CC BY
16
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
ВЛИЯНИЕ СУПРАМОЛЕКУЛЯРНОГО КОМПЛЕКСА PRE-1 НА СОДЕРЖАНИЕ ПРОДУКТОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В МИТОХОНДРИЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС РАЗЛИЧНОГО ВОЗРАСТА
12 3
Мардиева К.М. , Далимова С.Н. , Левицкая Ю.В. , Адилходжаева Ш.Б.4, Бурхонова М.Х.5, Кузиев Ш.Н.6 Email: Mardieva640@scientifictext.ru
1 Мардиева Камила Маратовна - магистрант; 2Далимова Сурайё Нугмановна - доктор биологических наук, профессор, заведующиая кафедрой, кафедра биохимии, Национальный университет Узбекистана; 3Левицкая Юлия Владимировна - кандидат биологических наук, заведующая лабораторией, лаборатория биохимии и биофизики, Учебно-экспериментальный центр высоких технологий; 4Адилходжаева Шохсанам Баходировна - бакалавр,
факультет биологии; 5Бурхонова Мунира Хикматилла кизи - магистрант; 6Кузиев Шерали Насруллаевич - преподаватель, кафедра биохимии, Национальный университет Узбекистана, г. Ташкент, Республика Узбекистан
Аннотация: изучено влияние супрамолекулярного комплекса PRE-1 на интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в митохондриях головного мозга в возрасте от 3 до 15 месяцев. Результаты исследования показали, что исследуемое соединение обладает выраженной антиоксидантной активностью, степень проявления которой находится в прямой корреляции с возрастом животных. Наибольший эффект проявился в экспериментах с 15-месячными животными. С уменьшением возраста животных снижался и антиоксидантный эффект комплекса. У самых молодых животных (3 месяца) данный комплекс оказывал значительный прооксидантный эффект.
Ключевые слова: митохондрии, ПОЛ, АФК, старение, АОС, полифенолы, глицирризиновая кислота.
INFLUENCE OF SUPRAMOLECULAR COMPLEX PRE-1
ON THE MAINTENENCE OF PRODUCTS OF LIPID PEROXIDATION IN MITOCHONDRIA OF THE BRAIN OF RATS OF VARIOUS AGE Mardieva K.M.1, Dalimova S.N.2, Levitskaya Yu.V.3, Alilkhodjaeva Sh.B.4, Burkhonova M.Kh.5, Kuziev Sh.N.6
1Mardieva Kamila Maratovna - Master's Student;
2Dalimova Surayyo Nigmanovna - Doctor of science in biology, Professor, Head of the Department,
DEPARTMENT OF BIOCHEMISTRY, NATIONAL UNIVERSITY OF UZBEKISTAN;
3Levitskaya Yuliya Vladimirovna - PHD, Head of the Laboratory, LABORATORY OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS, CENTER OF HIGH TECHNOLOGIES;
4Alikhodjaeva Shokhsanam Bakhodirovna - Bachelor's Student, Faculty of Biology; 5Burkhonova Munira Khikmatilla kizi - Master's Student;
6Kuziev Sherali Nasrullaevich - Teaching Assistant, DEPARTMENT OFBIOCHEMISTY, NATIONAL UNIVERSITY OF UZBEKISTAN, TASHKENT, REPUBLIC OF UZBEKISTAN
Abstract: the interest of this work is the effect of the supramolecular complex PRE-1 on the intensity of lipid peroxidation (LPO) in mitochondria of the brain at the age of 3 to 15 months. The results of the study showed that the test compound has a pronounced antioxidant activity, the degree of its manifestation has explicit correlation with the age of the animals. The greatest effect was manifested in experiments with 15-month-old animals. With the decrease in the age of animals, the antioxidant effect of the complex also decreased. In the youngest animals (3 months) this complex had a significant prooxidant effect.
Keywords: mitochondria, LPO, ROS, AOS, aging, polyphenols, glycyrrhizic acid.
УДК 577.344:615.27: 576.366
Введение
Митохондрии являются одним из основных источников генерации активных форм кислорода (АФК) в клетке. Согласно литературным данным, в норме АФК образуются постоянно и участвуют во многих физиологических процессах, таких как регуляция иммунного ответа, экспрессия генов, работа кровеносной и эндокринной систем. При некоторых патологиях нарушается система регуляции АФК, что приводит к их избыточной генерации. А это может оказывать прямое деструктивное действие на клеточные структуры, а также инициировать свободнорадикальное окисление липидов, белков, нуклеиновых кислот, лежащее в основе патогенеза многих заболеваний [1, 2, 3].
Для предотвращения инициирования свободнорадикального окисления в митохондриях существует система антиоксидантной защиты, включающая в себя как специальные ферменты (супероксиддисмутазу, пероксидазу, глутатионпероксидазу и другие), так и не ферментативные антиоксиданты (витамины (Е, С)).
Снижение функции антиоксидантной системы защиты клеток связано с нарушением баланса между продукцией свободных радикалов и функционированием ферментов собственной антиоксидантной зашиты клеток. Когда антиоксидантная система не справляется с проблемой токсического действия АФК, в клетке развивается так называемый окислительный стресс (ОС) нарушение равновесия между окислителями и антиоксидантами в пользу окислителей. В свою очередь ОС
способен вызывать повреждение всех биомакромолекул и неизбежно вести к развитию многих патологий, включая атеросклероз, нейродегенеративные заболевания (болезнь Хантингтона, Альцгеймера и Паркинсона, боковой амиотрофический склероз т.д.), ишемию. Старение организма также протекает на фоне ОС, который носит прогрессирующий и нарастающий характер. Согласно свободнорадикальной теории, в процессе старения происходит увеличение количества молекулярных повреждений и генетическом аппарате клеток, вызванных АФК и снижение функции антиоксидантной системы и других защитных механизмов в организме [9, 10]. Поэтому поиск веществ, способных влиять на антиоксидантный статус клетки, является актуальной задачей современной биологии и медицины при решении проблем, в том числе связанных со старением организма.
В настоящее время в современной фармацевтической индустрии создание фармакологических препаратов на основе растительного сырья является приоритетным направлением вследствии отсутствия у этих препаратов серьёзных побочных эффектов. С этой точки зрения одним из перспективных веществ являются полифенольные соединения. Большинство полифенолов характеризуются уникальным терапевтическим потенциалом, но низкой биодоступностью. В связи с чем перспективной является разработка современных лекарственных форм на основе полифенолов, позволяющих обеспечить их оптимальную биодоступность. Одним из эффективных способов повышения их биодоступности является создание супрамолекулярных комплексов. Так, для повышения биодоступности полифенолов, выделенных из растений, Узбекистана, был создан супрамолекулярный комплекс, состоящий из суммы полифенолов и глицирризиновой кислоты.
Целью наших исследований явилось изучение влияния супрамолекулярного комплекса PRE-1 на перекисное окисление липидов митохондрий головного мозга крыс различного возраста.
Материалы и методы исследования.
В работе использовали самцы белых беспородных крыс 5 возрастных категорий -3, 6, 9, 12, 15 месяцев.
С целью оценки антиоксидантных свойств PRE -1 проводились эксперименты в условиях in vitro, в которых PRE-1 вносился в концентрации 10 мкМ (в предварительных экспериментах данная концентрация была определена как наиболее эффективная).
Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования [7] в среде, содержащей 250 мМ сахарозы, 10 мМ трис-НС1 и 1 мМ ЭДТА буфера, рН 7,4. Суспензию митохондрий хранили в морозильной камере при температуре -80Со до дня эксперимента. В день эксперимента митохондрии размораживались и в них определялось общее содержание белка.
Содержание белка определяли колориметрически по биуретовому методу [6] с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.
Об активности ПОЛ судили по количеству образования малонового диальдегида (МДА). Индукцию неферментативного Fe2+/аскорбат - зависимого ПОЛ проводили добавлением в среду инкубации (СИ), содержащую 125 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl, pH=7,4 суспензию митохондрий из расчета 0.5 мг белка на 1 мл СИ, 10-5 М FeSO4 и 2*10-4 М аскорбата [3]. Добавку PRE-1 производили после внесения суспензии митохондрий в реакционную смесь. Инкубацию проводили при температуре 37°С на водяной бане с постоянным перемешиванием в течение 30 мин. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл 70% трихлоруксусной кислоты. От белкового преципитата избавлялись путем центрифугирования пробирок при 3000 об/мин в течение 15 мин, отбирали по 2 мл супернатанта приливали по 1 мл теплой ТБК и кипятили пробирки в течение 15 мин. После охлаждения объем доводили до 3 мл и колориметрировали на спектрофотометре Agilent Technologies Cary-60 при длине волны 535 нм.
Количество образовавшегося МДА определяли с использованием коэффициента молярной экстинции, равного 1,56*10-5 М"1/см"1. Концентрацию МДА выражали в нмоль МДА/мг белка [5, 8].
Статистический анализ данных осуществлялась с использованием программы Microsoft Excel. Результаты представлены как среднее значение параметров, вычисленное по результатам восьми экспериментов ± стандартное отклонение. Статистическую достоверность считали с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Согласно данным литературы, с возрастом в митохондриях головного мозга увеличивается продукция АФК, снижается активность АОС и, как следствие, наблюдается интенсификация липопероксидации и рост количества конечных продуктов ПОЛ - МДА. В наших экспериментах также было установлено, что в зависимости от увеличения возраста опытных животных значительно повышается количество МДА в митохондриях, что может свидетельствовать о снижении активности АОС (см. таб. 1).
Так, если сравнивать количества МДА у 3-месячных и 6-месячных крыс, то уже через 3 месяца базальный уровень МДА увеличивается на 40%. У более зрелых крыс этот прирост становится более значительным, и у 9-месячных крыс уровень МДА увеличен в среднем более чем в 5 раз, а у 12- и 15-месячных - в 7 и 7,5 раза соответственно по сравнению со значениями в группе 3 -месячных животных.
Таблица 1. Влияние 10 мкМ супрамолекулярного комплекса РЯЕ-1 на накопление МДА в зависимости от возраста крыс (п=8, М±т; нмоль МДА/мг белка)
Возраст крыс, месяцы Условия опыта Время инкубации, минуты
Старт 5 мин 10 мин 15 мин 30 мин
3 Контроль 3,47±0,10 10,16±0,31 13,78±0,11 20,80±0,62 33,90±0,097
+ PreI 26,46±0,91 50,03±1,57 50,66±1,80 53,60±1,68
6 Контроль 4,84±0,22 18,09±0,89 18,95±0,79 23,31±1,03 24,59±1,00
+ PreI 14,63±0,73 19,98±0,72 20,57±1,05 21,84±0,83
9 Контроль 19,59±0,82 50,48±2,16 79,50±3,09 84,44±2,78 84,28±3,53
+ PreI 36,72±1,34 44,21±1,27 46,05±1,59 48,05±1,85
12 Контроль 24,26±0,62 70,19±2,53 100,90±3,37 112,40±3,85 127,48±4,86
+ PreI 34,05±1,28 45,78±1,36 47,50±1,62 66,94±2,48
15 Контроль 25,84±1,14 125,84±4,59 139,4±5,47 143,61±5,76 144,30±5,93
+ PreI 50,1±2,01 55,10±2,29 59,80±2,81 69,52±2,09
В зависимости от возраста меняется не только интенсивность ПОЛ, но и кинетика этого процесса: при инкубации митохондрий 9-12-месячных крыс с индукторами ПОЛ основной прирост МДА наблюдается в течение первых 10-15 минут, а у 15-месячных крыс скорость накопления МДА значительно выше и максимальное накопление МДА наблюдается уже в первые 5 минут инкубации, далее прирост количества МДА становится менее заметным (выходит на плато), что может объясняться многими факторами, в том числе и активизацией АОС. Исключение составляет кинетика прироста МДА у самых молодых, 3-месячных крыс: в этом случае количество МДА с течением времени инкубации увеличивается экспоненциально и по сравнению с начальными значениями увеличивается практически в 9 раз. В остальных возрастных группах прирост МДА при инкубации с индукторами ПОЛ не превышает пятикратных значений (максимальное увеличение составляло 5,6 раза).
Рис. 1. Влияние 10 мкМ супрамолекулярного комплекса РКЕ-1 на кинетику ПОЛ и скорость накопления МДА в митохондриях головного мозга крыс различного возраста. За 0% принято базовое значение МДА в каждой возрастной группе. На рисунке обозначено: К - контроль,
О - в присутствии РКЕ-1 п=8
Следует отметить, что кинетика накопления МДА у 6-месячных крыс имеет двухступенчатый характер - после 4,5 мин инкубации концентрация МДА выходит на плато и практически не меняется до 10й минуты инкубации, а при дальнейшей инкубации количество МДА снова начинает плавно увеличиваться и выходит на плато к 30й минуте инкубации, увеличиваясь по сравнению с 10 минутами инкубации в 1,4 раза. В случае же 12 месячных животных накопление МДА происходит во всем временном диапазоне инкубирования, меняется лишь скорость накопления МДА, однако на плато эти значения так и не выходят.
Таким образом, по антиоксидантной эффективности комплекс PRE-1 наиболее яркие свойства проявляет в группе 15-месячных животных, при снижении возраста опытных животных с 12 до 6 месяцев пропорционально снижается и выраженность антиоксидантного эффекта. Однако, способность сохранять антиоксидантный эффект в течение времени инкубации наблюдается только у 9-месячных крыс: в первые 5 минут в присутствии комплекса PRE-1 количество МДА снижается на 27% по сравнению с контролем, дальнейшее инкубирование с индукторами ПОЛ приводит к более заметному проявлению антиоксидантного эффекта (44% по сравнению с контролем). В остальных 3 группах (15, 12- м.) со временем инкубации наблюдается снижение антиоксидантного эффекта PRE-1, а в случае 6 месячных крыс наблюдается проявление временного прооксидантного действия РКЕ-1 (на 8-11 минутах инкубации). У 12-месячных крыс максимальный антиоксидантный эффект наблюдается на 15 минуте инкубации, а затем эффективность комплекса падает в среднем на 10%, тогда как у 15-месячных животных максимальный эффект наблюдается на начальных минутах инкубации, а затем эффективность снижается в среднем на 8%.
У молодых (3-месячных) крыс комплекс РКЕ-1 проявлял ярко выраженные прооксидантные свойства в течение первых 5 минут инкубации по сравнению с контролем в этой же точке уровень МДА увеличивался практически в 2,6 раза, дальнейшее инкубирование приводило к еще большему росту МДА: на 10 минуте уровень МДА по сравнению с контрольными значениями увеличивался более чем в 3,5
раза, при дальнейшей инкубации прооксидантный эффект несколько снижался, и по сравнению с контрольными значениями на 15-й и 30-й минутах инкубации в присутствии комплекса количество МДА было увеличено в 2,4 и 1,6 раза соответственно.
2000
3 месяца
1500
1000
500
0
0
5
10
15
20
25
30
Рис. 2. Влияние 10 мкМ супрамолекулярного комплекса РЯЕ-1 на накопление МДА в присутствии индукторов ПОЛ в митохондриях головного мозга 3-месячных крыс. На рисунке обозначено: К - контроль, О - в присутствии РЯЕ-1. п=8
Кинетика накопления ПОЛ у 3-месячных крыс в присутствии комплекса отличалась от кинетики в контрольной группе и соответствовала кинетике ПОЛ в группе 9- и 15-месячных крыс. В первые 5 минут инкубации в опытной группе скорость накопления МДА была увеличена по сравнению с контрольными значениями в 3,4 раза, в последующие 5 минут происходит еще большее ускорение и скорость ПОЛ в присутствии комплекса увеличивалась практически в 7 раз, что отражается в драматическом увеличении количества МДА. Однако дальнейшее инкубирование в присутствии комплекса РЕЕ-1 приводит к незначительному снижению скорости накопления МДА и по сравнению с контролем, количества МДА в последующие сроки инкубации (10-15-я минута инкубации) остается на достаточно высоком уровне. Таким образом, в случае 3-месячных животных в присутствии супрамолекулярного комплекса в период с 10 по 15 минуту инкубирования в ответ на лавинообразный рост количества МДА скорее всего происходит активация АОС и стабилизация процесса перекисного окисления.
Суммируя полученные результаты можно предположить, что супрамолекулярный комплекс РЯЕ-1 является перспективной платформой для создания лекарственного препарата с выраженными антиоксидантными свойствами, однако его эффективность зависит от возраста животного.
1. Шабанов П.Д., Зарубина И.В., Новиков В.Е., Цыган В.Н. Метаболические корректоры гипоксии. СПб.: Информ-Навигатор, 2010. 916 с.
2. Яснецов В.В., Новиков В.Е. Фармакотерапия отека головного мозга. М.:ВИНИТИ, 1994. 176 с.
3. Сазонтова Т.Г., Архипенко Ю.В. Роль свободнорадикальных процессов и редокс-сигнализации в адаптации организма к изменению уровня кислорода // Рос.физиол. журн. им. И. И. Сеченова, 2005. Т. 91. № 6. С. 636-655.
4. Skulachev V.P. Mitochondria targeted antioxidants as promising drugs for treatment of age-related brain diseases //J. Alzheimers Dis., 2012. Vol. 28. № 2. P. 283-289.
5. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление в биологических мембранах. М.: Наука, 1972.
Список литературы /References
6. Gornal A.G. Bardawill C.J., David M. Determination of serum protein by means of biuret reaction.// J.Biol. Chem., 1949. V. 177. P. 751-766.
7. Schneider W.C., Hogeboom G.H. Cytochemical studies of mammalian tissues: the isolation of cell components by differential centrifugation. // Cancer. Res., 1951. V. 11. P. 1-22.
8. Ohkawa H., Ohaahi N., Jadi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction // Anal. Biochem., 1979. Vol. 95. № 2. P. 351-358.
9. Harman D. Role of antioxidant nutrients in aging: Overview // Age, 1995. Vol. 18. № 2. P. 51-62.
10. Fusco D., Colloca G., Lo Monaco M.R., Cesari M. Effects of antioxidant supplementation on the aging process// Clin Interv Aging., 2007.Vol. 2. № 3. P. 377-387.
