CC BY
51
УДК 591.111.7:591.128.1
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ИНКУБАЦИИ НА ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ ЯДЕРНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ CYPRINUSCARPIO И RANARIDIBUNDA
С.Д. Чернявских 1, До Хыу Кует 1, Во Ван Ткань 2, Ю.В. Леонтьева 1
1 Белгородский государственный национальный исследовательский университет, Россия, 308015,
г. Белгород, ул. Победы, 85
2 Педагогический университет
г. Хошимина, Вьетнам, г. Хошимин, район 5, квартал 4, ул. Ан Зыонг Выонг, д. 280
Изучено влияние температуры и продолжительности инкубации на фагоцитарную активность ядерных эритроцитов сазана (Cyprinus carpio) и лягушки озерной (Rana ridibunda). Установлено, что при 2-8 часовой инкубации красные клетки крови сазана и лягушки озерной проявляют поглотительную способность в отношении Saccharomyces cerevisiae при температурах 20 и 40°С. С увеличением температуры (от 20 до 40°С) и продолжительности инкубации (от 2-х до 8 часов) поглотительная способность красных клеток Cyprinus carpio и Rana ridi-bunda снижается, за исключением фагоцитарной активности эритроцитов лягушки при 4-х часовой инкубации в условиях комнатной температуры.
Ключевые слова: ядерные эритроциты, фагоцитарная активность, температурный фактор.
Введение
Для холоднокровных животных температура окружающей среды является одним из важнейших факторов, воздействующих на иммунологические процессы [1]. Установлено, что изменение температуры воды до уровня, находящегося выше оптимального, понижает фагоцитарную активность лимфоцитов рыб [2-5]. Известно, что у низших позвоночных защитную функцию наряду с лейкоцитами выполняют ядерные эритроциты [6, 7].
В современной клеточной биологии активно изучается взаимосвязь между устойчивостью эритроцитов к гемолитикам разного генеза и физиологическим состоянием организма [8-10]. Вместе с тем, в литературе практически отсутствуют сведения об устойчивости вышеназванного пула клеток к температурному фактору. Еще менее изученным является вопрос о влиянии температурного фактора на фагоцитарную активность ядерных эритроцитов низших позвоночных.
Целью исследования было изучение влияния температуры и продолжительности инкубации на фагоцитарную активность эритроцитов Cyprinus carpio и Rana ridibunda.
Объекты и методы исследования
В работе использовали периферическую кровь сазана (Cyprinus carpio) (30 особей) и лягушки озёрной (Rana ridibunda) (30 особей). Объектами исследования служили ядерные эритроциты. Опыты были проведены в летний период.
Животных предварительно наркотизировали эфиром. Забор крови у сазана проводили из хвостовой вены, у лягушки - из сердца. Для предотвращения свёртывания крови использовали гепарин в количестве 10 ед. на 1 мл крови. Полученную кровь центрифугировали 4 мин. при 400g. Далее удаляли слой лейкоцитов и обогащённую ими часть плазмы. В пробирке оставляли эритроцитарную массу. Красные клетки крови инкубировали при комнатной (20°С) и повышенной (40°С) температурах в течение 2, 4, 6 и 8 часов. После инкубации к эритроцитам добавляли объекты фагоцитарной реакции (клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae) в соотношении 1:50 и инкубировали при вышеназванных температурах еще 30 мин. Затем делали мазки, фиксировали клетки метанолом, окрашивали азур-эозином по-Романовскому. На каждом мазке было просчитано не менее 100 клеток, определен процент фагоцитирующих эритроцитов (фагоцитарный показатель) и среднее число объектов фагоцитоза, поглощенных одним фагоцитом (фагоцитарный индекс). Во избежание неточностей при подсчете поглощенных частиц, связанных с затруднениями в определении их локализации (внутри или на поверхности клетки), использовали иммерсионное увеличение 100х [11-16].
Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики. С помощью компьютерных программ Excel 7.0 и Statistica 6.0 вычисляли значение средней арифметической выборочной совокупности (M) и стандартной ошибки среднего значения (m). С помощью непарного (двухвыборочного) t-критерия Стьюдента определяли достоверность разли-
чий между значениями признаков сравниваемых групп. За уровень статистически значимых принимали различия при р<0.05.
Результаты и их обсуждение
В результате проведенных исследований установлено, что при 2-8 часовой инкубации красные клетки крови сазана проявляют фагоцитарную активность как при комнатной, так и при повышенной до 40°С температурах инкубации. Полученные результаты поглотительной способности красных клеток крови Cyprinus carpió к клеткам Saccharomyces cerevisiae представлены в таблице 1.
Таблица 1
Поглотительная способность эритроцитов Cyprinus carpió в отношении
Saccharomyces cerevisiae
Время инкубации, ч Исследуемые показатели, ед. изм. Температура инкубации, °С
20 40
2 ФП, % 41.00±0.73 28.50±1.40 &
ФИ, отн. ед. 1.11±0.03 1.09±0.07
4 ФП, % 41.47±1.20 21.71±1.17 *&
ФИ, отн. ед. 1.14±0.04 1.03±0.03 &
6 ФП, % 35.17±1.16 * 19.44±1.15 *#&
ФИ, отн. ед. 1.06±0.03 * 1.00±0.02 *&
8 ФП, % 24.09±1.04 15.38±1.05
ФИ, отн. ед. 1.15±0.02 1.00±0.01 *#&
Примечание (здесь и в таблице 2): ФП - фагоцитарный показатель, ФИ - фагоцитарный индекс. Достоверность различий: * - по сравнению с 2 часами инкубации, # - по сравнению с 4 часами инкубации, @ - по сравнению с 6 часами инкубации, & - по сравнению с температурой 20°С по t-критерию Стьюдента (р<0.05).
Как видно из таблицы, увеличение температуры инкубации до 40°С способствовало снижению фагоцитарного показателя красных клеток крови сазана через 2, 4, 6 и 8 часов на 30.5%, 47.7%, 44.7% и 36.2% соответственно по сравнению с инкубацией при температуре 20°С. Уменьшение фагоцитарного индекса эритроцитов Cyprinus carpió через 4, 6 и 8 часов инкубации при повышенной температуре по сравнению с комнатной температурой составило 9.7%, 5.7% и 13.0% соответственно.
При температуре 20°С увеличение продолжительности инкубации до 6 и 8 часов также способствовало снижению фагоцитарного показателя эритроцитов сазана на 14.2% и 41.2% по сравнению с 2-мя часами, при этом фагоцитарный индекс при 6 часовой инкубации снизился на 4.5%, при 8 часовой инкубации увеличился на 3.6% по сравнению с 2-х часовой инкубацией. При комнатной температуре 8-ми часовая инкубация привела к снижению фагоцитарного показателя эритроцитов сазана на 41.9% по сравнению с 4-х часовой инкубацией и на 31.5% по сравнению с 6-ти часовой инкубацией, фагоцитарный индекс при 8-ми часовой по сравнению с 6-ти часовой инкубацией, напротив, увеличился на 8.5%.
При температуре 40°С с увеличением длительности инкубации также наблюдали динамичное снижение фагоцитарного показателя и фагоцитарного индекса эритроцитов сазана. Так, при данной температуре увеличение продолжительности инкубации до 4-х, 6-ти и 8-ми часов способствовало снижению фагоцитарного показателя красных клеток крови сазана на 23.8%, 31.8% и 46.0% по сравнению с 2-х часовой инкубацией. Через 6 и 8 часов инкубации по сравнению с 4 часами уменьшение вышеназванного показателя составило 10.1% и 29.2%, через 8 часов по сравнению с 6 часами - 20.9%. При температуре 40°С через 6 часов инкубации фагоцитарный индекс красных клеток крови сазана снизился на 8.3% по сравнению с 2 часами, через 8 часов - на 8.3% и 2.9% по сравнению с 2-мя и 4-мя часами соответственно.
Эритроциты лягушки также проявляли фагоцитарную активность в отношении Saccar-omyces cerevisiae как при температуре 20°С, так и при температуре 40°С в течение 2-8 часовой инкубации. Полученные результаты фагоцитарной активности эритроцитов Rana ridibunda в отношении клеток дрожжей представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы, при увеличении температуры инкубации до 40°С по сравнению с температурой 20°С фагоцитарный показатель ядерных эритроцитов лягушек через 4 и 8 часов инкубации снижается на 25.5% и 9.5% соответственно. Через 6 часов инкубации при темпе-
ратуре 40°С по сравнению с температурой 20°С также произошло уменьшение среднего числа поглощенных одним эритроцитом Rana ridibunda частиц (на 10.7%).
Таблица 2
Поглотительная способность эритроцитов Rana ridibunda в отношении
Saccharomyces cerevisiae
Время инкубации, ч Исследуемые показатели, ед. изм. Температура инкубации, оС
20 40
2 ФП, % 57.l6±3.70 55.29±l.70
ФИ, отн. ед. l.33±0.02 l.26±0.08
4 ФП, % 66.65±0.66 * 49.66±2.86 *&
ФИ, отн. ед. 1.32±0.03 1.24±0.06
6 ФП, % 50.92±2.73 * 47.84±1.47 *
ФИ, отн. ед. 1.31±0.04 1.17±0.07 &
8 ФП, % 40.29±1.13 * 36.45±2.10 *@&
ФИ, отн. ед. 1.23±0.04 *# 1.20±0.03
При комнатной температуре увеличение продолжительности инкубации ядерных эритроцитов лягушки до 4-х часов способствовало повышению фагоцитарного показателя на l6.6%, до 6-ти и 8-ми часов - снижению на l0.9% и 29.5% соответственно по сравнению с 2-мя часами. При вышеназванной температуре через 8 часов инкубации снизилось среднее число объектов фагоцитоза, поглощенных одним эритроцитом лягушки на 7.5% по сравнению с 2-мя часами и на 6.8% по сравнению с 4-мя часами инкубации.
При температуре 40°С увеличение длительности инкубации способствовало динамичному снижению фагоцитарного показателя у ядерных эритроцитов лягушки. Через 4, 6 и 8 часов инкубации по сравнению с 2-мя часами фагоцитарный показатель красных клеток крови Rana ridibunda при температуре 40°С снизился на l0.2%, l3.5% и 34.l% соответственно. Через 8 часов инкубации при данной температуре также наблюдалось снижение фагоцитарного показателя у эритроцитов лягушки на 23.8% по сравнению с 6 часами инкубации.
Заключение
В результате проведенных исследований установлено, что ядерные эритроциты сазана и лягушки проявляют фагоцитарную активность в отношении Saccharomyces cerevisiae при комнатной (20°С) и повышенной до 40°С температурах при 2-8 часовой инкубации. У ядерных эритроцитов сазана с увеличением температуры от 20°С до 40°С и продолжительности от 2-х до 8 часов инкубации поглотительная способность снижается. У красных клеток крови лягушки с увеличением продолжительности инкубации от 2-х до 8 часов поглотительная способность ядерных эритроцитов также снижается, за исключением 4-х часовой инкубации при комнатной температуре. Повышение температуры инкубации от 20 до 40°С способствует инактивации фагоцитарного показателя и фагоцитарного индекса эритроцитов Rana ridibunda.
Согласно исследованиям некоторых авторов, ведущими факторами, вызывающими изменения физиологических свойств гемоцитов, являются свойства мембраны [l7, l8]. Последние определяются фазовыми переходами билипидного слоя плазмалеммы с разной критической точкой у представителей теплокровных и холоднокровных животных [l7]. Значимость температуры окружающей среды для клеточных мембран как пойкилотермных, так и гомойо-термных организмов обусловлена тем, что она определяет так называемые «слабые» взаимодействия между молекулами [l9]. Можно предположить, что при инкубации красных клеток крови сазана и лягушки в условиях повышенной температуры происходит нарушение регуляции микровязкости билипидного слоя, фазового распределения липидов, микроокружения белков, белок-липидных взаимодействий, а также других характеристик структурной организации мембраны [l8], при этом уменьшается резистентность и локомоционная активность эритроцитов [l], приводящие к снижению фагоцитарной активности.
Список литературы
1. Влияние температуры и длительности инкубации на миграционную активность и резистентность ядерных эритроцитов рыб, лягушек и птиц / С.Д. Чернявских, М.З. Федорова, Нгуен Тхи Тьук и др. // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия Естественные науки. -Белгород, 2012. - №2l (l40). Вып. 2l. - С. 89-93.
2. Степанова В.М. Влияние температуры на антигенреагирующие клетки карпа (Cyprinus carpió L.) / / Биология внутренних вод. - 2002. - Вып. 4. - С. 80-83.
3. Avtalion R.R., Weiss E., Moalem T. Regulatory effects of temperature upon immunity in ectothermic vertebrates // Comparative immunology. N.Y.: Blackwell Scient. Publ. Oxford, 1976. — Pp. 227-238.
4. Effect of temperature on the immune system of channel catfish (Ictalurus punctatus). I. Leucocyte distribution and phagocyte function in the anterior kidney at 10°C / A.J. Ainsworth, C. Dexiang, P.R. Waterstrat, T. Greenway // Comp. Biochem. Physiol. - 1991. - Vol. 100 A. - Pp. 907-912.
5. Scott A.L., Rogers W.A., Klesius P.N. Chemiluminescence by peripheral blood phagocytes from channel catfish: function of opsonin and temperature // Dev. Comp. Immunol. 1985. — Vol. 9. — Pp. 241-250.
6. Prunesco H. Natural and experimental phagocitosis by erythrocytes in Amfibians // Nature. New Biol.
— 1971. — №22. Vol. 231. — Pp. 143-144.
7. Поглотительная способность ядерных гемоцитов Cyprinus carpio L. и Rana ridibunda Pall. в разные сезоны года / И.С. Буковцова, С.Д. Чернявских, До Хыу Кует и др. // Научные ведомости БелГУ. Сер. «Естественные науки». - Белгород, 2013. - №7 (160). Вып. 24. - С. 86-91.
8. Перекисное окисление липидов и проницаемость мембран эритроцитов у детей и подростков с сахарным диабетом типа 1 / Т.Н. Субботина, Н.М. Титова, А.А. Савченко и др. // Клин. лаб. диагн. - 2004.
— №5. - С. 20, 33-35.
9. Новицкий В.В. Молекулярные нарушения мембраны эритроцитов при патологии разного гене-за являются типовой реакцией организма: контуры проблемы / В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева, Е.А. Сте-повая др. / / Бюл. сибирской медицины. - 2006. — №2. - С. 62-69.
10. Коробко В.Б., Гунина Л.М., Кабан А.П. Клинические и биохимические особенности статуса больных раком желудка, подвергшихся воздействию ионизирующего излучения в результате аварии на ЧАЭС // Врачеб. дело. - 1995. - №5-6. - С. 19-22.
11. Чернявских С.Д., Федорова М.З., Масленникова Е.В. Сезонные колебания показателей фагоцитоза эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов позвоночных // Научные ведомости БелГУ. Сер. «Естественные науки». - Белгород, 2011. - №15 (110). Вып. 16. - С. 68-73.
12. Адамова В.В., Чернявских С.Д. Морфофункциональные особенности ядерных эритроцитов и лейкоцитов Cyprinus carpio и Rana ridibunda в условиях умеренной гипотонии // Научные ведомости БелГУ. Сер. «Естественные науки». - Белгород, 2013. - №10 (153). Вып. 23. - С. 103-106.
13. Поглотительная способность ядерных гемоцитов Cyprinus carpio L. и Rana ridibunda Pall. в разные сезоны года / И.С. Буковцова, С.Д. Чернявских, Д.Х. Кует и др. // Научные ведомости БелГУ. Сер. «Естественные науки». - Белгород, 2013. - №7 (160). Вып. 24. - С. 86-91.
14. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии / А.А. Воробьев, Ю.С. Кривошеник, А.С. Быков и др. - М.: Мастерство, 2001. - 221 с.
15. Глик Б., Пастернак Д. Молекулярная биотехнология. - М.: Мир, 2002. - 589 с.
16. Изучение поглотительной способности нейтрофилов крови с использованием инертных частиц латекса / С.Г. Потапова, В.С. Хрустиков, Н.В. Демидова, Г.И. Козинец // Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - Т. XXII; №9 - С. 58-59.
17. Харакоз Д.П. О возможной физиологической роли фазового перехода «жидкое-твердое» в биологических мембранах // Успехи биологической химии. - 2001. - Т. 41. - С. 333-364.
18. Чернявских С.Д., Недопекина С.В. Сезонные колебания относительной микровязкости, полярности и сорбционной способности эритроцитарных мембран Cyprinus carpio и Rana ridibunda // Научные ведомости БелГУ. Сер. «Естественные науки». - Белгород, 2013. - №3 (146). Вып. 22. - С. 99-103.
19. Горюнов А.С., Борисова А.Г., Суханова Г.А. Терморезистентность эритроцитов и гемоглобина при акклиматизации радужной форели Salmo irideus // Ж. эвол. биохим. и физиол. 2001. - Т. 37. -С. 416-418.
THE INFLUENCE OF TEMPERATURE AND INCUBATION TIME ON PHAGOCYTIC ACTIVITY OF NUCLEATED ERYTHROCYTES OF CYPRINUS CARPIO AND RANA RIDIBUNDA
The influence of temperature and incubation time on phagocytic activity of nucleated erythrocytes of Cyprinus carpio and Rana ridibunda has been studied. It has been demonstrated that the phagocytic activity of red blood cells of carp and frog to Saccaromyces cerevisiae is shown after 2-8 hours of incubation, at the temperature 20 and 40°C. Phagocytic activity of erythrocytes of Rana ridibunda has been registered after 2 hours of incubation, at the temperature 40°C. Phagocytic activity of red blood cells of Cyprinus carpio and Rana ridibunda decreased with the increase of temperature from 20 to 40°C and incubation time of from 2 to 8 hours except phagocytic activity of frog erythrocytes after 4 hours incubation at room temperature conditions.
Key words: nucleated erythrocytes, phagocytic activity, temperature factor.
S.D. Chernyavskikh 1, Do Huy Kyet 1, Vo Van Thanh 2, Y.V. Leontyeva 1
1 Belgorod State National Research University, 85 Pobeda St, Belgorod, 308015, Russia
2 Ho Chi Minh City University
of Education, 280 An Duong Vuong St, Ward 4, Dist. 5, Vietnam E-mail:[email protected]
