CC BY
32
Рис. 1. Оценка уровня апоптоза лимфоцитов с помощью двойного окрашивания иодидом пропидия и аннексином V, меченным ФИТЦ (метод лазерной проточной цитофлуориметрии). Картина получена с использованием набора Annexin V-FITC apoptosis Detertion Kit I (BD Biosciences, США) на цитофлуориметре FACS Canto, фирмы Becton Dickinson (США).
Таким образом, проведение биохимического исследования синовиальной жидкости и крови больных гонартрозом, получавших различные типы лечения, показало нарушение свободно-радикального гомеостаза и развитие окислительного стресса, выраженного в большей степени в СЖ. Это сопровождалось повышенной продукцией АКМ, накоплением молекулярных продуктов ПОЛ типа МДА на фоне активации ферментативных механизмов образования АКМ, а также дисбаланса и ингибирования компонентов антиоксидантной системы как в СЖ, так и в крови. Интенсификация свободнорадикального окисления и усиление прооксидантных свойств СЖ больных гонартрозом зависели от выраженности патологического процесса, тяжести оперативного вмешательства, и способствовали углублению деструктивно-дистрофических изменений тканей сустава.
Литература
1. Меньщикова Е.Б. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: Слово, 2006. 556 c.;
2. Clouet J., Vinatier C., Merceron C. et al. From osteoarthritis treatments to future regenerative therapies for cartilage // Drug Discovery Today. - 2009. - Vol. 14, No. 19/20. - P. 913-25;
3. Henrotin Y.E., Bruckner P., Pujol J.-P. L. The role of reactive oxygen species in homeostasis and degradation of cartilage // Osteoarthritis and Cartilage. - 2003. - Vol. 11. - P. 747-55;
4. Henrotin Y., Kurz B., Aigner T. Oxygen and reactive oxygen species in cartilage degradation: friends or foes? // Osteoarthritis and Cartilage. - 2005. Vol. 13. - P. 643-54;
5. Kuhn K., D’Lima D.D., Hashimoto S., Lotz M. Cell death in cartilage // Osteoarthritis and Cartilage. - 2004. - Vol. 12. - P. 1-16;
6. Шестаков В.А., Бойчевская Н.О., Шерстнев М.П. Хемилюминесценция плазмы крови в присутствии перекиси водорода// Вопросы медицинской химии.- 1979. -№ 2. - С. 132-137.
7. Tsikas D. Methods of quantitative analysis of the nitric oxide metabolites nitrite and nitrate in human biological fluids // Free Radic. Res. - 2005. - Vol. 39. - P. 797-815;
8. Conti M., Morand P.C., Levillain P., Lemonnier A. Improved fluorimetric determination of malondialdehyde // Clin Chem. -1991. - Vol. 37. - P. 1273-5;
9. Саидов М.З., Пинеги Б.В. Спектрофотометрический способ определения активности миелопероксидазы в фагоцитирующих клетках // Лабораторное дело. - 1991. - №3. - С. 56-60.
10. Длужевская Т. С., Погорелова Т. Н., Афонин А. А. Активность НАДФН-оксидазы в оценке состояния новорожденных детей // Педиатрия. - 1989. - N3. - С. 44-47.
11. Сирота Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. - 1999. - Т. 45, № 3. - С. 263-72;
12. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы. // Лабораторное дело. - 1988. - № 1. - C. 16-9;
13. Моин В.М. Простой и специфический метод определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах. // Лабораторное дело. - 1986. - № 12. - C. 724 - 7;
14. Habig W.H., Pabst M.J., Jacoby W.B. Glutathione S-Transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation // J. Biol. Chem. - 1974. - Vol. 249, No.22. - P. 7130-39;
15. Ellman G. L. Tissue sulfhydryl groups. // Arch. Biochem. Biophys. - 1959. - Vol. 82, No. 1. - P. 70-7;
Колесникова О.П.1, Перминова О.М.2, Гаврилова Е.Д.3, Гойман Е.В.4, Ляшенко А.М.5, Вольский Н.Н.6, Козлов В.А.7
1Доктор медицинских наук, 2,4,6кандидат медицинских наук, 3кандидат биологических наук, 5студент, 7доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, 1,2,3,4,6,7ФГБУ «НИИ Клинической иммунологии» СО РАМН, Новосибирск, Россия;
5Новосибирский государственный медицинский университет, Россия ВЛИЯНИЕ TH1/TH2^ АЛАН СА НА РАЗВИТИЕ ОСТРОЙ РЕАКЦИИ «ТРАНСПЛАНТАТ ПРОТИВ ХОЗЯИНА»
Аннотация
Изучено влияние фармакологических агентов, способных изменять Тк!/ТИ2-соотношение, на тяжесть развития оРТПХ. В качестве лабораторной модели острой РТПХ использовалась полуаллогенная система C57Bl/6 -—C57Bl/6 x DBA/2)FL В экспериментальных группах мышам вводили полоксамер 407 или 5-азацитидин - препараты1 с оппозитныым эффектом на ТЫ/ТЬ2-баланс. Показано, что полоксамер 407 (сдвигающий Тк1/ТИ2-соотношение в сторону Tkl) увеличивал смертность животных и интенсивность развития острой РТПХ. Наблюдаемые эффекты 5-азацитидина на динамику острой РТПХ, по-видимому, не связаны с его влиянием на Тк1/Тк2-соотношение. Таким образом, проведенные эксперименты свидетельствуют в пользу важной роли Тк1/Тк2-баланса в развитии оРТПХ.
Ключевые слова: ^1/^2-баланс, острая РТПХ, полоксамер 407, 5-азацитидин
Kolesnikova O.P.1, Perminova O.M.2, Gavrilova E.D.3, Goiman E.V.4, Liashenko A.M.5, Volsky N.N.6, Kozlov V.A.7 1Doctor of medical sciences, 2,4,6PhD in medical sciences, 3PhD in biology, 5Medical student, 7Full Member of the Russian Academy
of Medical Sciences, doctor of medical sciences, professor; 1,2,3,4,6,7Scientific Research Institute of Clinical Immunology SB RAMS,
Novosibirsk, Russia; ^Novosibirsk State Medical University, Russia THE INFLUENCE OF TH1/TH2-BALANCE ON THE DEVELOPMENT OF ACUTE GRAFT-VERSUS-HOST DISEASE
Abstract
Tke influence of drugs affecting Tk1/Tk2-balance on tke severity of acute graft-versus-kost disease (GvHD) kas been evaluated. As laboratory model of acute GvHD tke semiallogeneic system C57Bl/6 -—C57Bl/6 x DBA/2)Fi it was used. In experimental groups mice were injected witk poloxamer 407 or 5-azacytidine - drugs witk opposite effects on tke Tk1/Tk2-balance. It was establisked tkat poloxamer 407 (skifting Tk1/Tk2-ratio toward Tk1) increases mortality of animals and intensity of acute GvHD. Observed effects 5-
68
azacytidine on acute GvHD are not connected probably with its influence on Th1/Th2-balance. Thus, the performed experiments confirm an important role of Th1/Th2-balance in development of acute GvHD.
Keywords: Th1/Th2-balance, acute GvHD, poloxamer 407, 5-azacytidine
Введение
Проблеме патогенеза и особенностей течения острой реакции «транстплантат против хозяина» (оРТПХ) посвящено большое количество экспериментальных и клинических исследований, и их число не уменьшается со временем. Интерес к этой проблеме обусловлен не только ее значением для теоретической иммунологии, но и тем, что оРТПХ является одним из грозных и достаточно частых осложнений при пересадке костного мозга. Поэтому любые факты, проливающие свет на механизмы развития оРТПХ, могут иметь и важное практическое значение.
На сегодняшний день установлено, что одним из ведущих факторов, обусловливающих развитие оРТПХ, как у пациентов с аллогенной трансплантацией костного мозга, так и в различных лабораторных моделях, является активность Т-хелперов первого типа [2, 8]. Показано, что различные экспериментальные воздействия, нарушающие размножение, дифференцировку и функционирование Th1-клеток донора, подавляют возникновение оРТПХ и уменьшают интенсивность ее проявлений [10]. Однако, в целом, вопрос о роли Th1/Th2-баланса в патогенезе оРТПХ выяснен еще недостаточно и требует дальнейшего изучения.
Исходя из выше изложенного, целью настоящей работы было изучение динамики оРТПХ при воздействии на нее двух фармакологических агентов с разнонаправленными эффектами на Th1/Th2-баланс. В качестве первого из таких веществ был выбран полоксамер 407 (Р407), сдвигающий, по нашим данным [1, 4], Th1/Th2-соотношение в сторону Th1. Другим использованным в работе препаратом был 5-азацитидин (5-AZA) - ингибитор метилирования ДНК, способный, как это следует из литературных данных [6], сдвигать указанное соотношение в сторону преобладания Th2.
Материалы и методы
Эксперименты выполнены на 280 мышах-самках линии C57BL/6 и гибридах F^DBA x C57BL/6). Животных получали из вивария СО РАМН в возрасте 2,5 - 3 месяца и в период проведения экспериментов содержали на стандартной диете и в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страссбург, 1986).
Полоксамер 407 (Pluronic F-127; Sigma) вводили внутрибрюшинно в дозе 7,5 мг/мышь в 0,5 мл среды RPMI-1640 через сутки в течение двух недель, как это было описано ранее [1]. Контрольным животным в те же сроки вводили 0,5 мл растворителя. Острую РТПХ индуцировали внутривенным введением мышам-гибридам BDF спленоцитов, полученных от родительской линии C57BL, в дозе 100 х 106 клеток/мышь, однократно, на следующий день после последнего введения Р407. Другая схема была использована в экспериментах с 5-азацитидином. Препарат (5-azacytidine, Sigma) вводили подкожно в дозе 50 мкг/мышь ежедневно в течение 7 дней, начиная со следующего дня после индукции оРТПХ. Контрольным животным в этих опытах вводили 0,2 мл физиологического раствора. Активность трансаминаз в сыворотке крови мышей определяли с помощью наборов «Трансаминаза-АЛТ-Ново» и «Трансаминаза-АСТ-Ново» («Вектор-Бест», Россия).
Полученные данные приводятся в виде средних величин параметров, измеренных в нескольких независимых экспериментах. Статистическую значимость различий между исследуемыми показателями оценивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-У итни.
Результаты и обсуждение
Результаты проведенных экспериментов, в целом, подтверждают наше исходное предположение о важности Th1/Th2-соотношения в патогенезе оРТПХ. Так, из данных, представленных на Рис. 1, видно, что сдвиг баланса хелперов в сторону Th1 заметно
Рис. 1. Влияние полоксамера 407 на динамику смертности животных при острой РТПХ.
интенсифицирует течение оРТПХ: падеж животных в группе с предварительным воздействием Р407 начинается раньше и происходит более интенсивно, чем в контрольной группе мышей с оРТПХ. Этот вывод подтверждается и стимулирующим действием Р407 на степень деструкции тимуса при оРТПХ. Из данных Таблицы видно, что во все исследованные сроки после индукции оРТПХ вес тимуса и содержание в нем клеток у мышей, подвергшихся воздействию Р407, оказываются существенно ниже, чем соответствующие показатели в контрольной группе. Этот параметр является характерным свидетельством активности донорских киллерных клеток при оРТПХ [3], и его статистически достоверные изменения на фоне сдвига Th1/Th2-баланса могут служить надежной оценкой для интенсивности развития оРТПХ.
Представленные в Таблице данные говорят также о наличии спленомегалии у мышей с оРТПХ (контрольная группа) в ранние сроки ее развития. Этот признак также характерен для оРТПХ [7] и отражает В-клеточную пролиферацию, происходящую на ранней стадии развития оРТПХ и находящуюся под контролем Th2-клеток. На поздних стадиях заболевания спленомегалия исчезает за счет общей деструкции лимфоидной ткани под воздействием цитотоксических клеток донора. Видно, что у мышей с предварительным введением Р407 спленомегалия менее выражена, чем в контроле, и она быстрее сменяется деструктивными изменениями в ткани селезенки. Этот обнаруженный нами факт хорошо согласуется с предполагаемым сдвигом Th1/Th2-баланса в сторону Th1 под воздействием Р407.
69
Данные, представленные на Рис. 2, свидетельствуют, что введение мышам 5-AZA на ранней стадии развития оРТПХ почти полностью блокирует гибель животных в результате этого патологического процесса (ранняя гибель нескольких мышей в этой группе вряд ли может быть приписана непосредственному эффекту оРТПХ и, вероятно, обусловлена токсическим действием самого препарата). Такой эффект 5-AZA можно было бы объяснить его стимулирующим воздействием на развитие Th2-лимфоцитов, и вытекающим из этого снижением степени тяжести оРТПХ. Помимо влияния 5-AZA на выживание мышей с оРТПХ в пользу подавления интенсивности патологического процесса под воздействием этого препарата говорят также полученные нами данные о его ингибирующем влиянии на развитие гепатомегалии. Печень является одним из органов-мишеней при деструкции тканей реципиента цитотоксическими клетками донора и, согласно полученным нами результатам, достоверно увеличивается в размерах, по сравнению с интактными животными, за счет воспалительных изменений в этом органе. Было
Таблица. Изменения содержания лейкоцитов в крови и состояния лимфоидных органов в динамике острой РТПХ на фоне
воздействия препаратов, сдвигающих Th1/Th2-баланс
Исследуемые параметры Интактные мыши Срок после индукции оРТПХ
5 суток 12 суток 20 суток
Вес тимуса, мг 41,4 ± 2,2 25,6 ± 1,6# 12,9 ± 1,5#
оРТПХ (контроль) 45,5 ± 2,8
оРТПХ + Р407 36,6 ± 3,3 15,5 ± 2,3* 5,0 ± 1,0*
оРТПХ + 5-AZA 13,9 ± 1,1#* 11,9 ± 0,8#* 31,2 ± 3,5*
Количество клеток в тимусе, 106
клеток 104,4 ± 14,6
оРТПХ (контроль) 100,8 ± 11,1 35,8 ± 3,5# 6,9 ± 1,2#
оРТПХ + Р407 94,5 ± 8,5 14,2 ± 5,8 1,2 ± 0,6*
оРТПХ + 5-AZA 8,4 ± 0,7#* 4,2 ± 0,7#* 38,7 ± 10,0#*
Вес селезенки, мг 97,6 ± 5,1
оРТПХ (контроль) 174,9 ± 11,9# 202,2 ± 10,5# 153,1 ± 22,2#
оРТПХ + Р407 172,6 ± 18,2# 157,3 ± 6,9# 85,0 ± 17,9
оРТПХ + 5-AZA 85,6 ± 6,7 142,4 ± 11,3 115,1 ± 9,6
Количество клеток в селезенке,
106клеток 148,1 ± 9,1
оРТПХ (контроль) 189,5 ± 10,5# 82,2 ± 8,5 109,5 ± 27,3
оРТПХ + Р407 108,8 ± 16,0 43.5 ± 4,7 30,3 ± 11,8#*
оРТПХ + 5-AZA 108,9 ± 9,2 71,4 ± 9,9 128,2 ± 14,0
Количество лейкоцитов в крови,
109 /литр 12,9 ± 2,2 4,6 ± 0,7#
оРТПХ (контроль) 12,9 ± 1,5 8,8 ± 2,1
оРТПХ + Р407 13,5 ± 2,4 10,4 ± 1,8 8,8 ± 1,3
оРТПХ + 5-AZA 3,7 ± 0,3#* 9,9 ± 3,0 13,1 ± 0,7*
* достоверное отличие от соответствующего контроля (р < 0,05)
# достоверное отличие от соответствующего параметра у интактных мышей (р < 0,05)
установлено, что введение 5-AZA существенно тормозит данный процесс (вес печени у интактных мышей - 841 ± 33 мг, у контрольных животных на 12-й день развития оРТПХ - 1318 ± 54 мг, а на тот же срок в группе мышей с введением 5-AZA - 1105 ± 36 мг; р < 0,05). Также было обнаружено аналогичное (тормозящее) влияние 5-AZA на увеличение активности трансаминаз (АЛТ и АСТ) в крови, зарегистрированное у мышей с оРТПХ.
Однако другие данные, представленные в Таблице, не позволяют сделать вывод о том, что механизмом, определяющим репрессивный эффект 5-AZA на
развитие оРТПХ, является сдвиг баланса Т-хелперов. Из Таблицы видно, что воздействие этого препарата на лимфоидную систему значительно отклоняется
Рис. 2. Влияние 5-азацитидина на динамику смертности животных при острой РТПХ. от обнаруживаемой в контрольной группе мышей динамики развития оРТПХ. На ранних этапах развития о РТПХ 5-AZA не только не сглаживает изменения веса и клеточности тимуса, вызванные иммунологическим конфликтом в организме реципиента, но и самостоятельно резко уменьшает эти показатели в те сроки, когда деструкция тимуса, обусловленная оРТПХ, еще не успевает себя проявить. В то же время, введение 5-AZA отменяет развитие спленомегалии, наблюдаемой в ранние сроки
70
заболевания, и это нельзя объяснить его стимулирующим влиянием на 'Ш2-лимфоциты. По-видимому, в исследованном нами случае на первый план выходит цитотоксическое действие 5-AZA по отношению к лимфоидным клеткам, которое было давно описано [5, 9] и которое приводит в использованной нами модели к подавлению как TЫ-зависимых, так и Th2-зависимых иммунных реакций.
Таким образом, результаты проведенных экспериментов свидельствуют в пользу важной роли Th1/Th2-баланса в развитии оРТПХ и в регуляции степени ее интенсивности, но выяснение возможности регуляции этих процессов с помощью воздействий, сдвигающих соотношение хелперов в сторону Th2 (в том числе и ингибиторов метилирования ДНК, таких как 5-AZA), требует дальнейших исследований.
Литература
1. Перминова О.М., Вольский Н.Н., Кудаева О.Т и др. Дислипидемия и Th1/Th2-соотношение на разных этапах развития хронической реакции «трансплантат против хозяина» // Иммунология. - 2009. - № 6. - С. 341-345.
2. Allen R.D., Staley T.A., Sidman C.L. Differential cytokine expression in acute and chronic murine graft-versus-host-disease // Eur.
J. Immunol. - 1993. Vol. 23, N 2. - P. 333-337.
3. Krenger W., Rossi S., Hollander G.A. Apoptosis of thymocytes during acute graft-versus-host disease is independent of
glucocorticoids // Transplantation. - 2000. Vol. 69, N 10. - P. 2190-2193.
4. Kudaeva O.T., Kolesnikova O.P., Goiman E.V. et al. The experimental model of the autoimmune glomerulonephritis induced by the chronic graft versus host reaction // An update on glomerulopathies - Etiology and pathogenesis. Ed. by S.S.Prabhakar. Rijeka: In Tech, 2011. - P. 49-86.
5. Presant C.A., Vietti T., Valeriote F. Kinetics of both leukemic and normal cell population reduction following 5-azacytidine // Cancer Res. - 1975. Vol. 35, N 8. - P. 1926-1930.
6. Quddus J., Johnson K.J., Gavalchin J. et al. Treating activated CD4+ T cells with either of two distinct DNA methyltransferase inhibitors, 5-azacytidine or procainamide, is sufficient to cause a lupus-like disease in syngeneic mice // J. Clin. Invest. - 1993. Vol. 92, N 1. - P. 38-53.
7. Rus V., Svetic A., Nguyen P. et al. Kinetics of Thl and Th2 cytokine production during the early course of acute and chronic murine GvHD // J. Immunol. - 1995. Vol. 155, N 5. - P. 2396-2406.
8. Schroeder M.A., DiPersio J.F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations // Dis. Model. Mech. - 2011. Vol. 4, N 3. - P. 318-333.
9. Vadlamudi S., Choudry J.N., Warawdekar V.S. et al. Effect of combination treatment with 5-azacytidine and cytidine on the lifespan and spleen and bone marrow cells of leukemic (L1210) and nonleukemic mice // Cancer Res. - 1970. Vol. 30, N 2. - P. 362-369.
10. Williamson E., Garside P., Bradley J.A. et al. Neutralizing IL-12 during induction of murine acute graft-versus-host disease polarizes the cytokine profile toward a Th2-type alloimmune response and confers long term protection from disease // J. Immunol. -1997. Vol. 159, N 3. P. 1208-1215.
Розова Е.В.
Доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины ПОЛОЖИТЕЛЬНОЕ ВЛИЯНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ В ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЕ НА ФУНКЦИЮ ДЫХАНИЯ И КРОВООБРАЩЕНИЯ ЧЕРЕЗ НОРМАЛИЗАЦИЮ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ БАРЬЕРОВ В
ТКАНЯХ ЛЕГКИХ И СЕРДЦА
Аннотация
При острах гипоксической гипоксии, кровопотере и иммобилизационном стрессе с одинаковым соотношением доставки О2 к его потреблению наблюдаются выраженные изменения параметров, характеризующих функцию внешнего дыхания и кровообращения. При всех используемых воздействиях имеет место возрастание средних арифметической и гармонической толщин аэрогематического барьера легких и гематопаренхиматозного барьера миокарда, обусловленное их гипергидратацией. Применение фосфолипидов в липосомальной форме при всех моделируемых воздействиях сопровождалось значительным снижением гидратации биологических барьеров, оптимизацией функционирования систем дыхания и кровообращения.
Ключевые слова: гипоксическая гипоксия, кровопотеря, иммобилизационный стресс, аэрогематический барьер легких, гематопаренхиматозный барьер миокарда, липосомы.
Rozova E.V.
Doctor of Biological Sciences, Principal Researcher, Bogomoletz Institute of Physiology National Academy of Sciences of Ukraine POSITIVE EFFECTS OF PHOSPHOLIPIDS IN LIPOSOMAL FORM ON THE FUNCTIONS OF RESPIRATION AND CIRCULATION THROUGH THE NORMALIZATION OF BIOLOGICAL BARRIERS ULTRASTRUCTURE AT THE LUNG
AND HEART TISSUES
Abstract
Under acute hypoxic hypoxia, blood loss and immobilization stress with the same ratio of O2 delivery to its consumption, there are marked changes in the parameters that characterize the function of respiration and blood circulation. At all effects there is an increase of mean arithmetic and harmonic thickness of the lung air-blood barrier and myocardium blood-tissue barrier due to their hyperhydration. The use ofphospholipids in liposomal form in all simulated influences accompanied by significant decrease in the hydration of biological barriers, optimization of the functioning in the circulatory and respiratory systems.
Keywords: hypoxic hypoxia, blood loss, immobilization stress, air-blood barrier of the lung, myocardium blood-tissue barrier, liposomes.
При остром воздействии любой природы, сопровождающимся развитием гипоксического состояния организма, наблюдаются существенные изменения, как морфологической структуры, так и функционального состояния тканей сердца и легких, биологических барьеров, входящих в их состав. Причем на основании накопленного к настоящему времени экспериментального и клинического материала, полученного нами и другими исследователями, принято считать, что реакция на указанные воздействия, захватывающая ткань легких и миокард, реализуется в стереотипном ответе клеток, входящих в их состав [4,8,14,25]. В основе этой реакции лежит нарушение (повышение) проницаемости цитоплпзматических мембран, что в итоге приводит к увеличению гидратации тканей и развитию проявлений отека.
В ряду причин, способных приводить к нарушению функциональной целостности клеточных мембран, одной из ведущих следует считать усиление под влиянием неблагоприятного воздействия на организм ПОЛ с образованием продуктов, модифицирующих проницаемость мембран [14,17,18,27].
При интенсификации процессов ПОЛ происходит изменение физико-химических характеристик цитоплазматических мембран, что изменяет их проницаемость, способствуя усилению гипергидратации тканей, а также часто приводит к деструкции мембран [28]. Т.е., для того чтобы разорвать данный порочный круг необходимо нормализовать физико-химическое состояние мембранных структур и восстановить их целостность. Достаточно широкий спектр происходящих при развитии гипоксических состояний повреждений, как указывалось ранее, существенно зависит от течения процессов ПОЛ, что указывает на
71
