CC BY
58
УДК 577.352.2
ПЭГ-ХИТОЗАН - СТАБИЛИЗИРУЮЩИЙ АГЕНТ ДЛЯ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ СУСПЕНЗИЙ: ВЛИЯНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ И СТЕПЕНИ ПЭГИЛИРОВАНИЯ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОМПЛЕКСА
И.М. Ле-Дейген*, Е.В. Кудряшова
(кафедра химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; *i.m.deygen@gmail.com)
Продемонстрирована возможность регуляции физико-химических свойств (стабильность, размер, заряд, устойчивость) липосомальных контейнеров для доставки лекарственных препаратов путем подбора молекулярной массы и степени модификации ПЭГ-хитозана. Обнаружено влияние молекулярной массы и степени модификации хитозана на процесс высвобождения доксорубицина из липосомальных контейнеров в зависимости от свойств полимера и рН среды.
Ключевые слова: доксорубицин, липосомы, хитозан, ИК-спектроскопия Фурье. Список сокращений: КЛ - кардиолипин, ДПФХ - дипальмитоилфосфатидилхолин, ПЭГ - полиэтиленгликоль.
Несмотря на прогресс в создании новых лекарственных средств, актуальной остается задача создания новых систем доставки активных молекул. К подобным системам предъявляют ряд требований: нетоксичность, биодеградиру-емость, отсутствие иммунного ответа, замедленное высвобождение карго [1]. Внимание исследователей привлекают липосомы, биосовместимые липидные везикулы [2]. Широкое применение липосом в медицинских целях до сих пор ограничено из-за ряда недостатков, в первую очередь из-за низкой термодинамической стабильности и склонности к агрегации [3]. Разработаны различные подходы, позволяющие повысить стабильность липосом при хранении [4], в частности, использование ПЭГилирован-ных липидов и стабилизирующих оболочек на основе биосовместимых полимеров. Актуальной остается задача выявления закономерностей влияния свойств таких стабилизирующих добавок на структурно-функциональные свойства получаемых комплексов.
Ранее была показана существенная стабилизация липосом за счет комплексообразования с ПЭГ-хитозаном [5].
Цель данной работы состояла в изучении влияния молекулярной массы (М) хитозана (5, 15 и 90 кДа) и степени ПЭГилирования на структурно-функциональные свойства липо-сом, загруженных модельным лекарственным препаратом доксорубицином.
Экспериментальная часть
Материалы и методы
В работе использовали следующие материалы: кардиолипин (КЛ) динатриевая соль, раствор в хлороформе (25 мг/мл); дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ), раствор в хлороформе; яичный лецитин, раствор в хлороформе - препараты фирмы «Avanti Polar Lipids» (США); хитозан с молекулярной массой 5, 15 и 90 кДа; доксорубицина гидрохлорид - препараты фирмы «Sigma-Aldrich» (США), а также mPEG-suc-NHS - препарат фирмы «Nanocs» (США).
ИК-спектры регистрировали на ИК-спектрометре Фурье «Tensor 27» («Bruker», Германия), оснащенном MCT-детектором, охлаждаемым жидким азотом, с термостатом фирмы «Huber» (США). Измерения проводили в термостатиру-емой ячейке нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО, BioATR-II, «Bruker», Германия) с использованием кристалла однократного отражения ZnSe, при 22 °С и постоянной скорости продувки системы сухим воздухом аппаратом «Jun-Air» (Германия). На кристалл ячейки НПВО наносили аликвоту (50 мкл) образца, спектр регистрировали трижды в интервале от 4000 до 950 см-1, с разрешением 1 см-1; проводили 70-кратное сканирование и усреднение. Фон регистрировали аналогично. Спектры анализировали с помощью программы Opus 7.0 Bruker.
Определение размеров везикул проводили с помощью системы «Zetasizer Nano S» («Malvern»,
Англия) (4 мВт He-Ne-лазер, 633 нм) в термоста-тируемой ячейке при 22 °С.
Флуоресцентный анализ. Регистрировали спектр эмиссии при длине волны возбуждения 480 нм в интервале от 490 до 600 нм с помощью прибора «Varían Cary». Определяли интенсивность пика при 590 нм.
Синтез сополимеров ПЭГ-хитозан. Хитозан растворяли в 3%-й уксусной кислоте при интенсивном перемешивании. После получения прозрачного раствора его рН доводили до 6,5 добавлением 5 мМ натрий-фосфатного буфера; финальная концентрация хитозана составила 3 мг/мл. В него по каплям при перемешивании вводили 5-20-кратный молярный избыток раствора монометокси-ПЭГ-^гидроксисукцинимидилсукцината mPEG-suc-NHS (М = 5кДа) в DMSO в пересчете на 1 моль дезацилированных аминогрупп хитозана, при этом кислотность раствора доводили до pH 7,5 натрий-фосфатным буфером. Смесь интенсивно перемешивали в течение 1-4 ч. Очистку проводили путем диафильтрации с применением фильтров «Amicon Ultra» (США). Полноту очистки контролировали ИК- и УФ-спектроскопией.
Степень модификации хитозана поли-этиленгликолем определяли по числу свободных аминогрупп в сополимере ПЭГ-хитозан по сравнению с исходным препаратом хитозана. Регистрацию кинетических кривых образования окрашенных аддуктов аминогрупп хитозана с тринитробензолсульфокислотой (ТНБС) проводили на УФ-спектрофотометре. В кювету, содержащую 3 мл 0,1 М натрий-боратного буферного раствора (рН 8,5), добавляли 0,05 мл 1 М раствора ТНБС в воде, вносили аликвоту (50 мкл 1-2 мг/мл раствора) сополимера, перемешивали и регистрировали изменение оптического поглощения при 420 нм в течение 60 мин при 22 °С. Кювета сравнения содержала 3 мл того же буфера и 0,05 мл раствора ТНБС. Полученную кинетическую кривую изменения оптического поглощения экстраполировали к начальному моменту и по полученному значению определяли процентное содержание свободных аминогрупп в образце ПЭГ-хитозана; за 100% принимали содержание аминогрупп в немодифицированном хитозане.
Определение степени модификации хитозана ПЭГ методом ИК-спектроскопии проводили по полосе поглощения ПЭГ при 1089 см \ соответствующей валентным колебаниям C-O-C-связи. В ячейку НПВО ИК-спектрометра помещали 30 мкл раствора образца ПЭГ-хитозана (0,52,0 мг/мл). ИК-спектр регистрировали в интервале 4000-900 см 1 и определяли интенсивность поло-
сы поглощения образца на частоте 1089 см 1. Содержание ПЭГ-цепей в препарате хитозана определяли по калибровочному графику (зависимость интенсивности поглощения при 1089 см 1 от концентрации ПЭГ для свободного ПЭГ с М = 5 кДа). При этом учитывали вклад фона (собственного поглощения хитозана) при 1089 см-1.
Получение малых моноламеллярных липосом, загруженных доксорубицином. Липосомы получали по методике, описанной в работе [6]. Для получения загруженных доксорубицином липосом в липидную пленку перед диспергированием добавляли раствор доксорубицина в натрий-фосфатном буферном растворе. Свободный доксорубицин отделяли диализом против натрий-фосфатного буферного раствора (Serva MW cut-off 3500) с контролем сохранности липосом.
Получение комплексов липосом с конъюга-тами хитозана. К раствору липосом (5 мг/мл) в натрий-фосфатном буферном растворе (рН 7,4) добавляли по каплям при перемешивании раствор полимера в основомольном соотношении липосомы: полимер = 1:7 (насыщающее соотношение было определено ранее в [7]), после чего ком -плексы инкубировали в течение 1 ч при интенсивном перемешивании.
Исследование кинетики высобождения доксорубицина. Методом диализа проводили смену буферного раствора липосом: на ацетатный (pH 5,5 для имитации опухолевой клетки). Затем липосомальную суспензию переносили в диализную капсулу, помещали на качалку (T = 37 °C). В течение 50 ч отбирали пробы внешнего раствора и детектировали спектр флуоресценции.
Обсуждение результатов
Синтез и характеристика производных хи-тозана. Синтез производных хитозана разной молекулярной массы (5, 15 и 90 кДа) проводили путем ацилирования свободных аминогрупп активированным производным полиэтиленгликоля. Подробно синтез изложен в работе [5]. Определение степени модификации проводили методом ИК-спектроскопии Фурье по интенсивности характеристической полосы поглощения -С-О-С-связи в цепях ПЭГ, результаты контролировали классическим методом титрования свободных аминогрупп тринитробензолсульфокислотой (ТНБС). Результаты определения степени модификации полученных в работе образцов ПЭГ-хитозана представлены в табл. 1. Следует отметить хорошую сходимость результатов, полученных двумя методами, при этом результаты ИК-спектроскопии характеризуются меньшей величиной стандартного
Т а б л и ц а 1
Определение степени модификации ПЭГ-хитозана методами ИК-спектроскопии Фурье и титрования
свободных аминогрупп ТНБС
Образец М, кДа ПЭГ/АГ Степень модификации, % Число цепей ПЭГ на молекулу хитозана
ИК-спектроскопия ЯБ, п = 3 ТШЯ-титрование ЯБ, п = 3
ПЭГ-хитозан-90-5 90 2 5,0 0,5 4,0 1,0 12
ПЭГ-хитозан-90-14 4 14,0 0,2 11,0 1,9 33
ПЭГ-хитозан-90-15 5 15,0 0,5 13,0 2,8 36
ПЭГ-хитозан-90-18 6 18,0 0,5 17,0 2,3 43
ПЭГ-хитозан-90-25 10 25,0 0,9 25,0 1,9 60
ПЭГ-хитозан-15-20 15 3 20,0 0,9 19,0 3,3 8
ПЭГ-хитозан-15-22 5 22,0 0,5 22,0 2,3 9
ПЭГ-хитозан-5-15 5 3 15,0 0,4 13,5 1,6 2
отклонения. Вероятно, это связано с тем, что в методе ИК-спектроскопии Фурье напрямую определяется содержание ПЭГ в системе, в то время как титрование свободных аминогрупп ТНБС является косвенным методом и часто осложнено побочными процессами (фоновый гидролиз ТНБС, образование аддуктов с другими функциональными группами, стерические затруднения при образовании окрашенного аддукта при анализе полимеров).
Изучение механизма комплексообразования анионных липосом с производными хитозана. Для изучения молекулярного механизма комплек-сообразования липосом с ПЭГ-хитозаном и определения сайтов связывания полимера на поверхности мембраны в качестве основного метода исследования использовали метод ИК-спектроскопии, в качестве комплементарного метода применяли метод динамического светорассеяния.
ИК-спектроскопия Фурье в режиме нарушенного полного внутреннего отражения представляется удобным методом для диагностики состояния липидной мембраны [5, 7, 8]. В ИК-спектре липосом обращают на себя внимание ряд интенсивных полос поглощения, по изменениям которых можно судить о влиянии лигандов на структуру липосом. Две полосы поглощения, соответствующие симметричным и ассиме-тричным колебаниям углеводородных связей (2853±5 и 2926±5 см 1) чувствительны к изменениям плотности гидрофобных цепей липидов. Полоса поглощения карбонильной группы С=0 (1730-1750 см 1) является сенсором взаимодействия на поверхности липид-вода. Полоса погло-
щения ассиметричных валентных колебаний фосфатной группы (1220-1260 см-1) чувствительна к взаимодействиям с катионными лигандами.
В случае комплексообразования с сополимерами ПЭГ-хитозана полосы поглощения фосфатной и карбонильной групп претерпевают единообразный высокочастотный сдвиг, указывающий на образование электростатических связей между фосфатными группами липидов на поверхности липо-сом с аминогруппами хитозана.
Интересно отметить наблюдаемые различия во взаимодействии липосом с производными хи-тозана малой и средней молекулярной массы (5, 15 кДа) и высокомолекулярного хитозана (90 кДа). Сдвиги полосы поглощения фосфатной группы в случае комплекса липосом с производными высокомолекулярного хитозана более выражены по сравнению с производными хитозана, имеющими молекулярную массу 5 и 15 кДа. Вероятно, это обусловлено способностью более крупных полимерных молекул вызывать латеральную сегрегацию молекул кардиолипина в поверхностном слое липосом. Более того, для комплексов липосом с производными высокомолекулярного хитозана (90 кДа) в ИК-спектре появляется низкочастотный сдвиг полос поглощения ацильных цепей, указывающий на снижение подвижности гидрофобных хвостов. Подобный эффект ранее был обнаружен при взаимодействии анионных липосом с поли-Н-этил-4-винилпиридиний бромидом [9]. Положения основных полос поглощения в ИК-спектре липосом и их комплексов с полимерами представлены в табл. 2.
Т а б л и ц а 2
Частота характеристических полос поглощения в ИК-спектрах и средний гидродинамический радиус липосом ДПФХ/КЛ (80/20 по весу) в комплексе производными хитозана в сравнении со свободными
липосомами
Образец Частоты колебаний групп, см 1 Я, нм Интерпретация
СН2 СН2 8 С=0 Р02
Липосомы 2920 2851 1739 1723 (плечо) 1225 103 гелеобразное состояние
Липосомы -хитозан (90 кДа) 2919 2850 1730 1742 (плечо) 1726 (плечо) 1244 118 эффективное взаимодействие с анионными группами, снижение подвижности гидрофобной части бислоя
Липосомы -ПЭГ-хитозан-90-5 2919 2850 1731 1240 120
Липосомы -ПЭГ-хитозан-90-14 2918 2850 1740 1245 1220 (плечо) 118
Липосомы -ПЭГ-хитозан-90-15 2918 2851 1742 1245 1222 (плечо) 120
Липосомы -ПЭГ-хитозан-90-18 2918 2849 1741 1244, 1263 120
Липосомы -ПЭГ-хитозан-90-25 2917 2849 1744 1263 123
Липосомы -хитозан-15 2920 2851 1743 1230 117 взаимодействие с фосфатными и карбонильными группами липидов
Липосомы -ПЭГ-хитозан-15-20 2920 2850 1744 1720 (плечо) 1244 119
Липосомы -ПЭГ-хитозан-15-22 2920 2850 1744 1243 117
Липосомы -хитозан-15 2920 2850 1741 1232 119
ПЭГ-хитозан-5-15 2920 2850 1743 1723 (плечо) 1240 119
Помимо наблюдаемых сдвигов характеристических полос в ИК-спектре липидной мембраны, о комплексообразовании липосом с ПЭГ-хитозаном свидетельствует увеличение среднего размера везикул, как это было определено методом динамического светорассеяния. Так, несвязанные липосомы характеризуются средним радиусом 103±2 нм. Образование комплекса с ПЭГ-хитозаном-90-25 приводит к увеличению радиуса до 120±3 нм, и толщину «полимерной шубы» можно оценить в 20 нм.
Влияние молекулярной массы и степени модификации ПЭГ-хитозана на высвобождение доксорубицина. Исследовано влияние состава полимерной оболочки на процесс высвобождения доксорубицина из липосом. Доксорубицин - хорошо изученное модельное лекарство, обладающее интенсивной красной флуоресценцией [10]. Метаболизм опухолевых клеток значительно отличается от метаболизма клеток здоровых. Ускоренная пролиферация и нарушение процессов диффе-ренцировки приводят к изменению состава цито-
плазмы. Так, для ряда линий опухолевых клеток обнаружен эффект «закисления», т.е. снижение рН до 5,5 [11]. Поэтому в данной работе был рассмотрен процесс высвобождения доксорубицина из липосом в натрий-ацетатном буферном растворе (рН 5,5) в сравнении с натрий-фосфатным буферным раствором (рН 7,4).
Доксорубицин в течение 18-20 ч полностью высвобождается из липосом как в нейтральной, так и в кислой среде (рисунок, кривые 1). Полимерная оболочка ПЭГ-хитозана замедляет высвобождение лекарства в нейтральной среде (рисунок, кривые 2-5). В течение 50 ч не достигается полного высвобождения доксорубицина из комплексов липосом с производными хитозана. Наиболее выражен этот эффект для комплексов липосом с ПЭГ-хитозаном-15-20 и ПЭГ-хитозаном-90-25 (рисунок, кривые 4-5), т.е. для комплексов, несущих на себе наибольшее число цепей ПЭГ. В случае полимеров с низким содержанием ПЭГ (ПЭГ-хитозан-15-5) снижение скорости высвобождения доксорубицина выражен в меньшей степени. Сравнение хода кривых 3 и 4 (рисунок, а), соответствующих комплексам липосом с ПЭГ-хитозаном-15-5) и ПЭГ-хитозаном-15-20, показывает, что на начальном участке кривые идут симбатно, однако спустя 10 ч высвобождение из комплекса с ПЭГ-хитозаном-15-20 практически выходит на плато, в то время как кривая 3 продолжает монотонный рост на участке 10-24 ч, затем она также выходит на плато.
В кислой среде (рисунок, б), напротив, высвобождение всего содержимого из комплексов липосом с ПЭГ-хитозаном осуществляется за 50 ч. Особенно интересен начальный участок
а
высвобождения (0-10 ч). Контрольный образец -липосомы без полимерной оболочки спустя 10 ч высвобождают практически весь доксорубицин (рисунок, б; кривая 1). С небольшим замедлением высвобождает содержимое комплекса липо-сом с ПЭГ-хитозаном-5-20 (рисунок, б; кривая 2) самым низкомолекулярным полимером. Несмотря на высокую степень модификации, каждая молекула хитозана несет на себе лишь две цепи ПЭГ (табл. 1). Комплексы с ПЭГ-хитозаном-15-5 и ПЭГ-хитозаном-15-20 демонстрируют практически единообразный ход высвобождения (рисунок, б; кривые 3, 4). Медленнее всего содержимое высвобождается из комплекса липосом с ПЭГ-хитозаном-90-25 (рисунок, б; кривая 5). Вероятно, наблюдаемое различие в кинетике высвобождения доксорубицина связано с влиянием рН на эффективность электростатических взаимодействий между анионными группами липидов и аминогруппами полимера. В кислых средах аминогруппы хитозана заряжены, что определяет более высокую подвижность полимерных цепей в комплексе с липосомами, процесс высвобождения доксору-бицина ускоряется относительно нейтральной среды, где полимер склонен образовывать гелеподоб-ную структуру вокруг липосомальной мембраны. В кислой среде, как и в щелочной, степень ПЭГилирования и молекулярная масса хитозана влияют на скорость высвобождения доксоруби-цина: чем больше молекулярная масса хитозана и чем больше степень ПЭГилирования, тем медленнее высвобождается содержимое (рисунок, б). Вероятная причина наблюдаемого эффекта заключается в том, что многоточечное взаимодействие с липосомальной мембраной усиливается при уве-
б
£
Время, ч
Высвобождение доксорубцина из липосом и их комплексов при рН 7,4 (а) и 5,5 (б): 1 - свободные липосомы, 2 - комплекс липосом с ПЭГ-хитозаном-5-15, 3 - комплекс липосом с ПЭГ-хитозаном-15-5, 4 - комплекс липосом с ПЭ-Гхитозаном-15-20, 5 - комплекс липосом с ПЭГ-хитозаном-90-25
личении молекулярной массы хитозана и гидрат-ная оболочка существенно увеличивается в объеме при увеличении содержания ПЭГ в частице.
Полученные результаты могут служить основой для создания стимул-чувствительных липо-
сомальных контейнеров для доставки лекарственных средств, причем представляется возможной регуляция физико-химических свойств контейнера путем подбора молекулярной массы хитозана и степени его модификации.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Petros R.A., DeSimone J.M. // Nature Rev. Drug. Disc. 2010. Vol. 9. P. 615.
2. Yingchoncharoen P., Kalinowski D., Richardson D. // Pharmacol. Rev. 2016. Vol. 68. P. 701.
3. UlrichA.S. // Biosci. Rep. 2002. Vol. 22. P. 129.
4. Ingvarsson P.T., Yang M., Nielsen H.M., Rantanen J., Foged C. // Expert Opin Drug Deliv. 2011. Vol. 8. P. 375.
5. Deygen I.M., Kudryashova E.V // Russ. J. Bioorganic Chem. 2014. Vol. 40. P. 547.
6.Бабицкая С.В., ЖуковаМ.В., Кисель М.А., Кузьмицкий Б.Б., Макович А.Е, Насек В.М., Черноок Н.Н., Шни-
гир В.М. // Химико-фармацевтический журнал. 2006. Т. 40. С. 36.
7. Deygen I., Kudyashova E. // Colloids and Surfaces B. 2016. Vol. 141. P. 36.
8. Moreno M.M., et al. // BBA. 2009. Vol. 1788. P. 1296.
9. A.A. Yaroslavov, A.A. Efimova, A.V Sybachin // Polymer Science Series A. 2009. Vol. 51. P. 638.
10. Pavlov D.N., Dorodnykh T.Y, Zaborova O. V., Melik-Nubarov N.S. // Polym. Sci. Ser. A. 2009. Vol. 51. Р. 295.
11. Yaroslavov, A.A., et al. // Polymer science. 1994. Vol. 36. P. 215.
Поступила в редакцию 23.11.17
PEG-CHITOSAN AS A PERSPECTIVE STABILIZING AGENT FOR LIPOSOMAL SUSPENSION: MOLECULAR WEIGHT AND PEGYLATION DEGREE INFLUENCE ON THE PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES OF COMPLEX
I.M. Le-Deygen*, E.V. Kudryashova
(Department of chemical enzymology, Faculty of chemistry, Lomonosov Moscow State University, Moscow; *e-mail: i.m.deygen@gmail.com)
The possibility of regulation of physico-chemical properties (stability, size, binding sites) of liposomal containers for drug delivery by selection of molecular weight and the degree of modification of ПЭГ-chitosan has been demonstrated. The effect of the regulation of the release of doxorubicin from liposomal containers depending on the properties of the polymer and pH was demonstrated.
Key words: doxorubicin, liposomes, chitosan, FTIR.
Сведения об авторах: Ле-Дейген Ирина Михайловна - мл. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (I.m.deygen@gmail.com); Кудряшова Елена Вадимовна - доцент кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, докт. хим. наук (helena_koudriachova@hotmail.com).
