CC BY
37ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2006, том 48, №11, с. 2023-2033
========^=====^^== РАСТВОРЫ
УДК 541.64:539.199
ВЛИЯНИЕ СТРОЕНИЯ БЛОК-СОПОЛИМЕРОВ ЭТИЛЕНОКСИДА И ПРОПИЛЕНОКСИДА НА ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С БИОЛОГИЧЕСКИМИ МЕМБРАНАМИ1
© 2006 г. А. Е. Жирнов, Д. Н. Павлов, Т. В. Демина, Г. А. Бадун, И. Д. Гроздова, Н. С. Мелик-Нубаров
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.
Химический факультет 119992 Москва, Ленинские горы Поступила в редакцию 11.05.2006 г.
Принята в печать 05.06.2006 г.
Методом равновесного диализа определены коэффициенты распределения блок-сополимеров эти-леноксида и пропиленоксида между липидной фазой и водой. Для трехблочного сополимера (плю-роника L61) он составил 45 ± 9, для двублочного (REP) - 78 ± 17. В соответствии с этим изменяется и влияние сополимеров на транспорт заряженного органического иона карбоксифлуоресцеина через лецитиновую бислойную мембрану. В то же время при меньшей величине связывания трехблоч-ный сополимер оказывает большее влияние на скорость трансбислойной миграции липидов и транспорта незаряженного вещества (доксорубицина). Введение в мембрану холестерина уменьшает ее чувствительность к действию сополимеров, однако сохраняется характер изменений, вызываемых обоими сополимерами. Полученные результаты свидетельствуют о том, что трехблочное строение амфифильных макромолекул обусловливает их более высокую способность возмущать липидные бислойные мембраны.
ВВЕДЕНИЕ
Блок-сополимеры этиленоксида (ЭО) и пропиленоксида (ПО) представляют собой семейство амфифильных полимеров, в которых гидрофобный блок представлен ППО, а гидрофильный -ПЭО [1]. Трехблочные сополимеры строения ПЭО-ППО-ПЭО (плюроники, полоксамеры, синпероники) нашли применение в медицине и фармакологии в качестве иммуноадъювантов, компонентов искусственной крови и криопро-текторов, антикоагулянтов и модуляторов активности нейтрофилов [2]. Они увеличивают проницаемость гематоэнцефалического барьера [3], способствуют восстановлению целостности поврежденных клеточных мембран [4]. Обнаружено, что плюроники стимулируют накопление антрациклиновых антибиотиков, включая дауно-мицин и доксорубицин, в раковых клетках и снимают лекарственную устойчивость, возникаю-
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 06-03-32403).
E-mail: melik.nubarov@genebee.msu.ru (Мелик-Нубаров Николай Сергеевич).
щую при терапии опухолей [5]. Все эти эффекты свидетельствуют о способности амфифильных блок-сополимеров взаимодействовать с биологическими мембранами.
Связывание плюроников с модельными липид-ными мембранами (липосомами) увеличивает скорость трансбислойной миграции липидов и проницаемость липидного бислоя по отношению к доксорубицину [6]. Сравнение блок-сополимеров, содержащих в качестве гидрофильной цепи ПЭО или разветвленный полиглицерин, а в качестве гидрофобной - ППО или остаток жирной кислоты, показало, что эффективность действия сополимера на липидную мембрану зависит от валовой гидрофобности макромолекулы и от ван-дер-ваальсова объема гидрофобной части. Весьма эффективным оказался двублочный полимер с небольшим фрагментом разветвленного полиглицерина и объемным гидрофобным блоком статистического сополимера ЭО и ПО.
Результаты ДСК и малоуглового рентгеновского рассеяния показали, что двублочные сополимеры легче встраиваются в бислой, довольно
2023
глубоко проникая внутрь гидрофобной сердцевины мембраны [7], в то время как проникновение гидрофобного блока плюроников носит более поверхностный характер и не приводит к заметным изменениям в структуре липидного бислоя [8]. Влияние архитектуры сополимеров на их способность изменять барьерные свойства мембран ранее не исследовалось.
В нашей работе мы сравнили способность двублочного и трехблочного сополимеров ЭО и ПО встраиваться в мембрану и изменять ее свойства.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали трехблочный сополимер ЭО и ПО плюроник L61 ("Serva", Германия), который изучался ранее [9], и двублочный REP (Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей, Москва). Мо-лекулярно-массовые характеристики образцов полимеров определяли методом ГПХ в ТГФ при 35°С на жидкостном хроматографе "Waters" с рефрактометрическим детектором и колонками, заполненными ультрастирагелем с размером пор 103 и 105 Á, а также линейной колонкой. В качестве стандартов использовали узкодисперсные ПЭГ фирмы "Waters" с М = 270-6000 Да. Хрома-тограммы обрабатывали на интеграторе "Data Module-730".
Массовую долю звеньев этиленоксида вычисляли по данным ИК-спектроскопии, сравнивая полосы поглощения при 1372 см-1 (симметричные деформационные колебания группы СН3-пропи-леноксида) и 1464 см-1 (деформационные колебания группы СН2-СН2-0 в противофазе) [10] для экспериментального образца и контрольных смесей ПЭО и ППО в заданном соотношении. Образцами служили пленки, полученные упариванием раствора полимеров в хлороформе, нанесенного на кристалл КВг.
ККМ полимеров определяли по возгоранию в их мицеллах флуоресценции 1,6-дифенилгекса-триена-1,3,5 при 37°С (А,возб = 366 нм, А,исп = 433 нм) [11]. Его 1 мМ раствор в ТГФ разбавляли водой до концентрации 2 х 10~5 моль/л и титровали растворами полимеров в ячейке флуориметра 650-10 S "Hitachi". ККМ находили по излому зависимости
интенсивности флуоресценции от концентрации полимера.
С целью введения радиоактивной метки полимеры обрабатывали атомами трития [12]. Для этого 0.6 мг препарата, лиофильно высушенного в тонком слое на стенках реакционного сосуда (площадь мишени около 150 см2), бомбардировали горячими атомами трития (Е = 0.16 эВ, 1900 К) в течение 10 с. Процедуру повторяли четырежды, каждый раз растворяя мишень в воде и лиофили-зуя ее заново. Полимер отделяли от легко обмениваемого трития рядом последовательных циклов растворения в этаноле и упаривания в вакууме, после чего очищали от продуктов радиолиза с помощью ГПХ на колонке сефадекса LH-20, уравновешенной этанолом. Удельная активность полученного препарата составляла 0.8 ТБк/ммоль, что соответствует в среднем одному атому трития на макромолекулу.
Малые моноламеллярные липосомы получали как описано ранее [13]. Гидродинамический диаметр липосом, определенный методом квазиупругого светорассеяния (Autosizer 2С, "Malvern", Англия), составлял 40-70 нм.
Связывание блок-сополимеров с липосомами изучали методом равновесного диализа по методике [9].
Влияние блок-сополимеров на транспорт док-сорубицина
О ОН
NH2
через мембраны исследовали на рН-градиентных липосомах [14,15].
Скорость трансбислойной миграции (флип-флоп) липидов в липосомах измеряли согласно ранее описанной методике [9, 16].
Влияние блок-сополимеров на проникновение карбоксифлуоресцеина (КФ) через липидную мембрану проводили на липосомах, предварительно заполненных КФ в концентрации, соот-
Таблица 1. Молекулярно-массовые характеристики и состав исследованных сополимеров
Сополимер мп Mw MJMn Массовая доля этиленоксида
L61 1655 1890 1.14 10%
REP 2094 2189 1.05 48%
Таблица 2. Сравнение свойств двублочного сополимера REP и трехблочного L61
Сополимер ККМ, мкмоль/л Коэффициент распределения между водным раствором и мембраной Удельная эффективность связывания с лимфоцитами человека, мл/млн. клеток Способность ускорять транспорт доксоруби-цина, л/ммоль Способность ускорять флип-флоп, л/ммоль Способность вызывать образование пор в липидной мембране, л/с ммоль
REP L61 37 110 78 ± 17 45 ±9 (85 ± 4) х 10~5 (40 ± 3) х 10~5 5.0 + 0.2 55 + 2 16 ± 5 290 ±50 0.19 0.13
ветствующей концентрационному тушению флуоресценции [17].
Лимфоциты выделяли из венозной крови человека как описано ранее [18] и суспендировали в среде для культивирования клеток (RPMI 1640) с добавкой 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновой кислоты (HEPES).
Для анализа связывания 3Н-полимер (5-50 мкмоль/л) инкубировали с лимфоцитами (4 млн. клеток/мл) в среде RPMI 1640 в течение 2 ч при 37°С. Клетки отмывали от несвязавшего-ся полимера холодным фосфатно-солевым буфером (150 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Na2HP04, рН 7.4, 4°С) с помощью центрифугирования (2 мин, 400 g, 5 раз). Осадок клеток растворяли в 1 М NaOH (18 ч, 20°С), из проб отбирали аликвоты, нейтрализовали их равным объемом 1 М НС1 и использовали для анализа радиоактивности. В оставшихся образцах определяли белок по методу Лоури для уточнения количества клеток в каждой пробе. Количество полимера, приведенное на количество клеток и концентрацию добавленного полимера, служило мерой связывания полимера с клетками.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика полимеров
Для исследования влияния блочного строения молекул сополимеров ПО и ЭО на их взаимодействие с липидными мембранами мы выбрали два полимера - двублочный REP и трехблочный плю-роник L61. Методом ГПХ были определены их
молекулярно-массовые характеристики и коэффициент полидисперсности Mw/Mn, принимающие близкие значения для обоих сополимеров (табл. 1). В то же время соотношение ПО и ЭО в сополимерах, по данным ИК-спектроскопии, сильно различалось, причем строение REP описывалось формулой Э024П019, а плюроника L61 - ЭО2ПОз0ЭО2. Таким образом, гидрофобный блок REP содержал на треть меньше звеньев ПО, чем трехблочный сополимер L61, тогда как гидрофильный блок REP был длиннее в 6 раз.
Несмотря на то, что гидрофобность сравниваемых сополимеров отличается достаточно сильно, их способность к мицеллобразованию, оцениваемая по величине ККМ, практически одинакова (табл. 2). Известно, что в ряду ПАВ аналогичного строения ККМ является однозначной функцией состава молекулы [19-21]. Мы использовали данные [11] для построения двухпара-метрической корреляции между lgKKM трех-блочных плюроников и степенью полимеризации гидрофобного (т) и гидрофильного (п) блоков:
lgKKM = -1.32 - 0.066m + 0.0006л
R = 0.96, F= 112, N -22
В соответствии с этим уравнением трехблочный полимер того же состава, что и REP, должен был иметь ККМ, равную 2800 мкмоль/л. Однако в действительности ККМ сополимера REP составила 37 мкмоль/л, т. е. была меньше в 75 раз (табл. 2). Это сопоставление показывает, что переход от трехблочных сополимеров к двублоч-
[Р], срт/мкл
Время, ч
Рис. 1. Связывание REP с липидными везикулами из яичного лецитина при равновесном диализе: Изменение концентрации полимера REP во внешнем растворе (/) и внутри диализного мешка (2) в отсутствие (а) и в присутствии липосом (б). Начальная концентрация полимера во внешнем растворе 10 мкмоль/л, концентрация липосом внутри диализного мешка 50 мг/мл. Буферный раствор: 10 ммоль/л Na2HP04, 150 ммоль/л NaCl, температура 37°С, рН 7.4. На оси ординат - концентрация полимера в единицах его радиоактивности.
ным сопровождается увеличением их склонности к мицеллообразованию, что согласуется с данными АШпок и соавторов [22].
Связывание полимеров с липосомами
Связывание полимера с липосомами оценивали по коэффициенту распределения полимера между водной фазой и липидным бислоем, который определяется как соотношение концентра-
мкмоль/л
ций полимера в мембранной [Р]м и водной [Р]в фазах:
80 120 Липосомы, мг/мл
Рис. 2. Изотермы связывания полимера REP (/) и плюроника L61 (2, [9]) с липосомами. Начальная концентрация полимера во внешнем растворе 10 мкмоль/л, буферный раствор: 10 ммоль/л Na2HP04, 150 ммоль/л NaCl, температура 37°С, рН 7.4.
Кр =
[PL [Р]в
Поскольку оба исследуемых полимера способны проникать сквозь поры диализной мембраны, для измерения коэффициентов распределения мы использовали метод равновесного диализа [9].
Если внутрь диализного мешка поместить буферный раствор и диализовать его против раствора полимера, меченного тритием, то в течение 40-60 ч концентрация полимера по обе стороны диализной мембраны выравнивается (рис. 1а). Если же туда поместить суспензию липосом, то наблюдается избыточное накопление полимера внутри мешка вследствие его связывания с липосомами (рис. 16). Содержание связанного с липосомами полимера [Р]СВЯз рассчитывали как разность его концентраций во внутреннем резервуаре и внешнем растворе.
Зависимость количества полимера в липидной фазе от концентрации липосом приведена на рис. 2. На основании полученных данных мы рассчитали коэффициенты распределения полимеров между водой и липидной мембраной с помощью нелинейной регрессии согласно уравнению
К„
кп
(а)
80
40
80
40
0.2
Холестерин, мол. доли
0.4
0.02 0.04
Грамицидин, мол. доли
Рис. 3. Изменение коэффициентов распределения REP (/) и плюроника L61 (2) между водой и липидным бислоем при введении в мембрану холестерина (а) и грамицидина (б).
[Р]связ —
[PU,
с Ж
СЛ Т If
КР
где [Р]0 - общая концентрация полимера в растворе, сл и рл - массовая концентрация липида (мг/мл) и его плотность в бислое (1.014 г/см3). Определенные таким образом коэффициенты распределения составляют для L61 - 45 ± 9 [9], а для REP -78 ± 17. Это означает, что при содержании липо-сом 1 мг/мл с одной липосомой гидродинамического диаметра 70 нм может связываться в среднем 47 молекул REP или 28 молекул плюроника L61. Таким образом, REP, несмотря на низкую валовую гидрофобность по сравнению с L61, обладает большим сродством к липидному бислою. Это обусловлено тем, что в отличие от трехблоч-ного L61, в котором оба конца макромолекулы имеют гидрофильные звенья ЭО, REP содержит гидрофильный блок лишь с одной стороны макромолекулы. Такое строение макромолекулы, по всей видимости, способствует ее взаимодействию с липидным бислоем.
Известно, что клеточные мембраны содержат значительное количество стеролов (холестерина и его эфиров) и белков, причем состав липидной мембраны оказывает существенное влияние на ее взаимодействие с амфифилами [23]. Оказалось, что по мере увеличения содержания холестерина связывание полимеров с липосомами уменьшается (рис. За). Введение холестерина сопровождается увеличением микровязкости мембран [24], т.е.
уменьшением подвижности липидных молекул в бислое. По-видимому, это затрудняет встраивание полимера. Интересно, что увеличение жесткости мембран сильнее сказывается на внедрении в нее REP. Так, при введении 40% холестерина связывание REP понижается почти в 7 раз, тогда как у плюроника L61 - только в 4.5 раза (рис. За). Возможно, REP встраивается в бислой на большую глубину, и поэтому его связывание в основном зависит от плотности упаковки бислоя.
Введение в мембрану гидрофобного пептида грамицидина уменьшает связывание полимеров (рис. 36). Так же, как и в случае с холестерином, увеличение содержания грамицидина сильнее отражалось на связывании REP по сравнению с L61. Следовательно, присутствие в мембране белков также уменьшает подвижность мембранных компонентов и препятствует встраиванию объемных амфифильных макромолекул в бислой.
Связывание полимеров с клетками
При инкубации 3Н-полимеров с лимфоцитами человека наблюдается пропорциональное возрастание количества связанного с клетками полимера по мере увеличения его содержания в растворе (рис. 4). Соотношение добавленного и связанного полимера и отсутствие плато указывает на низкую константу связывания полимеров с клетками и большое число связывающих центров на клеточной мембране. Доля связанного полимера, нормированная на концентрацию клеток
Связанный полимер, пмоль/млн. клеток 60 Ь
40 60
Полимер, мкмоль/л
Рис. 4. Изотерма связывания REP (7) и L61 (2) с лимфоцитами человека в течение 2 ч при 37°С в бессывороточной среде.
[12], для плюроника L61 составляет (40 ± 3) х х 10~5 мл/млн. клеток, а для REP она в 2 раза выше - (85 ± 4) х 10~5 мл/млн. клеток. Таким образом, как в случае модельных липидных мембран, так и при взаимодействии полимеров с природными мембранами двублочный сополимер REP имеет большее сродство к ним, чем трехблочный плюроник L61.
Влияние полимера на свойства липидного бислоя везикул
Взаимодействие полимера с биологическими и модельными липидными мембранами приводит к
изменению их барьерных и динамических свойств [6,9, 12, 15]. Мы сравнили влияние REP и плюроника L61 на вытекание гидрофильного красителя карбоксифлуоресцеина из липосом, на транспорт противоопухолевого антибиотика доксорубицина в рН-градиентные липосомы и на трансбислой-ную миграцию липидов.
Влияние сополимеров на вытекание карбоксифлуоресцеина из липосом. Эксперименты проводили на липосомах, заполненных КФ с концентрацией 0.1 моль/л, при которой происходит самотушение флуоресценции. Проникновение заряженных соединений через липидную мембрану маловероятно [25], поэтому КФ, содержащий две кислотные группы, отрицательно заряженные при рН 7, не способен проходить сквозь липидную мембрану по механизму распределение-диффузия. Только в случае образования пор краситель может выходить во внешнюю среду, где оказывается с концентрацией ниже предела самотушения. Таким образом, увеличение интенсивности флуоресценции в системе может служить тестом на образование пор в мембране липосом [17].
Скорость спонтанного вытекания КФ из липосом ничтожно мала (рис. 5а, кривая 1), что свидетельствует о целостности липосом в отсутствие полимера. После добавления 20 мкмоль/л REP (кривая 2) или плюроника L61 (кривая 3) она резко увеличивается, т.е. оба полимера способствуют образованию гидрофильных пор в липидной
Флуоресценция, отн. ед 28
50
Время, с
40 60 80 Полимер, мкмоль/л
Рис. 5. Изменение во времени флуоресценции (А^озб = 490 нм, А,исп = 520 нм) липосом, заполненных 0.1 М раствором карбоксифлуоресцеина, в отсутствие добавок (7), в присутствии 20 мкмоль/л плюроника L61 (2) и двублочного сополимера REP (3) (а) и зависимость начальной скорости вытекания карбоксифлуоресцеина от концентрации сополимера, REP (7) и плюроника L61 (2) (б). Температура 30°С, 0.1 моль/л NaCl, 7.5 ммоль/л Na2HP04, рН 7.2.
Флуоресценция, отн. ед
120 Время, с
200 400
Полимер, мкмоль/л
Рис. 6. Кинетика транспорта доксорубицина в рН-градиентные липосомы из яичного лецитина в отсутствие полимеров (7) и в присутствии 0.005% REP (2) и 0.005% плюроника L61 (5) (а) и увеличение скорости транспорта доксорубицина при добавлении REP (7) и плюроника L61 (2) (б). Липосомы заполнены 0.3 М цитратным буферным раствором (рН 4.0), внешний буферный раствор содержал 20 ммоль/л HEPES (рН 7.0) и 0.45 М сахарозу для компенсации разности осмотического давления, температура 30°С.
мембране. Начальная скорость вытекания красителя v0 возрастает пропорционально концентрации полимера (рис. 56). Наклон зависимости v0 от концентрации полимера фКФ) для REP равен 1.9 х Ю-4 л/(с мкмоль), а для плюроника L61 -1.3 х 10-4 л/с мкмоль. Таким образом, REP проявляет несколько большую способность к образованию пор в липидной мембране, чем плюроник L61. Это согласуется с тем, что его коэффициент распределения между водной и липидной фазами приблизительно в ~1.7 раза больше. Поэтому мы полагаем, что более сильное влияние REP на образование пор в мембране связано с его повышенной способностью встраиваться в липосомы.
Влияние полимеров на мембранный транспорт доксорубицина. Скорость мембранного транспорта доксорубицина определяли по уменьшению его флуоресценции вследствие накопления во внутренней полости липосом, заполненных кислым буферным раствором. Процесс проникновения доксорубицина описывается экспоненциальным уменьшением интенсивности флуоресценции во времени и характеризуется константой скорости процесса первого порядка (рис. 6а, кривая 7).
Добавление полимеров приводит к ускорению транспорта доксорубицина (кривые 2 и 5), причем отношение наблюдаемых констант скорости транспорта в присутствии (кр) и в отсутствие (ко) полимера увеличивается пропорционально их концентрации (рис. 66). Тангенс угла наклона этой зависимости ßAOKC является кон-
центрационно-независимои характеристикой способности полимера ускорять транспорт доксорубицина. Для REP эта величина составляет 5.0 ± 0.2 ммоль-1 л, а для плюроника L61 она на порядок больше - 55 ± 2 ммоль-1 л (табл. 2). Следует отметить, что это соотношение противоположно для влияния блок-сополимеров на образование пор в мембране.
Принципиально разный характер влияния REP и L61 на транспорт доксорубицина и вытекание КФ указывает на различный механизм процессов. Для проверки этого вывода мы рассчитали скорость потока доксорубицина через липосомаль-ную мембрану и сопоставили полученные величины со скоростью вытекания КФ. Поток доксорубицина через мембрану рН-градиентных липосом в отсутствие полимеров составляет 11.4пмоль/см2 мин. При концентрации полимеров 20 мкмоль/л он возрастает до 14.3 пмоль/см2 мин в случае REP и до 28.6 пмоль/см2 мин при добавлении плюроника L61. Поток КФ в аналогичных условиях составляет 0.57 и 0.31 пмоль/см2 мин соответственно, что в 30 и 90 раз меньше потока доксорубицина в присутствии полимеров. Таким образом, "канальная" проводимость мембраны в присутствии сополимеров оказывается почти на два порядка ниже, чем индуцированная полимерами проницаемость по отношению к доксоруби-цину. Этот расчет позволяет заключить, что в присутствии полимеров доксорубицин проникает в липосомы не через поры, а по механизму рас-
0 0.2 0.4
Холестерин, мол. доли
СВЯЗ' Л/МКМОЛЬ
(б)
6 2
0 0.2 0.4
Холестерин, мол. доли
Рис. 7. Ускорение транспорта доксорубицина в липосомы при добавлении REP (1) и плюроника L61 (2) в зависимости от содержания холестерина в липосомальной мембране (а) и зависимость значений Рдокс, приведенных на количество связанного с липосомами полимера, от содержания холестерина в мембране (б). Липосомы заполнены 0.3 М цитратным буферным раствором (рН 4.0), внешний буферный раствор содержал 20 ммоль/л HEPES (рН 7.0) и 0.45 М сахарозу для компенсации разности осмотического давления, температура 30°С.
пределение-диффузия, т.е. полимеры не меняют механизма транспорта доксорубицина.
В предыдущей части работы мы показали, что связывание плюроника L61 и двублочного сополимера REP в значительной мере определяется составом мембраны и в несколько раз уменьшается с введением в нее холестерина (рис. За). Можно было ожидать, что влияние полимеров на проницаемость мембраны по отношению к док-сорубицину при этом также будет уменьшаться. Действительно, такая закономерность наблюда-
ется в случае трехблочного плюроника L61 (рис. 7а, кривая 2). В отличие от него способность двублочного сополимера REP ускорять транспорт доксорубицина достоверно возрастает в мембранах, содержащих 15% холестерина, по сравнению с мембранами, содержащими 10 или 25% холестерина (кривая /). Нормирование эффектов, вызываемых сополимерами, на концентрацию связанных с мембраной макромолекул показало, что действие единичной макромолекулы связанного с мембраной плюроника L61 практически не зависит от содержания в ней холестерина (рис. 76, кривая 2). В то же время действие двублочного сополимера REP проходит через максимум, соответствующий содержанию холестерина 0.15-0.20 мольных долей (кривая 1). Причина наблюдаемых различий в поведении полимеров остается пока непонятной.
Влияние сополимеров на скорость трансби-слойной миграции (флип-флопа) НБД-меченного фосфатидилэтаноламина (НБД-ФЭ). Для изучения скорости миграции липидов в липосомальных мембранах использовали дитионитный метод, основанный на способности 7-нитробензоксиди-азольной группы (НБД), присоединенной к полярной головке липида фосфатидилэтаноламина, быстро и в мягких условиях восстанавливаться в нефлуоресцирующий продукт дитионитом натрия (Na2S204).
Дитионит-анионы не способны проникать через бислой, что дает возможность получать асимметрично меченные липосомы, несущие флуорес-
центную метку только на внутреннем монослое мембраны. В процессе инкубации таких липосом часть молекул НБД-ФЭ переходит с внутреннего монослоя мембраны на внешний и становится доступной для восстановления дитионитом. Наблюдаемое при этом уменьшение флуоресценции позволяет рассчитать долю НБД-ФЭ, перешедшего на внешний монослой [9]. При фиксированном малом времени инкубации она пропорциональна скорости флип-флопа. Соотношение скоростей флип-флопа в присутствии (кр) и в отсутствие (&0) полимера служит мерой его влияния на этот процесс.
На рис. 8 показано изменение величины кр/к0 при варьировании концентрации REP (кривая 7) и плюроника L61 (кривая 2). Видно, что оба сополимера вызывают значительное ускорение флип-флопа, причем, как и в случае транспорта доксо-рубицина, влияние полимеров на скорость флип-флопа линейно возрастает с увеличением концентрации полимеров. Угловые коэффициенты этих прямых, характеризующие независящую от концентрации способность полимера ускорять флип-флоп, равны 16 л/ммоль для REP и 290 л/ммоль-для плюроника L61 (табл. 2). Таким образом, влияние двублочного REP на трансбис-лойную миграцию липидов на порядок слабее, чем плюроника L61. Аналогичная ситуация отмечалась выше при сравнении влияния этих полимеров на транспорт доксорубицина. Эти результаты указывают на тесную взаимосвязь исследованных процессов [6].
Известно, что взаимодействие блок-сополимеров ЭО и ПО с липидными мембранами приводит к встраиванию гидрофобного блока ППО в ли-пидный бислой, тогда как звенья ЭО остаются в водном окружении [7,8,26]. Можно полагать, что равновесный размер блока ППО в липидной мембране сильно отличается для двублочных и трех-блочных сополимеров. Действительно, поскольку два гидрофильных блока, присоединенные по концам макромолекулы, локализуются на внешней поверхности мембраны, гидрофобный блок должен обладать меньшей конформационной подвижностью, а дезорганизация бислоя вокруг та-
Ускорение флип-флопа, отн. ед. 12
80 120 Полимер, мкмоль/л
Рис. 8. Ускорение трансмембранного переноса НБД-меченного фосфатидилэтаноламина в липосомах из яичного лецитина в присутствии REP (7) и плюроника L61 (2) в зависимости от концентрации полимера. Содержание липосом 0.16 мг/мл, буферный раствор: 10 ммоль/л трис(оксиметил)аминометана, 150 ммоль/л хо-лин хлорида, 1 ммоль/л этилендиаминтетрааце-тата натрия (рН 7.0); 25°С. Количество перенесенного липида регистрировали через 15 мин после добавления полимера.
кои молекулы - служить источником компенсаторного повышения энтропии всей системы:
L61
REP
В том случае, если цепочка ППО закрепляется на поверхности мембраны лишь в одной точке, проигрыш в конформационной энтропии полимера, а значит и компенсаторное возмущение бислоя, оказываются существенно меньше. Вследствие этого воздействие сополимера REP на скорость транспорта доксорубицина и флип-флоп слабее, чем действие плюроника L61.
Иная картина наблюдается при сравнении способности полимеров вызывать вытекание карбоксифлуоресцеина. Выход из липосом заряженных молекул невозможен без образования крупных гидрофильных пор диаметром не менее 8-9 А. Термодинамическая несовместимость ППО с липидным бислоем [27] должна способ-
ствовать латеральной сегрегации системы с минимизацией контакта между полимером и липид-ным окружением. В результате могут возникать островки, обогащенные полимером, которые и служат основой для образования гидрофильных пор, вносящих существенный вклад в проницаемость мембран по отношению к заряженным соединениям, но менее существенны для транспорта соединений, способных проникать через мембраны по механизму растворение-диффузия:
Таким образом, несмотря на то что REP и плю-роник L61 имеют практически одинаковую способность к образованию мицелл, характер их взаимодействия с липидными и биологическими мембранами существенно различается. Двублоч-ный сополимер REP обладает большим сродством к модельным и биологическим мембранам, его способность к образованию пор в липидной мембране несколько выше, чем у плюроника L61. В то же время REP проявляет значительно меньшую способность ускорять проникновение доксорубицина и трансмембранный перенос липидов.
Авторы благодарны Е.С. Гариной за проведение анализа сополимеров методом ГПХ и JI.A. Казарину - за помощь в исследовании полимеров методом ИК-спектроскопии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Schmolka I.R. // Polymers for Controlled Drug Delivery / Ed. by Tarcha P.J. Boca Raton; Ann Arbor, Boston: CRC Press, 1991. P. 189.
2. Moghimi S.M., Hunter A.C. // Trends Biotechnol. 2000. V. 18. № 10. P. 412.
3. Kabanov A.V., Chekhonin V.P., Alakhov V.Yu., Batrako-va E.V., Lebedev A.S., Melik-Nubarov N.S., Arzhak-ovS.A., Levashov A.V., Morozov G.V., Severin E.S. // FEBS Lett. 1989. V. 258. № 2. P. 343.
4. Anthony P., Lowe K.C., Davey M.R., Power J.B. // Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 1998. V. 26. № 1. P. 27.
5. Kabanov A.V., Okano T. // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. V. 519. P. 1.
6. Demina Т., Grozdova I., Krylova O., Zhirnov A., Istra-tov V., Frey H., Kautz H., Melik-Nubarov N. // Biochemistry. 2005. V. 44. № io. P. 4042.
7. Firestone M.A., Seifert S. // Biomacromolecules. 2005. V. 6. № 5. P. 2678.
8. Firestone M.A., Wolf A.C., Seifert S. H Biomacromolecules. 2003. V. 4. № 6. P. 1539.
9. Krylova O.O., Melik-Nubarov N.S., Badun G.A., Kseno-fontovA.L.,MengerF.M., YaroslavovA.A. //Chem. Eur. J. V. 9. № 16. P. 3930.
10. Дехант И., Дани, P., Киммер В., Шмольке Р. // Инфракрасная спектроскопия полимеров. М.: Химия, 1976.
11. Kozlov М. Yu., Melik-Nubarov N.S., Batrakova Е. V., Kabanov A.V. // Macromolecules. 2000. V. 33. № 9. P. 3305.
12. Melik-Nubarov N.S., Pomaz O.O., Dorodnych T.Yu., Badun G.A., Ksenofontov A.L., Schemchukova O.B., Arzha-kov SA. H FEBS Lett. 1999. V. 446. № 1. P. 194.
13. New R.R.C. Ц Liposomes: a Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1990.
14. Harrigan P.R., Wong К.F., Redelmeier Т.Е., Wheeler JJ., Cullis P.R. II Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1149. №2. P. 329.
15. Erukova V.Yu., Krylova O.O., Antonenko Yu.N., Melik-Nubarov N.S. II Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1468. № 1-2. P. 73.
16. McIntyreJ.C., Sleight R.G. II Biochemistry. 1991. V. 30. №51. P. 11819.
17. Düzgiines N., Wilschut J. // Methods Enzymol. 1993. V. 220. P. 3.
18. Лимфоциты. Методы. / Под ред. Клауса Дж. М.: Мир, 1990.
19. Alexandridis Р., Holzwarth J.F., Hatton T.A. // Macromolecules. 1994. V. 27. № 9. P. 2414.
20. Heerklotz H., Seelig J. /I Biophys. J. 2000. V. 78. № 5. P. 2435.
21. De la Maza A., Lopez O., Coderch L., Parra J.L. // Colloids and Surfaces. A. 1998. V. 145. № 1-3. P. 83.
22. Altinok H., Yu G.E., Nixon S.K., Gorry P.A., At-twoodD., Booth C. // Langmuir. 1997. V. 13. № 22. P. 5837.
23. Zhirnov A.E., Demina T.V., Krylova O.O., Grozdo-va ID., Melik-Nubarov N.S. // Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1720. № 1-2. P. 73.
24. Plasek J., Jarolim P. // Gen. Physiol. Biophys. 1987. V. 6. № 5. P. 425.
25. ParsegianA. // Nature. 1969. V. 221. № 183. P. 844.
26. Топчиева И.H., Осипова C.B., Банацкая M.И., ВальковаЛЛ. // Докл. АН СССР. 1989. Т. 308. №4. С. 910.
27. Bryskhe К., Schillén К., Löfroth J.-E., Olsson U. // Phys. Chem. Chem. Phys. 2001. V. 3. P. 1303.
Effect of the Structure of Ethylene Oxide-Propylene Oxide Block Copolymers on Their Interaction with Biological Membranes
A. E. Zhirnov, D. N. Pavlov, T. V. Demina, G. A. Badun, I. D. Grozdova, and N. S. Melik-Nubarov
Faculty of Chemistry, Moscow State University, Leniskie gory, Moscow, 119992 Russia e-mail: melik.nubarov@genebee.msu.ru
Abstract—Partition coefficients of ethylene oxide-propylene oxide block copolymers between the lipid phase and water have been estimated via equilibrium dialysis. It has been shown that for the triblock copolymer (plu-ronic L61), the partition coefficient is 45 ± 9, while for the diblock copolymer (REP), this parameter is as high as 78 ± 17. The effect of the copolymers on the permeation of the charged organic ion carboxyfluorescein across the lecithin bilayer membrane changes in the same direction. Even though the triblock copolymer binding is weaker, it shows a stronger effect on the rate of transbilayer migration of lipids and on the permeation of the uncharged substance (doxorubicin). The incorporation of cholesterol into the membrane decreases its sensitivity to the action of copolymers; however, the character of changes induced by both copolymers remains invariable. The experimental data of this study indicate that the triblock structure of amphiphilic macromolecules is responsible for their higher ability to disturb lipid bilayer membranes.
