CC BY
15
УДК 637:577.213.32
сификации плодово-ягодного сырья апробированы и используются на практике органолептические и некоторые физико-химические методы определения, основанные на таких показателях как, содержание растворимых сухих веществ, состав моно- и дисахаридов, состав и содержание органических кислот, аминокислот и т. д. Однако данные методы анализа не позволяют однозначно определить видовую принадлежность плодово-ягодного сырья в полуфабрикатах и готовой продукции на его основе. Поэтому особую актуальность приобретает разработка современных высокоэффективных методов выявления фальсификаций продукции.
С увеличением темпов роста научно-технического прогресса появились новые экспресс-методы идентификации продовольственного сырья растительного происхождения и пищевой продукции на его основе. Особое место занимают методы, опирающиеся на достижения молекулярной биологии и генетики. Одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии стало открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) [4].
Полимеразная цепная реакция -это метод амплификации (многократное воспроизведение) in vitro, с по-
Влияние технологической обработки
продовольственного сырья
на эффективность видовой идентификации
А.Ю. Просеков, д-р техн. наук, профессор, Ю.В. Голубцова, канд. техн. наук, К.А. Шевякова, аспирант
Кемеровский технологический институт пищевой промышленности
Стремление к здоровому образу жизни в мире привело к тому, что потребители стали уделять больше внимания правильному режиму и рациону питания. В связи с этим вопросы здорового питания практически во всех странах мира возведены в ранг государственной политики [1].
С увеличением объема частного производства и свободной торговли продовольственными товарами, в том числе ягодами, фруктами, овощами и продуктами их переработки, возрастает возможность их фальсификации по структуре и видовой принадлежности. Фальсификация продукции имеет место в любой отрасли промышленности, прежде всего сре-
ди компаний с широкой сетью филиалов [2]. Зачастую пищевые предприятия фальсифицируют плодово-ягодную продукцию, добавляя различные красители и ароматизаторы. Наиболее сложно определить фальсификацию переработанных плодов и ягод. По экономическим соображениям чаще всего фальсифицируют малоценное ягодное сырье, реализуя его как продукцию высокого качества. Вследствие этого развитие и укрепление контроля за качеством и безопасностью продуктов питания становится одним из приоритетных направлений современности [3].
Сегодня для определения видовой принадлежности и выявления фаль-
PROCESSING OF PLANT RAW MATERIALS
Таблица 1
Сравнительная характеристика методик выделения ДНК из продовольственного сырья
Наименование Объект исследования Чистота ДНК при А260/280 Концентрация
набора для выделения ДНК выделенной ДНК, мг/г
С дополнительной Повидло малиновое Повидло земляничное 1,77 1,76 0,35 0,36
экстракцией фенолом Повидло из крыжовника 1,76 0,35
Повидло из шиповника Повидло малиновое 1,76 1,98 0,36 0,39
«ПРОБА-ЦТАБ» Повидло земляничное Повидло из крыжовника 1,99 1,98 0,39 0,40
Повидло из шиповника 2,00 0,39
Повидло малиновое 1,97 0,43
«Сорб-ГМО-А» Повидло земляничное Повидло из крыжовника 1,98 1,97 0,45 0,44
Повидло из шиповника 1,97 0,43
Результаты анализа видовой идентификации при помощи ПЦР
1 2
3
4
5
6
7
Название образца
Повидло малиновое, 100%
Повидло земляничное, 100%
Повидло из крыжовника, 100%
Повидло из шиповника, 100%
Повидло земляничное, 40% вишневого сока
Повидло малиновое, 40% вишневого сока
Повидло из крыжовника, 40% вишневого сока
Повидло из шиповника, 40% вишневого сока
Примечания: 1 - малина (Rubus); 2 - земляника (Fragaria); 3 - крыжовник (Ribes); 4 - шиповник (Rosa); 5 - вишня (Prunus); 6 - банан (Musa); 7 - киви (Actinidia); + - положительный результат исследования; — отрицательный результат исследования.
+
мощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 108 раз. В основе метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-поли-меразы определенного фрагмента ДНК по принципу комплементарнос-ти, который является маркерным для данного вида объекта. ПЦР-анализ состоит из трех основных процедур: подготовка пробы исследуемого материала, которая в большинстве случаев сводится к изоляции ДНК и ее очистке; амплификация (собственно ПЦР) и детекция продуктов амплификации [5].
Популярность ПЦР-анализа кроется в его преимуществах. К основным достоинствам данного метода анализа относят: специфичность, универсальность (могут применяться практически любые материалы), высокая чувствительность (возможно выявлять единичные копии ДНК), малый объем биологического материала (проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы, до не-
Таблица 2
скольких микролитров); высокая скорость получения результата анализа [6].
Цель настоящего исследования -анализ влияния технологической обработки продовольственного сырья на эффективность видовой идентификации с помощью ПЦР-анализа.
В качестве объектов исследования использовали ДНК пищевых продуктов, а именно, повидла (100%-ного), изготовленного на основе следующих ягод: малины, земляники, крыжовника, шиповника.
Извлечения ДНК из продуктов питания на основе растительного сырья осуществляли с использованием различных методов экстракции: 1) метод фенольной экстракции; 2) метод с применением коммерческого набора «ПРОБА-ЦТАБ» (комплект реагентов для выделения растительной ДНК); 3) метод с применением коммерческого набора «Сорб-ГМО-А». Степень чистоты выделенных нуклеиновых кислот, т. е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, определяли с помощью спектрофотометрического метода анализа.
В ходе исследования все рассмотренные методы позволили выделить ДНК из исследуемых образцов независимо от используемого объекта. В табл. 1 дана сравнительная характеристика чистоты выделенной ДНК из продовольственного сырья.
Степень чистоты выделения дезок-сирибонуклеиновых кислот определяли высокочувствительным, простым в исполнении спектрофотометричес-ким методом, основанным на поглощении монохроматического потока световой энергии при прохождении его через исследуемый раствор. Данные, представленные в табл. 1, показывают, что чистота ДНК при А260/280 нм всех категорий фруктово-ягодных смесей при выделении ДНК первым методом составляет от 1,76 до 1,77; вторым и третьим (с применением наборов «ПРОБА-ЦТАБ» и «Сорб-ГМО-А») - от 1,98 до 2,01 и от 1,94 до 1,98 соответственно. При этом концентрация выделенной ДНК составляет при выделении ДНК первым методом от 0,35 до 0,36 , мг/г продукта, вторым - от 0,38 до 0,40 мг/г продукта, третьим - от 0,42 до 0,45.
Следовательно, несмотря на то, что оба коммерческих набора для выделения ДНК позволяют получить растительную ДНК одинаковой чистоты, третий набор обеспечивает выделение более высокого количества ДНК.
Далее исследовали влияние технологической обработки плодово-ягодного сырья на эффективность видовой идентификации с помощью по-лимеразной цепной реакции.
Интерпретацию результатов ПЦР-анализа по определению видовой и родовой принадлежности исследуемых проб проводили при помощи сконструированных положительных контролей. Продукты амплификации положительных контролей на элект-рофореграмме представляли собой яркую четкую полосу. Если на элект-рофореграмме размер ампликонов соответствовал ПЦР-ампликону положительного контроля, то такие образцы считали «положительными», т. е. содержащими ДНК соответствующего объекта плодово-ягодного сырья.
Для контроля реагентов, используемых для ПЦР-анализа, на предмет контаминации ампликонами применяли отрицательный контроль, с использованием ионизованной воды. В электрофоретической дорожке с отрицательным контролем окрашенные полосы должны были отсутствовать. Допускалось присутствие только одной слабо окрашенной полосы, формирующейся неиспользованными в ходе ПЦР праймерами и составляющей по размеру менее 50 п.н. В противном случае результаты
ПЕРЕРАБОТКА РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
ТЕМА НОМЕРА
ПЦР-анализа считали недостоверными.
В случаях, когда в ходе электрофо-ретического анализа ПЦР-продуктов из какой-либо пробы был получен неоднозначный результат (слабая окраска, диффузное размывание полос и пр.), проводили повторную амплификацию с той же пробой ДНК. Результаты проведения ПЦР принимали недостоверными, если:
в дорожке с внутренним положительным контролем отсутствовал фрагмент ДНК указанного размера;
в дорожке с отрицательным контролем присутствовала специфическая полоса;
в электрофоретических дорожках присутствовали неспецифические полосы различного размера.
Результаты проведения полимераз-ной цепной реакции приведены в табл. 2.
Анализ экспериментальных данных, представленных в табл. 2, гово-
рит о высокой специфичности и эффективности метода полимеразной цепной реакции при установлении видовой идентификации продовольственного сырья.
Таким образом, общий анализ экспериментальных данных позволил определить наиболее производительный способ экстракции ДНК. Установлено, что условия обработки продовольственного сырья не влияют на эффективность ПЦР-методов видовой идентификации. Проведенные исследования представляют значительный научный и практический интерес при разработке новой методики идентификации видовой принадлежности растительного сырья и многокомпонентных продуктов питания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Изотова, А.В. Современные подходы к повышению пищевой и биологической ценности творога и тво-
рожных изделий / А.В. Изотова // Материалы конференции «Актуальные вопросы современной торговли». - Хабаровск: РИЦ ХГАЭП, 2006. -С. 27.
2. Чепурна, И.П. Идентификация и фальсификация продовольственных товаров / И.П. Чепурна. - М.: Дашков и К0, 2007. - 448 с.
3. Тимофеева, В.А. Товароведение продовольственных товаров / В.А. Тимофеева. - 6-е изд., перераб. и доп.- М.: Феникс, 2006.- 363 с.
4. Просеков, А.Ю. Современные методы исследования сырья и биотехнологической продукции / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич, С.А. Сухих. -Кемерово, 2013. - 183 с.
5. Зорина, В.В. Основы полимеразной цепной реакции / В.В. Зорина. -М., 2012. - 78 с.
6. Просеков, А.Ю. Генная инженерия / А.Ю. Просеков, О.О. Бабич. -М.: Достижения науки и техники АПК, 2010. - 216 с.
Влияние технологической обработки продовольственного сырья на эффективность видовой идентификации
Ключевые слова
выделение, идентификация, методика, ДНК, полимеразная цепная реакция, продовольственное сырье.
Реферат
Вопросы безопасности и качества продукции, а также совершенствования методов их контроля являются чрезвычайно актуальными. Прогресс в освоении методов ДНК-диагностики послужил стимулом для разработки и внедрения в практику высокочувствительных методик оценки качества и экспертизы продуктов питания, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР - это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул. В последние годы принцип специфической ДНК-амплификации начали активно применять при разработке методов достоверного определения видовой принадлежности растительного сырья и многокомпонентных продуктов. По сравнению с традиционными способами видовой детекции, установление видовой принадлежности растительного сырья при помощи ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем видовой дифференциации, высокой воспроизводимостью и возможностью качественного и количественного анализа. Практическое применение методов ДНК-диагностики для идентификации продовольственного сырья в продуктах питания имеет важное теоретическое и большое прикладное значение, так как позволяет поднять контроль качества и безопасности реализуемой пищевой продукции на новый уровень. В исследовании проведен сравнительный анализ методик выделения нуклеиновых кислот продовольственного сырья. На основании полученных данных предложен наиболее производительный метод выделения растительной ДНК из объектов исследования. Установлена эффективность видовой идентификации методом полимеразной цепной реакции.
Авторы
Просеков Александр Юрьевич, д-р техн. наук, профессор, Голубцова Юлия Владимировна, канд. техн. наук, Шевякова Ксения Александровна, аспирант, Кемеровский технологический институт пищевой промышленности, 650056, г. Кемерово, б-р Строителей, 47, [email protected], [email protected], кБепуа[email protected]
Influence of Technological Raw Food Treatment on the Effectiveness of Species Identification
Key words
food raw materials, identification, technique, DNA, polymerase chain reaction, isolation.
Abstracts
The problem of quality is always topical and constant in its essence. Currently the problems of safety and quality of products, as well as improvement of control methods are extremely urgent for the Russian food industry. The progress in adoption of DNA diagnostic methods stimulated development and implementations of highly sensitive evaluation techniques and examination of food, based on PCR. PCR is a refined method imitating natural DNA replication and allowing finding the single specific DNA molecule in the presence of millions of other molecules. In recent years, the principle of specific DNA amplification was actively used in the development of methods for the reliable determination of the species affiliation of vegetable raw materials and multicomponent products. In comparison with the conventional methods of the species detection, the PCR method is notable for its universality, deep state of species differentiation, high repeatability and ability to the quality and quantity analysis. The practical use of the DNA diagnostic methods for the identification of the used raw materials in food products has important theoretical and applied value, as these methods will allow raising the food quality and safety to a new level. Comparative analysis methods of the isolation of nucleic acids was conducted. Based on the obtained data, the most efficient method for isolating plant DNA from research objects was presented. The efficiency of species identification by polymerase chain reaction was determined.
Authors
Prosekov Alexandr Yuryevich, Doctor of Technical Science, Professor, Golubtsova Yuliya Vladimirovna, Candidate of Technical Science,
Shevyakova Kseniya Alexandrovna, Graduate Student, Kemerovo Technological Institute of Food Industry, 47, Bulvar Stroiteley, Kemerovo, 650056, [email protected], [email protected], [email protected]
