CC BY
42
УДК 577.352.33:597.4./.5:597.8
СЕЗОННЫЕ КОЛЕБАНИЯ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ МИКРОВЯЗКОСТИ, ПОЛЯРНОСТИ И СОРБЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ МЕМБРАН СУРИНив САЙР/О
И ВАНА ИШШиНОА
Изучены сезонные колебания относительной микровязкости, полярности и сорбционной способности эритроцитарных мембран Cyprinus carpio и Rana ridibunda. В липидном бислое мембран эритроцитов сазана самые высокие значения показателей относительной микровязкости и полярности регистрируются весной, самые низкие - летом, в зоне белок-липидных контактов - летом и зимой соответственно. У лягушки самые высокие значения микровязкости и полярности как липидной фазы, так и зоны аннулярных липидов эритроцитарных мембран отмечаются летом, самые низкие - зимой. Показатели сорбционной способности красных клеток крови в весенний и, особенно, в летний периоды у сазана повышаются, у лягушек - снижаются по сравнению с осенним и зимним сезонами.
Ключевые слова: относительная микровязкость, полярность, сорбци-онная способность, эритроцитарные мембраны, сазан, лягушка.
Введение
Биологические мембраны играют важную роль в нормальном строении и функционировании клеток [1]. Ограничивая клетку снаружи, они первыми реагируют на изменяющиеся условия внешней среды [2]. Динамические свойства цитоплазматических мембран обусловлены текучестью липидного бислоя [3, 4]. В научной литературе наиболее детально изучены структурно-функциональные особенности мембраны эритроцитов млекопитающих животных и человека [5], в частности, достаточно подробно рассмотрен процесс исследования микровязкости клеточных мембран методом диффузии гидрофобного зонда пирена [6, 7, 8], показано влияние разных факторов на текучесть клеток крови [9, 10]. Описаны особенности сорбционной способности гемоцитов млекопитающих [11, 12], показано воздействие различных факторов на данный показатель [13, 14]. Исследования морфофункциональных характеристик ядерных эритроцитов, в частности гемоцитов пойкилотермных животных, в научной литературе ограничены. В хронобиологических исследованиях практически отсутствуют сведения о сезонных изменениях структурно-функциональных показателей красных клеток крови у представителей классов Костные рыбы и Земноводные. Исходя из вышеизложенного, изучение сезонных колебаний показателей микровязкости, полярности и сорбционной способности эритроцитарных мембран у Cyprinus carpio и Rana ridibunda является актуальным.
Объекты и методы исследования
Исследования были проведены на сазанах (Cyprinus carpio) (30 особей) и лягушках (Rana ridibunda) (30 особей). В работе использовали периферическую кровь, взятую у наркотизированных эфиром животных. Объектами исследования служили ядерные эритроциты. У сазана кровь брали из хвостовой вены, у лягушки - из сердца. В качестве антикоагулянта использовали гепарин в количестве 10 ед./мл. Полученную кровь центрифугировали 4 мин. при 400 g, отбирали суспензию эритроцитов.
Оценку относительной микровязкости мембран красных клеток крови осуществляли методом латеральной диффузии гидрофобного зонда пирена (C16H10) [15]. Суспензию эритроцитов разводили физиологическим раствором до оптической плотности 0.700 ед. (в 0.5 см кювете при длине волны поглощения 650 нм). Инкубацию суспензии клеток с пиреном (Koh Light) (3 мкМ на 1 мл суспензии) проводили при комнатной температуре в течение 1 мин. при постоянном встряхивании. Коэффициент эксимеризации пирена (Fa/F,«) рассчитывали по отношению интенсивности флуоресценции эксимеров (длина волны испускания 470 нм) и мономеров (длина волны испускания 395 нм). Данный коэффициент находится в обратной зависимости от относительной микровязкости [16]. Микровязкость липидного бислоя эритроци-
С.Д. Чернявских, С.В. Недопекина
Белгородский государственный национальный исследовательский университет, Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85
Е-mail: nedopekina_sv@mail.ru
тарных мембран оценивали при длине волны возбуждения 334 нм, микровязкость зон белок-липидных контактов - при 286 нм. Полярность липидного бислоя и зон белок-липидных контактов мембран эритроцитов оценивали по соотношению интенсивности флуоресценции двух мономерных форм F372/F393 в тонкой структуре пирена при длинах возбуждения 334 и 286 нм соответственно. Спектры флюоресценции регистрировали на спектрофотометре СФ-56 (Ломо Спектр, г. Санкт-Петербург).
Сорбционную способность эритроцитарных мембран (ССЭ) определяли по степени поглощения красителя (метиленовый синий) эритроцитарной массой [17]. К 1 мл суспензии эритроцитов добавляли 3 мл 0.025%-ного раствора метиленового синего, инкубировали 3 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 400 g в течение 4 мин. С помощью ФЭК при длине волны 630 нм определяли оптическую плотность исходного раствора и надосадочной жидкости в единицах экстинкции по отношению к изотоническому раствору NaCl [18]. Сорбционную способность эритроцитов рассчитывали по формуле:
ссэ = loo - cх '100,
b
где B - оптическая плотность красителя до инкубации с эритроцитами, Сх - оптическая плотность надосадочной жидкости.
Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики. С помощью компьютерных программ Excel 7.0 и Statistica 6.0 вычисляли значение средней арифметической выборочной совокупности (M) и стандартной ошибки среднего значения (m). С использованием непарного (двухвыборочного) t-критерия Стьюдента определяли достоверность различий между значениями признаков сравниваемых групп. За уровень статистически значимых принимали изменения при р<0.05 [19].
Результаты и их обсуждение
Результаты исследования относительной микровязкости и полярности мембран эритроцитов Cyprinus carpió в разные сезоны года приведены в табл. 1.
Таблица 1
Коэффициенты, характеризующие относительную микровязкость и полярность мембран эритроцитов Cyprinus carpió в разные сезоны года
Коэффициенты эксимеризации пирена, ед. изм. Сезон года
Осень Зима Весна Лето
Fa/FM(334), усл. ед. X10-3 3.6±0.4 3.3±0.3 2.5±0.1 *® 7.1±0.1 *®#
F3/Fm(286), усл. ед. X10-3 4.2±0.1 6.0±0.5 * 4.2±0.1 ® 3.7±0.1 *®#
F372/F393(334), усл. ед. X10-4 0.8±0.1 0.8±0.1 0.6±0.1 2.1±0.1 *®#
F372/F393(286), усл. ед. X10-4 1.5±0.1 1.5±0.1 1.1±0.1 *® 1.1±0.1 *®
Примечание (здесь и в табл. 2-3). Достоверность различий: * - по сравнению с осенним периодом, ® - по сравнению с зимним периодом, # - по сравнению с весенним периодом по t-критерию Стьюдента (р<0.05).
Как видно из таблицы, коэффициент эксимеризации пирена Fo/Fm^), характеризующий текучесть липидного бислоя мембраны эритроцитов сазана, в зимний период практически не изменяется по сравнению с осенним сезоном. Весной наблюдается уменьшение данного показателя на 31% по сравнению с осенью, летом - увеличение в 2 раза по сравнению с осенью и зимой и практически в 3 раза по сравнению с весной.
Коэффициент эксимеризации пирена в зоне белок -липидных контактов F3/Fm(286) в зимний период по сравнению с осенним повышается на 43%. Весной наблюдается снижение текучести мембраны эритроцитов сазана в зоне белок-липидных контактов на 30% по сравнению с зимним сезоном. Данный показатель уменьшается летом на 22% по сравнению с осенью и весной и на 38% по сравнению с зимой.
Полярность липидного бислоя мембран эритроцитов Cyprinus carpió в зимний и весенний периоды по сравнению с осенью достоверно не изменяется. Летом параметр F372/f393(334) возрастает практически в 3 раза по сравнению с другими периодами, полярность липидного бислоя соответственно снижается.
Показатель полярности зоны аннулярных липидов в зимний период также достоверно не изменяется по сравнению с осенью. Весной и летом параметр F372/F393(286) на 27% ниже, чем осенью и зимой, что свидетельствует об увеличении полярности в зоне аннулярных липидов.
Таким образом, относительная микровязкость и полярность липидного бислоя эритро-цитарных мембран у сазана изменяются по сезонам: самые низкие значения показателей отмечаются летом, самые высокие - весной. В зоне белок-липидных контактов значения вышеназванных показателей в летний период, напротив, самые высокие, в зимний - самые низкие.
Результаты исследования относительной микровязкости и полярности мембран эритроцитов лягушки в различные сезоны года приведены в таблице 2.
Таблица 2
Коэффициенты, характеризующие относительную микровязкость и полярность мембран эритроцитов Rana ridibunda в разные сезоны года
Коэффициенты эксимеризации пирена, ед. изм. Сезон года
Осень Зима Весна Лето
Fa/FM(334), усл. ед. Х10-3 25.4±0.9 38.7±1.2 * 10.9±1.0 *® 11.2±1.7 *®
F3/FM(286), усл. ед. Х10-3 53.7±2.3 58.6±1.8 38.8±5.5 *® 33.0±7.4 *®
F372/F393C334), усл. ед. Х10-4 2.8±0.2 3.8±0.1 * 3.0±0.3 ® 2.6±0.3 ®
F.372/F.393(286), усл. ед. Х10-4 2б.3±0.1 27.9±0.2 * 10.7±1.5 ® 7.7±1.5 *®
Как видно из таблицы, показатель текучести липидного бислоя мембраны эритроцитов лягушки в зимний период увеличивается на 52%, в весенний и летний периоды снижается на 57 и 56% по сравнению с осенним сезоном. В весенний и летний периоды данный показатель ниже, чем в зимний сезон на 72 и 71%, соответственно.
Текучесть мембраны эритроцитов Rana ridibunda в зоне белок-липидных контактов весной и летом уменьшается на 28 и 39% по сравнению с осенью и на 34 и 44% - по сравнению с зимой.
Значение параметра F.72/F.93(334) в зимний период по сравнению с осенью повышается на 36%, что свидетельствует о снижении полярности в зоне белок-липидных контактов эритро-цитарной мембраны лягушек. В весенний и летний периоды наблюдается уменьшение значения данного показателя на 21 и 32% по сравнению с зимним сезоном.
Параметр полярности зоны аннулярных липидов у красных клеток крови Rana ridibun-da в зимний период увеличивается на 6%, в весенний и летний сезоны - снижается на 59 и 71% соответственно по сравнению с осенним периодом. Весной и летом показатель F372/F393(286) на 62 и 72% ниже, чем зимой, полярность в зоне аннулярных липидов соответственно выше.
Таким образом, микровязкость и полярность липидного бислоя и зоны белок-липидных контактов мембран Rana ridibunda также, как и у Cyprinus carpio, изменяются по сезонам: самые высокие значения отмечаются летом, самые низкие - зимой. Низкие значения показателей микровязкости мембраны эритроцитов в зимний период свидетельствуют о высокой функциональной активности клеток изучаемого пула у лягушки озерной в этот сезон года [20].
Результаты исследования ССЭ Cyprinus carpio и Rana ridibunda в разные периоды года приведены в таблице 3.
Таблица 3
Сорбционная способность мембран эритроцитов Cyprinus carpio и Rana ridibunda
в разные сезоны года
Вид животного Сезон года
Осень Зима Весна Лето
Cyprinus carpio 78.01±1.31 90.82±0.27 * 95.27±1.13 *® 99.14±0.13 *®#
Rana ridibunda 93.20±1.21 93.18±0.99 83.75 ±0.79 *® 81.51±0.2 *®#
У сазана в зимний, весенний и летний периоды сорбционная способность эритроцитар-ной мембраны повышается на 16, 22 и 27% по сравнению с осенью. Весной и летом значение данного показателя на 5 и 9% выше, чем зимой. Летом сорбционная способность мембраны эритроцитов Cyprinus carpio увеличивается на 4% по сравнению с весной.
Показатели сорбционной способности мембран эритроцитов Rana ridibunda одинаково высокие в осенний и зимний сезоны. Весной ССЭ лягушки ниже на 10 и 10% по сравнению с осенью и зимой. В летний период показатель сорбционной способности эритроцитов лягушки уменьшается на 12% по сравнению с осенью и зимой и на 3% по сравнению с весной.
Таким образом, значения показателя сорбционной способности красных клеток крови в весенний и, особенно, в летний периоды у сазана повышаются, у лягушек - снижаются по
сравнению с осенним и зимним сезонами [21]. Соответственно, у Cyprinus carpió в весенний и летний сезоны, у Rana ridibunda - в осенний и зимний периоды более высокие значения данного показателя могут способствовать улучшению адсорбции и удалению токсинов, продуктов метаболизма, а также иммунных комплексов [17].
Выводы
1. Относительная микровязкость, полярность и сорбционная способность эритроцитар-ных мембран у Cyprinus carpió и Rana ridibunda изменяются по сезонам.
2. У сазана самые высокие значения показателей микровязкости и полярности в ли-пидном бислое мембран эритроцитов регистрируются весной, самые низкие - летом, в зоне белок-липидных контактов - летом и зимой соответственно. У лягушки самые высокие значения микровязкости и полярности как липидной фазы, так и зоны аннулярных липидов эрит-роцитарных мембран отмечаются летом, самые низкие - зимой.
3. Сорбционная способность красных клеток крови в весенний и, особенно, в летний периоды у сазана повышается, у лягушки - снижается по сравнению с осенним и зимним сезонами.
Список литературы
1. Болдырев А.А. Введение в биомембранологию. - М.: Изд-во Московского университета, 1990. -
208 с.
2. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. -М.: Наука, 1972. - 252 с.
3. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного бислоя. - М.: Наука, 1981. -
296 с.
4. Molecular Biology Of The Cell / B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis et al. - 5th ed. - New York: Garland Science, 2007. - 364 p.
5. Мэдди Э. Биохимическое исследование мембран. - М.: Мир, 1979. - 460 с.
6. Изменение микровязкости мембран лимфоцитов и эритроцитов крови у онкологических больных / И.А. Горошинская, Л.Ю. Глотина, Е.И. Горло и др. // Вопр. мед. химии. - 1999. - Т. 45. - № 1. -C. 53-57.
7. Влияние плеторического введения перфторана на параметры структурно-функционального состояния мембран эритроцитов/ Н.Б. Кармен, Н.П. Милютина, А.А. Орлов и др. // Росс. биомед. журн. -2004. - Т. 5. - С. 128-129.
8. Изучение структурных свойств мембраны эритроцитов методом флуоресцентного зондирования в динамике нитритной метгемоглобинемии / О.Н. Филиппова, И.А. Шперлинг, В.В. Новицкий и др. // Фундамент. исследования. - 2005. - № 4. - С. 90-91.
9. Луценко М.Т., Андриевская И.А., Ишутина Н.А. Изменение микровязкости мембран эритроцитов периферической крови при обострении герпес-вирусной инфекции у беременных // Инф. и сист. управления. - 2010. - № 2 (24). - С. 98-100.
10. Изменения физико-химических свойств биологических мембран при развитии толерантности к этанолу / С.А. Сторожок, Л.Ф. Панченко, Ю.Д. Филиппович, В.С. Глушков / / Вопр. мед. химии. - 2001. -Т. 47. - № 2 - С. 198-208.
11. Изменения структурно-функционального состояния мембран эритроцитов у онкологических больных / Л.М. Гунина, А.П. Кабан, В.М. Войницкий, Л.Е. Шевченко // II съезд биофизиков России. Тезисы. Раздел 9. Мед. биофизика. - М., 1999. - С. 665-666.
12. Гунина Л.М., Кабан А.П., Коробко В.Б. Роль изменений структурно-функционального состояния мембраны эритроцита в развитии анемии у больных раком желудка // Онкология. - 2000. - Т. 2. -№4. - С. 247-249.
13. Добротина Н.А., Копытова Т.В., Щелчкова Н.А. Характеристика функционального состояния мембран эритроцитов при эндогенной интоксикации у больных хроническими распространенными дерматозами // Успехи совр. естествознания. - 2010. - № 2. - С. 39-43.
14. Сравнительная характеристика функциональных параметров эритроцитов крови больных хроническим пиелонефритом и гломерулонефритом / Л.Е. Муравлёва, В.Б. Молотов-Лучанский, Д.А. Клюев и др. // Совр. пробл. науки и образования. - 2011. - № 2. - С. 74-77.
15. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. - М.: Наука, 1980. - 320 с.
16. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. -М.: Наука, 1989. - 227 с.
17. Додхоев Д.С. Особенности проницаемости эритроцитарных мембран и сорбционная способность эритроцитов у здоровых доношенных новорожденных детей и их матерей // Физиол. человека. -1998. - Т. 24. - № 2. - С. 135-137.
18 .Сим Э. Биохимия мембран: Пер. с англ. - М.: Мир, 1985. - 110 с.
19. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высш. школа, 1990. - 352 с.
20. Камкин А.Г., Киселева И.С. Физиология и молекулярная биология мембран клеток. - М.: Изд. центр «Академия», 2008. - 592 с.
21. Недопёкина С.В., Нгуен Тхи Тьук, То Тхи Бик Тхуи Структурно-функциональные особенности мембран ядерных эритроцитов // Сборник научн. Трудов 16 междунар. Путинской школы-конференции «Биология наука XXI века». - Пущино, 2012. - С. 432-433-
SEASONAL FLUCTUATIONS OF THE RELATIVE MICROVISCOSITY, POLARITY AND SORPTION CAPABILITY OF CYPRINUS CARPIOAND RANA RIDIBUNDAS ERYTHROCYTE MEMBRANES
S.D. Chernyavskikh, S.V. Nedopekina
Belgorod State National Research University, 85, Pobedy St., Belgorod, 308015, Russia
E-mail: nedopekina_sv@mail.ru
Seasonal fluctuations of the relative microviscosity, polarity and sorption capability of Cyprinus carpio and Rana ridibunda's erythrocyte membranes have been studied. The highest values of relative microviscosity and polarity of carp's erythrocyte membranes have been recorded in the lipid bi-layer in the spring, the lowest - in the summer; respectively, in summer and winter in the area of protein-lipid contact. The frog had the highest values of microviscosity and polarity of both lipid phase and annular lipid area of erythrocyte membrane in summer, the lowest - in winter. Sorption capability parameters of red blood cells of carp rose in spring and, in summer especially; of frogs - reduced compared to fall and winter.
Keywords: relative microviscosity, polarity, sorption capability, erythrocyte membrane, carp, frog.
