CC BY
30
ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ АНАТОМИЯ
УДК 614.4+616-036.22(045) DOI 10.21685/2072-3032-2019-4-14
Н. А. Дуденкова, О. С. Шубина
ВЛИЯНИЕ СВИНЦОВОЙ ИНТОКСИКАЦИИ НА МУЖСКИЕ ПОЛОВЫЕ КЛЕТКИ БЕЛЫХ КРЫС1
Аннотация.
Актуальность и цели. Актуальность настоящего исследования обусловлена наблюдающейся в последнее время во многих развитых странах выраженной тенденции к снижению рождаемости, одной из причин которой является нарушение сперматогенеза у взрослых мужчин. Несмотря на большое количество исследований, посвященных изучению подверженности мужских семенных желез различным негативным факторам, к которым относятся и тяжелые металлы, многие вопросы до сих пор остаются нерешенными. Не выяснен вопрос о влиянии солей свинца на качественные и количественные характеристики сперматозоидов. Целью работы явилось исследование жизнеспособности, а также количественных и качественных изменений эпидидимальных сперматозоидов самцов белых крыс при свинцовой интоксикации, влияющей на их репродуктивность.
Материалы и методы. Материалом исследования служили эпидидимальные сперматозоиды белых крыс-самцов полученные из придатка семенника. Измерение концентрации живых и мертвых сперматозоидов проводили с помощью автоматического счетчика клеток Countess™ (Invitrogen, США). Изучение морфологических и морфометрических показателей эпидидимальных сперматозоидов самцов белых крыс осуществлялось с применением цифрового микроскопа Axio Imager.M2 (ZEISS, Япония).
Результаты. В ходе проведенных исследований показано, что у животных подопытной группы под действием ацетата свинца по сравнению с контролем происходит уменьшение концентрации живых сперматозоидов, существенно изменены их морфологические и морфометрические характеристики.
Выводы. Полученные результаты исследований свидетельствуют о неблагоприятном влиянии ацетата свинца на мужские половые клетки самцов белых крыс, приводящие к снижению их жизнеспособности.
Ключевые слова: семенные железы (семенники), придаток семенника (эпидидимис), эпидидимальные сперматозоиды, свинцовая интоксикация
1 Исследование выполнено в рамках гранта на проведение научно-исследовательских работ по приоритетным направлениям научной деятельности вузов-партнеров по сетевому взаимодействию (Пермский государственный гуманитарно-педагогический университет и Мордовский государственный педагогический институт им. М. Е. Евсевьева) по теме «Влияние тяжелых металлов на функциональное состояние репродуктивной системы человека и животных». © Дуденкова Н. А., Шубина О. С., 2019. Данная статья доступна по условиям всемирной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая дает разрешение на неограниченное использование, копирование на любые носители при условии указания авторства, источника и ссылки на лицензию Creative Commons, а также изменений, если таковые имеют место.
N. A. Dudenkova, O. S. Shubina
INFLUENCE OF LEAD INTOXICATION ON MEN WHITE RAT SEX CELLS
Abstract.
Background. The urgency of our study due to the recently observed in many developed countries marked downward trend in the birth rate, one of the causes of which is the disruption of spermatogenesis in adult males. Despite a large number of studies on the susceptibility of male seminal glands to various negative factors, which include heavy metals, many questions still remain unresolved. The question of the influence of lead salts on the qualitative and quantitative characteristics of spermatozoa is unclear. The aim of the work was to study the viability, as well as quantitative and qualitative changes in epididymal spermatozoa of male white rats with lead intoxication affecting their reproduction.
Material and methods. The study material was the epididymal spermatozoa of white male rats obtained from the epididymis. The concentration of live and dead spermatozoa was measured using an automatic Countess ™ cell counter (Invitrogen, USA). The morphological and morphometric parameters of the epididymal spermatozoa of male white rats were studied using an Axio Imager.M2 digital microscope (ZEISS, Japan).
Results. In the course of the studies it was shown that in animals of the experimental group under the action of lead acetate in comparison with the control there is a decrease in the concentration of living sperm, their morphological and morpho-metric characteristics were significantly changed.
Conclusions. The results of studies indicate an adverse effect of lead acetate on male sex cells of male white rats, leading to a decrease in their viability.
Keyword: seminal glands (testes), appendage of the testis (epididymis), epidid-ymal spermatozoa, lead intoxication.
Введение
С наступлением половой зрелости в мужских половых железах (семенниках) начинается процесс сперматогенеза - процесс созревания сперматозоидов (мужских половых клеток) [1]. Многими исследованиями уже было доказано, что он чрезвычайно чувствителен к множеству повреждающих факторов, к которым относится и воздействие тяжелых металлов, в частности свинца [2, 3].
В проведенных нами ранее гистологических исследованиях было обнаружено, что воздействие солей свинца приводит к снижению численности всех популяций половых клеток в семенниках самцов белых крыс [4, 5], и в первую очередь страдают зрелые формы половых клеток и стволовые клетки [6-8].
Актуальность настоящего исследования обусловлена наблюдающейся в последнее время во многих развитых странах выраженной тенденцией к снижению рождаемости, одной из причин которой является нарушение сперматогенеза у взрослых мужчин. Несмотря на большое количество исследований, посвященных изучению подверженности мужских семенных желез различным негативным факторам, к которым относятся и тяжелые металлы, многие вопросы до сих пор остаются нерешенными, в частности их влияние на мужские половые клетки (сперматозоиды).
Поэтому целью работы явилось исследование жизнеспособности, а также количественных и качественных изменений эпидидимальных сперматозоидов самцов белых крыс при свинцовой интоксикации, влияющей на их репродуктивность.
Материал и методы исследования
Проведенный нами эксперимент был осуществлен на белых самцах крыс линии Вистар (n = 50) в возрасте от 2-х месяцев, так как согласно литературным данным именно в этот период у крыс наступает период полового созревания [9], разделенных на две группы: контрольную (n = 25) и получавшую в течение 7 сут перорально (путем проглатывания) тригидрат ацетата свинца 3-водный Pb(CH3COO)2 х 3H2O в среднетоксической дозе (согласно литературным данным), равной 45 мг/кг/сут (в пересчете на свинец).
Суммарная концентрация свинца, полученная крысой за время эксперимента, соответствовала дозе, которую человек получает за год, находясь в рабочей зоне производства, связанного со свинцом (ГН 2.2.5.686-98 Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны).
Для проведения исследования в качестве подопытных животных нами были выбраны крысы, поскольку у них с человеком примерно сходное строение мужских половых желез, а также протекание в них процесса образования мужских половых клеток [10].
Животных содержали в соответствии с правилами Европейской конвенции о защите животных (Страсбург, 18 марта 1986 г.).
Животные забивались путем декапитации под наркозом эфира с хлороформом в соотношении 1:1 по общепринятой методике и с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС), Хельсинкской декларации, и в соответствии с необходимыми требованиями правил проведения работ с использованием экспериментальных позвоночных животных
Материал для исследования - суспензия эпидидимальных сперматозоидов белых крыс-самцов, полученная из придатка семенника.
Суспензию эпидидимaльных сперматозоидов получали хирургическим путем из эпидидимиса (придатка семенника) вскрытого продольно.
При проведении исследований использовались морфологические, мор-фометрические и статистические методы исследования.
Измерение концентрации живых и мертвых сперматозоидов проводили с помощью автоматического счетчика клеток Countess™ (Invitrogen, США).
Из-за густой консистенции суспензии сперматозоидов для проведения исследования приготавливалась смесь сперматозоидов с физрaствором в концентрации 1:4 [11, 12].
Так как эпидидимальные сперматозоиды быстро погибают в кислой среде физраствора в течение 5-7 мин, осуществлялось окрашивание смеси красителем трипановый синий на предметном стекле (смешивали 1,0 мл суспензии с каплей тритнового синего). Из полученной смеси брали 1,0 мл раствора и вводили в блок-стекла для подсчета клеток (ph = 5,5).
Краситель тритновый синий окрашивает живые клетки по краям, а мертвые клетки - однородно по всей клетке [13].
Для определения концентрации живых и мертвых клеток из полученного раствора брали 1,0 мл и вводили в блок-стекла. Блок-стекло помещали в автоматический счетчик клеток Countess™ (Invitrogen, США), который показывал на экране концентрацию живых и мертвых клеток. Диапазон измерений простирался до 1*107 клеток/мл. Исследование проводили при увеличении прибора об. 100 х ок. 2,3.
Исходя из полученных данных (концентрация живых и мертвых клеток) подсчитывались общая концентрация эпидидимальных сперматозоидов в 1 мл суспензии и жизнеспособность эпидидимальных сперматозоидов по следующей системе уравнений:
a + b = c,
> a
I- -100% = d %, . b
где а - концентрация живых эпидидимальных сперматозоидов в 1 мл суспензии (х107 клеток/мл); b - концентрация мертвых эпидидимальных сперматозоидов в 1 мл суспензии (х107 клеток/мл); с - общая концентрация эпидидимальных сперматозоидов в 1 мл суспензии (х107 клеток/мл); d - жизнеспособность эпидидимальных сперматозоидов (рассчитывалась как процентное содержание живых эпидидимальных сперматозоидов от их общей концентрации).
Для анализа морфологических и морфометрических параметров мазки эпидидимальных сперматозоидов исследовали на предметном стекле.
Прибор доя исследования - цифровой микроскоп Axio Imager.M2 (ZEISS, Япония).
Увеличение, на котором производилось исследование - об. 40х ок.10.
Определяли следующие морфометрические параметры эпидидимальных сперматозоидов: площадь головки, длину хвостовой части и ширину шейки.
Фотосъемку микропрепаратов производили цифровой камерой AxioCam MRc5 (ZEISS, Япония), встроенной в микроскоп.
В последующем проводилась обработка изображения в лицензированной компьютерной программе Abode Photoshop Elements 11.
Полученные результаты статистически обрабатывали с помощью программы Microsoft Excel, достоверность оценивали по /-критерию Стьюдента.
Уровень значимости показателей Р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Проведенные исследования мазков суспензии эпидидимальных сперматозоидов показали, что они имеют четкое разделение на составляющие: головку, шейку и изогнутый хвост. Головка сперматозоидов белых крыс имеет слегка изогнутую форму, похожую на форму крючка (рис. 1).
Исследования, проводимые на автоматическом счетчике клеток Countess™ (Invitrogen, США), показали, что концентрация живых эпидиди-мальных сперматозоидов в контрольной группе животных составила 7,04 ± 0,12, х107 клеток/мл, мертвых - 0,92 ± 0,07, х107 клеток/мл.
Дальнейшее использование системы уравнений позволило подсчитать общую концентрацию живых эпидидимальных сперматозоидов в 1 мл суспензии и их жизнеспособность, что составило соответственно 7,96 ± ± 0,45х107 клеток/мл и 88,62 ± 3,48 %.
После 7 сут воздействия ацетата свинца суспензия сперматозоидов, по сравнению с контролем, приобрела более прозрачный цвет, имела сравнительно низкую вязкость. При более детальном рассмотрении мазков нами были обнаружены обрывы хвостов эпидидимальных сперматозоидов. Наблюдалась их агглютинация (рис. 2).
б)
Рис. 1. Эпидидимальные сперматозоиды белых крыс-самцов (контроль): а - окраска трипановый синий при увеличении об. 100 х ок. 2,3; б - мазок на предметном стекле. Увел. об. 40 х ок. 10
После 7 дней воздействия ацетата свинца концентрация живых сперматозоидов по сравнению с контролем уменьшилась до 1,59 ± 0,09, х107 кле-
ток/мл, т.е. на 77,41 % (Р < 0,05), а концентрация мертвых сперматозоидов увеличилась до 2,34 ± 0,14, х107 клеток/мл, т.е. на 60,68 % (Р < 0,05).
После проведенного эксперимента нами было отмечено, что после 7 дней воздействия ацетата свинца общая концентрация эпидидимальных сперматозоидов в 1 мл суспензии уменьшается по сравнению с контролем на 50,63 % (Р < 0,05) - до 3,93 ± 0,11, х107 клеток/мл. Жизнеспособность эпидидимальных сперматозоидов снижается на 53,05 % (Р < 0,05) (рис. 3, 4).
б)
Рис. 2. Эпидидимальные сперматозоиды белых крыс-самцов (опыт): а - окраска трипановый синий при увеличении об. 100 х ок. 2,3; б - мазок на предметном стекле. Увел. об. 40 х ок. 10; 1 - обрывы хвостов; 2 - агглютинация сперматозоидов
В проведенном нами исследовании морфометрические данные показали, что, по сравнению с контрольной, в опытной группе животных у сперматозоидов происходит уменьшение площади головки и ширины шейки соответственно на 16,99 % (Р < 0,05) и 13,60 % (Р < 0,05). При этом одновременно происходит увеличение длины хвостовой части на 9,39 % (Р < 0,05) (табл. 1).
'Т "Т
ч
7,96
3,93
7,04
IJ, г0,921 1Л
Рис. 3. Репродуктивность белых крыс-самцов в норме и после 7 дней воздействия ацетата свинца (1 мл суспензии) : □ - контроль; □ - опыт; 1 - показатель общей концентрации эпидидимальных сперматозоидов в суспензии, х107 клеток/мл; 2 - показатель концентрации живых эпидидимальных сперматозоидов, х107 клеток/мл; 3 - показатель концентрации мертвых эпидидимальных сперматозоидов, х107 клеток/мл
40 35 30 25 20 15 10
/ / -
38,6
/ ¿- 30,6
/ / 20,4 27,4 -
/ — -
/ — -
/
—^
□ Живые сперматозоиды
□ Мертвые сперматозоиды
Контроль
Опыт
Рис. 4. Жизнеспособность сперматозоидов самцов белых крыс в норме и после 7 сут перорального воздействия тригидрата ацетата свинца 3-водный РЬ(СН3СОО)2 х 3Н20, доза 45 мг/кг/сут (в пересчете на свинец), %
Таблица 1
Морфометрические показатели эпидимальных сперматозоидов белых крыс-самцов
3
0
Показатель Контроль Опыт
Площадь головки эпидидимального сперматозоида, д 2 185,86 i 6,49 158,86 i 2,93*
Длина хвостовой части эпидидимального сперматозоида, д 300,64 i 11,18 328,86 i 8,95*
Ширина шейки эпидидимального сперматозоида, д 6,60 i 0,68 5,81 i 0,27*
Примечание. * - достоверно по отношению к контролю Р < 0,05.
Заключение
После проведенного исследования было выяснено, что у животных, подвергнутых свинцовой интоксикации в течение 7 дней, по сравнению с контрольной группой происходит:
1) уменьшение концентрации и жизнеспособности сперматозоидов;
2) уменьшение концентрации живых сперматозоидов при одновременном увеличении их концентрации, что может свидетельствовать об уменьшении их фертильности;
3) уменьшение размеров головки эпидидимальных сперматозоидов на 16,99 % (Р < 0,05);
4) при рассмотрении мазков наблюдаются обрывы хвостов и агглютинация сперматозоидов, что может быть следствием нарушения развития сперматогенного эпителия и свидетельствовать о развитии различных патологических процессов в придатках семенников у экспериментальных животных.
Наблюдаемые морфологические и морфометрические изменения эпи-дидимальных сперматозоидов могут быть следствием нарушения развития сперматогенного эпителия и свидетельствовать о развитии патологических процессов в придатках семенников у экспериментальных животных.
Библиографический список
1. Самусев, Р. П. Железы внутренней секреции / Р. П. Самусев, Е. В. Зубарева. -Москва : Мир и образование, 2011. - 144 с.
2. Влияние химических факторов на состояние мужской репродуктивной системы (обзор литературы) / Д. Л. Луцкий, С. В. Выборнов, А. М. Луцкая, Л. А. Гончарова, Р. М. Махмудов // Проблемы репродукции. - 2009. - № 6. - С. 48-64.
3. Роль тяжелых металлов в возникновении репродуктивных нарушений / Н. М. Па-ранько, Н. И. Рублевская, Э. Н. Белицкая, Т. А. Головкова, Т. Д. Землякова, Л. Е. Чуб, Г. Г. Шматков // Гигиена и санитария. - 2002. - № 1. - С. 28-30.
4. Дуденкова, Н. А. Изменения морфофункционального состояния и продуктивности семенных желез белых крыс при воздействии ацетата свинца / Н. А. Дуденкова, О. С. Шубина // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 10, ч. 6. -С. 1253-1259.
5. Дуденкова, Н. А. Морфофункциональные изменения сустентоцитов семенников самцов белых крыс при воздействии свинцовой интоксикации / Н. А. Дуден-кова // Молодежь и наука XXI века : материалы Междунар. науч. конф. (Ульяновск, 13 декабря 2018 г.). - Ульяновск : УлГАУ, 2018. - Т. II. - С. 406-409.
6. Shubina, O. S. The effect of lead on the process of spermatogenesis in sex glands of male albino rats / O. S. Shubina, N. A. Dudenkova // Veterinary World. - 2016. -Vol. 9, № 10. - P. 1129-1134.
7. Дуденкова, Н. А. Морфологические особенности строения семенников самцов белых крыс в период постнатального онтогенеза / Н. А. Дуденкова, О. С. Шубина // Врач-аспирант. - 2015. - № 5 (72). - С. 31-40.
8. Ласьков, Д. С. Особенности морфофункциональных характеристик сперматозоидов у потомства самок крыс с экспериментальным поражением печени алкогольного генеза / Д. С. Ласьков, Г. В. Брюхин, М. Л. Сизоненко, Е. А. Алымов // Проблемы репродукции. - 2014. - № 2. - С. 18-22.
9. Шаляпина, В. Г. Эндокринология репродукции : учеб. пособие / В. Г. Шаляпина. - Санкт-Петербург : Наука, 1991. - 192 с.
10. Држевецкая, И. А. Основы физиологии обмена веществ и эндокринной системы : учеб. пособие / И. А. Држевецкая. - Москва : Высшая школа, 1983. -272 с.
11. Шейко, Л. Д. Влияние малых доз шестивалентного хрома на репродуктивную функцию мелких млекопитающих: модельный эксперимент : автореф. дис. ... канд. биол. наук / Шейко Л. Д. - Екатеринбург, 1998. - 28 с.
12. Исследование жизнеспособности клеток при воздействии ацетата свинца на организм крысы / Н. А. Мельникова, О. С. Шубина, Н. А. Дуденкова, М. В. Лапшина, О. В. Лиференко, О. И. Тимошкина // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 5. - URL: http://www.science-education.ru/111-10588
13. Николаев, В. В. Биохимические исследования спермоплазмы при мужском бесплодии / В. В Николаев, В. А. Строев, А. Ф. Астраханцев // Урология и нефрология - 1993. - № 3. - С. 33-36.
14. Ласьков, Д. С. Особенности морфофункциональных характеристик сперматозоидов у потомства самок с экспериментальным поражением печени алкогольного генеза / Д. С. Ласьков, Г. В. Брюхин, М. Л. Сизоненко, Е. А. Алымов // Проблемы репродукции. - 2014. - № 2. - С. 18-22.
References
1. Samusev R. P., Zubareva E. V. Zhelezy vnutrenney sekretsii [Endocrine glands]. Moscow: Mir i obrazovanie, 2011, 144 p. [In Russian]
2. Lutskiy D. L., Vybornov S. V., Lutskaya A. M., Goncharova L. A., Makhmudov R. M. Problemy reproduktsii [Reproduction problems]. 2009, no. 6, pp. 48-64. [In Russian]
3. Paran'ko N. M., Rublevskaya N. I., Belitskaya E. N., Golovkova T. A., Zemlyakova T. D., Chub L. E., Shmatkov G. G. Gigiena i sanitariya [Hygiene and sanitation]. 2002, no. 1, pp. 28-30. [In Russian]
4. Dudenkova N. A., Shubina O. S. Fundamental'nye issledovaniya [Basic research]. 2013, no. 10, part 6, pp. 1253-1259. [In Russian]
5. Dudenkova N. A. Molodezh' i naukaXXI veka: materialy Mezhdunar. nauch. konf. (Ulyanovsk, 13 dekabrya 2018 g.) [Youth and science of the XXI century: proceedings International scientific conference (Ulyanovsk, 13th of December, 2018)]. Ulyanovsk: UlGAU, 2018, vol. II, pp. 406-409. [In Russian]
6. Shubina O. S., Dudenkova N. A. Veterinary World. 2016, vol. 9, no. 10, pp. 1129-1134.
7. Dudenkova N. A., Shubina O. S. Vrach-aspirant [Postgraduate student]. 2015, no. 5 (72), pp. 31-40. [In Russian]
8. Laskov D. S., Bryukhin G. V., Sizonenko M. L., Alymov E. A. Problemy reproduktsii [Reproduction problems]. 2014, no. 2, pp. 18-22. [In Russian]
9. Shalyapina V. G. Endokrinologiya reproduktsii: ucheb. posobie [Reproduction endocrinology: a teaching aid]. Saint-Petersburg: Nauka, 1991, 192 p. [In Russian]
10. Drzhevetskaya I. A. Osnovy fiziologii obmena veshchestv i endokrinnoy sistemy: uchebnoe posobie [Fundamentals of the physiology of metabolism and the endocrine system: a teaching aid]. Moscow: Vysshaya shkola, 1983, 272 p. [In Russian]
11. Sheyko L. D. Vliyanie malykh doz shestivalentnogo khroma na reproduktivnuyu funktsiyu melkikh mlekopitayushchikh: model'nyy eksperiment: avtoref. dis. kand. biol. nauk [The effect of small doses of hexavalent chromium on the reproductive function of small mammals: a model experiment: author's abstract of dissertation to apply for the degree of the candidate of biological sciences]. Ekaterinburg, 1998, 28 p. [In Russian]
12. Mel'nikova N. A., Shubina O. S., Dudenkova N. A., Lapshina M. V., Liferenko O. V., Ti-moshkina O. I. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya [Modern problems of science and education]. 2013, no. 5. Available at: http://www.science-education.ru/111-10588 [In Russian]
13. Nikolaev V. V., Stroev V. A., Astrakhantsev A. F. Urologiya i nefrologiya [Urology and nephrology]. 1993, no. 3, pp. 33-36. [In Russian]
14. Las'kov D. S., Bryukhin G. V., Sizonenko M. L., Alymov E. A. Problemy reproduktsii [Reproduction problems]. 2014, no. 2, pp. 18-22. [In Russian]
Дуденкова Наталья Анатолиевна
кандидат биологических наук, старший преподаватель, кафедра биологии, географии и методики обучения, Мордовский государственный педагогический институт имени М. Е. Евсевьева (Россия, г. Саранск, ул. Студенческая, 11А)
E-mail: dudenkova_nataly@mail.ru
Dudenkova Natal'ya Anatolievna Candidate of biological sciences, senior lecturer, sub-department of biology, geography and teaching methods, Mordovia state pedagogical Institute M. E. Evseveva (11A, Studencheskaya street, Saransk, Russia)
Шубина Ольга Сергеевна
доктор биологических наук, профессор,
кафедра биологии, географии и методики
обучения, Мордовский государственный
педагогический институт
имени М. Е. Евсевьева (Россия,
г. Саранск, ул. Студенческая, 11А)
E-mail: o.shubina@mail.ru
Shubina Ol'ga Sergeevna Doctor of biological sciences, professor, sub-department of biology, geography and teaching methods, Mordovia State Pedagogical Institute named after M. E. Evseviev (11A, Studencheskaya street, Saransk, Russia)
Образец цитирования:
Дуденкова, Н. А. Влияние свинцовой интоксикации на мужские половые клетки белых крыс / Н. А. Дуденкова, О. С. Шубина // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2019. -№ 4 (52). - С. 131-140. - DOI 10.21685/2072-3032-2019-4-14.
