его восстановленной формы на 56,6% с параллельным повышением содержания дисульфида и нарушением соотношения GSH/GSSG (табл. 1), что выражалось и в снижении уровня общих SH-групп на 43,6%.
Смещение тиол-дисульфидного равновесия в сторону окисленных интермедиатов обуславливало нарушение функционирования антиоксидантных ферментов и накопление окислено модифицированных макромолекул, в первую очередь, белков. Так, активность СОД снижалась на 57,5%, каталазы — на 37,7%, что обуславливало повышение ранних (АФГ) и поздних (КФГ) маркеров повреждения белковых молекул на 52,8% и 2,4 раза соответственно (табл. 2). Окислительной модификации подвергались и ферменты, участвующие в метаболизме глутатиона. Так, активность GPO в тканях мозга животных с введением BSO была ниже на 17,1%, а GR — на 20,4% относительно показателей интактной группы. Введение изучаемых препаратов вызывало положительные эффекты в отношении как реактивации антиоксидантных ферментов, так и восстановления тиол-дисульфидного равновесия. Модуляция системы глутатиона, а также связанных с его обменом антиоксидантных ферментов — GPO и GR защищает мозг от активных форм О2, продуктов пероксидации и в определенной степени позволяет восстановить равновесие и улучшить редокс-регуляцию [13, 146-147].
Таблица 1. - Состояние системы глутатиона в головном мозге животных на 4 сутки введения BSO
Группа животных GSH, мкмоль/г белка GSSG, мкмоль/г белка SH-группы, ммоль/г белка GPO, мкмоль/(мг белка*мин) GR, мкмоль/(мг белка*мин)
Интактные животные 3,85 ± 0,05 0,15 ± 0,03 18,8 ± 1,22 72,5 ± 3,1 14,2 ± 1,3
Животные с введением BSO 1,67 ± 0,07 0,84 ± 0,04 10,6 ± 1,04 60,1 ± 2,8 11,3 ± 1,4
Животные с введением BSO + ангиолин 3,12 ± 0,03* 0,22 ± 0,03* 16,5 ± 1,13* 69,6 ± 2,4* 14,0 ± 1,1*
Животные с введением BSO + тиотриазолин 2,84 ± 0,06* 0,36 ± 0,05* 14,2 ± 0,96* 66,2 ± 2,6 13,6 ± 1,2
Животные с введением BSO + тиоцетам 2,89 ± 0,07* 0,45 ± 0,07* 14,8 ± 1,02* 65,7 ± 2,9 12,2 ± 1,2
Животные с введением BSO + а-липоевая кислота 2,33 ± 0,08* 0,77 ± 0,06* 13,2 ± 1,1* 65,1 ± 3,2 12,5 ± 1,5
Примечание: * — р<0,05 по отношению к группе с введением BSO
Повышение уровня окисленных низкомолекулярных тиолов приводит к нарушению транспортных функций оксида азота и усиливает
образование его цитотоксических дериватов — нитрозония, нитроксила и пероксинитрита, накопление которых дополнительно усиливают
38
Influence of thiol antioxidants on state of neurons antioxidant system in conditions of glutathione system deprivation
окисление тиоловых групп [13, 38-39]. Под- (на 80,3%) и накопление нитротирозина — глав-тверждением этих процессов является отмечен- ного маркера образования пероксинитрита и разное нами повышение активности NO-синтазы вития нитрозативного стресса на 93,0% (табл. 2). Таблица 2. - Состояние антиоксидантной системы и синтазы оксида азота в головном мозге животных на 4 сутки введения BSO
Группа животных СОД, у. е./(мг белка*мин) Каталаза, мкат/(мг белка*мин) Продукты ОМБ, у. е./г белка Нитроти- розин нмоль/г белка NO- синтаза, нмоль/г белка*мин
АФГ (270 нм) КФГ (363 нм)
Интактные животные 285,7 ± 12,3 7,7 ± 0,98 8,9 ± 0,74 6,7 ± 0,68 8,6 ± 0,73 14,2 ± 1,07
Животные с введением BSO 121,3 ± 10,3 4,8 ± 0,46 13,6 ± 1,4 16,4 ± 1,76 16,6 ± 1,32 25,6 ± 0,96
Животные с введением BSO + ангиолин 227,5 ± 9,8* 6,6 ± 0,55* 9,6 ± 0,85* 9,1 ± 0,84 10,2 ± 0,95* 16,1 ± 1,05*
Животные с введением BSO + тиотри-азолин 211,1 ± 11,1* 5,8 ± 0,63* 10,1 ± 1,1* 10,6 ± 0,93* 12,4 ± 1,03* 18,3 ± 0,84*
Животные с введением BSO + тиоцетам 217,3 ± 10,7* 6,0 ± 0,72* 10,8 ± 1,24* 10,4 ± 0,75* 12,7 ± 0,82* 18,7 ± 0,95*
Животные с введением BSO + а-липоевая кислота 194,6 ± 9,4* 5,2 ± 0,89 11,8 ± 1,51 13,6 ± 1,17* 13,3 ± 0,9* 20,5 ± 1,11
Примечание: * — р<0,05 по отношению к группе с введением BSO
Введение исследуемых препаратов оказывало однонаправленный, но не равнозначный по силе модулирующий эффект. Наиболее активными в этом отношении были ангиолин, тиоцетам и тиотриазолин, применение которых статистически достоверно (р<0,05) приводило к нормализации функционирования СОД и каталазы, и как следствие, ограничивало окислительную модификацию белковых молекул. Отмеченные эффекты обусловлены тем фактом, что указанные препараты относятся к группе антиоксидантов, которые являются «ловушками» свободных радикалов и переводят их в неактивное состояние, способствуя реактивированию антиоксидантных ферментов и более эффективному расходованию неферментативного антиоксиданта токоферола [13, 338-340]. а-Липоевая кислота оказывала менее выраженный эффект, не оказывая существенного влияния на активность NO-синтазы, каталазы и накопления АФГ (табл. 2). Однако,
следует отметить, что этот препарат, наравне с более активными в этом плане, статистически достоверно (р<0,05) препятствовал накоплению пероксинитрита и КФГ, как наиболее токсичных соединений для ткани мозга. Полученные данные свидетельствуют о важной роли этого естественного метаболита в функционировании системы глутатиона и механизмах депонирования оксида азота, повышая, таким образом, его биодоступность и препятствуя образованию цитотоксических дериватов.
Таким образом, при проведении фармакотерапии тиол-содержащими препаратами устанавливается наиболее оптимальное соотношение между уровнями восстановленных и окисленных тиольных групп, а также глутатиона, что свидетельствует об активной мобилизации тиол-дис-ульфидной системы в нейтрализации продуктов свободно-радикального окисления. Кроме того, увеличение функциональности ТДС в условиях
39
Section 2. Biomedical science
введения BSO способствует повышению биодоступности оксида азота, а также уменьшает цитотоксичность его активных дериватов, что проявлялось в виде нормализации активности NO-синтазы, на фоне выраженного снижения
уровня нитротирозина. Вероятно, что в условиях нитрозирующего и оксидативного стресса, благодаря указанным механизмам, изученные средства увеличивают устойчивость нервной ткани к явлениям ишемии [13, 150-152].
Список литературы:
1. Толпыгина О. А. Роль глутатиона в системе антиоксидантной защиты//Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2012 - № 2 - С. 178-180.
2. Коржов В. И. Роль системы глутатиона в процессах детоксикации и антиоксидантной защиты.//Журнал Академи медичних наук Украши. - 2007 - Т. 13, № 1. - С. 3-19.
3. Кулинский В. И., Колесниченко Л. С. Система глутатиона. Синтез, транспорт, глутатионтрансфе-разы, глутатионпероксидазы//Биомедицинская химия - 2009 - Т. 55, № 3 - С. 255-277.
4. Калинина Е. В. Роль глутатиона, глутатионтрансферазы и глутаредоксина в регуляции редокс-за-висимых процессов/Е. В. Калинина, Н. Н. Чернов, М. Д. Новичкова//Успехи биол.наук. - 2014 -Т. 54 - С. 299-348.
5. Горбачева С. В., Беленичев И. Ф. Антиоксидантная модуляция нейроапоптоза в условиях дисбаланса тиол-дисульфидной системы и накоплении окисленных промежуточных соединений in уйго//Вкник проблем бюлоги та медицини - 2015 - № 3 - С. 124-129.
6. Беленичев И. Ф., Горбачева С. В. Демченко А. В. Состояние тиол-дисульфидного равновесия и системы оксида азота в тканях головного мозга крыс с ОНМК: терапевтическое действие ноотропов//Нейрохимия.- 2014. - № 1. - С. 31-35.
7. Асатиани В. С. Ферментные методы анализа. - М.: «Наука», 1969. - 739 с.
8. Чекман И. С. Доклиническое изучение специфической активности потенциальных нейропротективных препаратов/И. С. Чекман, Ю. И. Губский, И. Ф. Беленичев. - К.: ГФЦ МОЗ Украины, 2010. - 81 с.
9. Чевари С. И., Секей И. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах в клетки и метод определения ее в биологических материалах//Лаб. дело. - 1988. - № 11. - С. 678-681.
10. Королюк М. А. Способ определения активности каталазы//Лаб. дело. - 1988. - № 1. - С. 16-19.
11. Halliwell B. Molecular Biology of free Radicals in Human Diseases. - London: St. Lucia: OICA, 1999. -410 p.
12. Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA - М., Медиасфера, 2002, 312 с.
13. Беленичев И. Ф., Черний В. И., Нагорна Е. А. Нейропротекция и нейропластичность - Киев: Логос, 2015. - 512 с.
40
