CC BY
153
УДК 591.391.1
ВЛИЯНИЕ СТИМУЛЯЦИИ ОВУЛЯЦИИ И УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ НА ИСХОД ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ У ЖЕНЩИН РАЗНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП
А.В. Нефедова, Т.И. Пестова, М.Д. Русакова, Г.В. Брюхин* ООО «Центр лечения бесплодия»
*ЧелГМА, г. Челябинск
Проведен анализ влияния стимуляции овуляции и условий культивирования на исход экстракорпорального оплодотворения у женщин разных возрастных групп. Показано, что наступление беременности зависит, прежде всего, от возраста и здоровья женщины, от качества эмбрионов, которое определяется этими факторами, а не от проведения эмбриологического этапа цикла ЭКО.
Ключевые слова: экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО), интрацито-плазматическая инъекция сперматозоида в ооцит (ИКСИ), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), человеческий менопаузальный гормон (ЧМГ).
Появление ребенка, зарождение новой жизни □ это великое таинство, данное нам природой. Но порой жизнь вносит свои коррективы, и необходимый для наступления беременности процесс слияния двух клеток □ процесс оплодотворения □ становится невозможным.
В настоящее время бесплодие по вине как мужа, так и жены остается актуальной проблемой и встречается у 8П10 % супружеских пар, помочь которым зачастую можно только методом экстракорпорального оплодотворения.
Важно заметить, что на фертильность пар влияет ряд общих эпидемиологических факторов, например возраст, который является основной детерминантой женской фертильности, в том числе огромную роль играет курение и образ жизни обоих партнеров [2].
Уровень современной науки позволяет достаточно быстро выявить причину бесплодия, но устранить ее бывает чрезвычайно сложно.
Последнее время методы стимуляции генеративной функции яичников, забора ооцитов и культивирования эмбрионов in vitro подвергались существенному усовершенствованию. Однако на сегодняшний день показатель успешных исходов, критерием которого является частота рождения живых детей, остается достаточно низким и колеблется в пределах 20С25 %. Невысокие показатели конечного исхода искусственного оплодотворения обусловлены, прежде всего, тем, что еще многое остается неизвестно о факторах, влияющих на процесс искусственно индуцированного зачатия [3, 5].
Еще в начале 1970-х годов основоположники ЭКО R.G. Edwards и P.C. Steptoe стали использовать стимуляцию яичников для получения ооцитов и оплодотворения их вне организма человека.
Первая беременность наступила в естественном цикле, а последующие беременности □ уже в стимулированных циклах. Абсолютным показанием для стимуляции функции яичников являются ано-вуляторные нарушения, при которых стимуляция фолликулогенеза и овуляции патогенетически обоснована для достижения беременности [3].
В настоящее время стимуляция яичников гонадотропинами в программах ЭКО является обязательным компонентом, цель которого получить большое число ооцитов для того, чтобы выбрать лучшие, компенсировать потери ооцитов при оплодотворении и эмбрионов при их культивировании и оставить генетический материал для криоконсервации.
История стимуляции яичников гонадотропинами имеет два значительных этапа: использование мочевых и менопаузальных гонадотропинов (60С90-е годы XX века) и применение рекомбинантных препаратов (в настоящее время). Не утихают дебаты о сравнительной эффективности и безопасности мочевых и рекомбинантных препаратов. Нет достоверных данных о преимущественной эффективности той или иной группы препаратов [1, 3, 4]. В нашей работе мы решили проанализировать влияние стимуляции овуляции и условий культивирования на исход ЭКО в разных по возрасту группах женщин.
Материалы и методы исследования. В настоящем исследовании проведен ретроспективный анализ протоколов лаборатории «Вспомогательных репродуктивных технологий □ (ВРТ) ООО «Центр лечения бесплодия □ за 2009 год, в зависимости от препаратов, которыми стимулировали суперовуляцию. За 2009 год было проанализировано 65 циклов, в которых для стимуляции овуляции применялись препараты чистого фолликулостимули-
Проблемы здравоохранения
рующего гормона (ФСГ): СПурегонП (фирма CDp-ганон» Голландия) и СГонал-ФП (фирма ССероноЦ Италия); препараты человеческого менопаузального гормона (ЧМГ) СМенопурП (фирма СФер-ринг» Германия) и СЛуверисП □ препарат, содержащий рекомбинантный лютеинизирующий гормон (INDUSTRIA FARMACEUTICA SERONO, S.p.A. Италия).
В настоящее время существуют показания для выбора препаратов стимуляции, которые будут наиболее эффективными и безопасными для каждой пациентки.
Циклы были разделены на три группы. В первую группу вошли женщины, в возрасте до 34 лет. В этой группе стимуляция суперовуляции проводилась препаратами, содержащими чистый фолликулостимулирующий гормон (ФСГ). Вторую группу составили пациентки старшего репродуктивного возраста (36 И-3 года), их стимулировали препаратом, содержащим человеческий менопаузальный гормон (ЧМГ) (17 человек). Третью группу составили пациентки разного репродуктивного возраста, у которых в процессе стимуляции изменялся прокол использования препаратов, так как был получен неожиданный бедный ответ, либо пациентки с резецированными яичниками и эндо-метриозом в анамнезе (14 человек). В данном случае для стимуляции суперовуляции применялись препараты, содержащие ФСГ и ЧМГ или ФСГ и рекомбинантный ЛГ.
Культивирование эмбрионов проводилось на средах фирмы DMediCultn (Дания) по одной схеме: с момента пункции до 22-24 ч культивировали в Universal IVF media, с 24П52 ч в ISM1 media, с 52120 ч в Blast Assist media.
Среды являются секвенциальными, то есть имеют различный состав, отвечающий метаболическим потребностям эмбрионов на конкретных стадиях развития, и позволяют культивировать эмбрионы до преимплантационной стадии □ бластоцисты. Условия в инкубаторе: 5,5 % СD2, влажность камеры 88 %, температура в инкубаторе 37,0-37,2 °С.
Для инсеминации при 3KD использовали сперму, в которой концентрация активно-подвижных сперматозоидов была не менее 10 □ 106/мл и процент морфологически нормальных форм более 5 %. В том случае, если концентрация активноподвижных сперматозоидов была менее 10 □ 106/мл и процент морфологически нормальных форм менее 5 %, то оплодотворение делали методом ин-трацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ).
Подготавливали сперму при помощи центрифугирования в градиенте плотностей 40 и 80 % Supra Sperm CMediCult» затем в буферном солевом растворе Flushing media той же фирмы [5].
В тех случаях, когда в результате экстракорпорального оплодотворения было получено менее 5 эмбрионов, перенос делали через 72 ч (на 3 сутки)
на стадии 6-10 бластомеров, чтобы исключить риск остановки дальнейшего развития. Если развивалось более пяти эмбрионов, культивирование продляли. Перенос таких эмбрионов осуществлялся на стадии морулы или бластоцисты (96-120 ч).
Для определения качества 2 -3-суточных эмбрионов использовали 4-балльную шкалу:
эмбрионы отличного качества (4) - АА, АВ,
ВА;
эмбрионы хорошего качества (3) - ВВ;
эмбрионы удовлетворительного качества (2) -ВС, СС;
эмбрионы, ушедшие в дегенерацию (1) - D.
Критерии оценки эмбрионов, которые переносили на 3 сутки (72 ч):
АА - эмбрионы, у которых на вторые сутки имеется 2-4 бластомера, на третьи сутки 8-10 бластомеров регулярной формы с ровными краями;
АВ - эмбрионы, у которых на вторые сутки имеется 2-4 бластомера, на третьи сутки - 8-10 бластомеров регулярной формы с неровными краями и фрагментацией не более 10 %;
ВА - эмбрионы, у которых на вторые сутки имеется 2-4 бластомера, на третьи сутки - 8-10 бластомеров нерегулярной формы с ровными краями;
ВВ - эмбрионы, у которых на вторые сутки имеется 2 И--5 бластомеров, на третьи сутки -8-10 бластомеров нерегулярной формы с неровными краями и цитоплазматической фрагментацией не более 30 %;
ВС - эмбрионы, у которых на вторые сутки имеется 2 И--6 бластомеров, на третьи сутки -8-10 бластомеров нерегулярной формы с неровными краями, вакуолизированной цитоплазмой и с фрагментацией не более 50 %;
СС - эмбрионы, у которых на вторые сутки имеется 2 И--6 бластомеров, на третьи сутки -2И-6-8П0 бластомеров нерегулярной формы с неровными краями, вакуолизированной цитоплазмой и с фрагментацией более 50 %;
D - эмбрионы, остановившиеся в развитии, у которых начались видимые процессы дегенерации.
D^ma качества морул и бластоцист осуществлялась по классификации Г арднера.
Статистический анализ проводился с использованием программы SPSS Statistics 17.0.
Характеристика трех групп обследованных групп женщин представлена в табл. 1-4.
Результаты собственных исследований. В ходе проведения эксперимента были выявлены следующие закономерности.
Первые две группы отличаются по возрасту, за исключением третьей группы, куда вошли женщины разного репродуктивного возраста, у которых в процессе стимуляции изменялся прокол использования препаратов, так как был получен неожиданный бедный ответ, либо пациентки с резецированными яичниками и эндометриозом в анамнезе.
Нефедова А.В., Пестова Т.И., Русакова М.Д., Брюхин Г.В.
Влияние стимуляции овуляции и условий культивирования эмбрионов на исхода
Как видно из табл. 2, средняя продолжительность стимуляции суперовуляции у женщин всех групп составила в среднем 13 дней.
Ко дню пункции у женщин, принимавших только ФСГ, получено большее количество зрелых фолликулов (диаметром 16 мм и более) (10,23 ± ± 0,78), чем у женщин других групп, получавших ЧМГ и комбинацию ЧМГ+ФСГ и ЧМГ+ЛГ (4,0 ± ± 0,51 и 3,9 ± 0,67 фолликула), что характерно для состава групп по возрастному и репродуктивному анамнезу (см. табл. 2).
После проведения пункции у женщин второй и третьей группы было получено примерно одинаковое число ооцитов (4,35 ± 0,93 и 4,35 ± 0,91), что значительно меньше, чем в первой группе, где число ооцитов составило (11,5 ± 1,29). Данные показатели соответствуют предыдущему критерию.
Несмотря на большое количество полученных ооцитов в первой группе по сравнению с остальными двумя, процент оплодотворения в группах не намного отличается, это связано с получением в первой группе большого числа незрелых клеток. Доля правильно оплодотворившихся ооцитов в группах соответствует современным данным.
Процент оплодотворения в ЭКО был самым высоким у женщин третьей группы. Процент оплодотворения в ИКСИ был самым высоким во второй группе, это связано с тем, что в данной группе пациентов ИКСИ было проведено из-за Скенского фактора» то есть в этих циклах было получено менее трех клеток, в таких ситуациях, чтобы повысить процент правильно оплодотворившихся ооцитов (2РМ), рекомендуется делать ИКСИ.
Изначально ИКСИ дает больше шансов к правильному оплодотворению, так как способствует преодолению таких факторов, как: низкая (недостаточная для оплодотворения) концентрация активно-подвижных сперматозоидов, низкий процент морфологически правильных клеток, а значит способных к оплодотворению, повышенный уровень антиспермальных антител и т. п., каждый из которых может повлиять на процесс самостоятельного оплодотворения сперматозоидами.
Средний процент эмбрионов, продолжающих свое развитие на день переноса, от числа полученных 2РМ зигот был максимальным в третьей группе, но качество эмбрионов в этой группе отличалось в худшую сторону от двух других. Это связано с тем, что перенос эмбрионов в этой группе чаще производили на третьи сутки, так как количество эмбрионов было менее 5. Обычно на этой стадии развития еще невозможно отличить потенциал жизнеспособности у каждого из эмбрионов, так как они еще не успели миновать стадию 8 клеток, когда включается в работу их личный геном. К пятым суткам, как правило, число развивающихся эмбрионов уменьшается и появляется возможность выбрать лучшие из них для переноса и витрификации.
Перенос эмбрионов в матку женщины проводился на третий или пятый день после пункции. В зависимости от сопутствующих факторов (качества полученных эмбрионов, возраста женщины, уровня готовности эндометрия для имплантации эмбриона) осуществлялся перенос 1,2 или 3 эмбрионов. Как видно из табл. 4, среднее количество
Таблица 1
Общая характеристика обследованных групп женщин
Исследуемый Чистый ФСГ Чистый ЧМГ ФСГ+ЧМГ, ФСГ+ЛГ
показатель (1-я группа) (2-я группа) (3-я группа)
Численность группы 34 17 14
Возраст, лет 29,08 ± 0,6 * (22П35) 39,11 ± 0,55 ** (36И3) 33,07 ± 1,38 (27-42)
Вес, кг 67,85 ± 4,14 72,82 ± 5,71 82,0 ± 9,10
(47П67) (50П52) (42-152)
Здесь и в табл. 2И: * (р < 0,05) □ по сравнению со 2-й группой; ** (р < 0,05) □ по сравнению с 3-й группой.
Таблица 2
Характеристика процесса и исхода стимуляции суперовуляции
Исследуемый показатель Чистый ФСГ Чистый ЧМГ ФСГ+ЧМГ ФСГ+ЛГ
Средняя продолжительность стимуляции овуляции 12,55 ± 0,17 *,** 13,47 ± 0,36 13,85 ± 0,46
Среднее количество фолликулов ( > 16 мм) на день пункции 10,23 ± 0,78 * 4,0 ± 0,51 3,9 ± 0,67
Среднее количество полученных ооцитов 11,5 ± 1,29 *,** 4,35 ± 0,93 4,35 ± 0,91
Средний процент полученных ооцитов от предварительного числа возможных фолликулов 109,5 ± 7,7 % 97 ± 15 % 129 ± 32 %
Проблемы здравоохранения
Таблица 3
Анализ эмбриологического протокола, %
Исследуемый показатель Чистый ФСГ ФСГ+ЧМГ, ФСГ+ЛГ ФСГ+ЧМГ, ФСГ+ЛГ
Средний процент правильно оплодотворившихся ооцитов ЭКО и ИКСИ 70,98 ± 3,76 74,26 ± 6,85 69,52 ± 7,39
Средний процент оплодотворения в ЭКО 74,35 ± 4,88 71,41 ± 7,84 85,24 ± 7,01
Средний процент оплодотворения в ИКСИ 67,40 ± 5,78 85,66 ± 14,33 53,80 ± 10,26
Средний процент эмбрионов, продолжающих свое развитие на день переноса, от числа полученных 2РМ зигот 95,57 ± 3,17 74,26 ± 6,84 100 ± 0,00
Таблица 4
Характеристика перенесенных эмбрионов и результаты проведенных циклов ЭКО
Исследуемый показатель Чистый ФСГ Чистый ЧМГ ФСГ+ЧМГ ФСГ+ЛГ
Среднее количество перенесенных эмбрионов, шт. 2,0 ± 0,1 2,0 ± 0,2 1,9 ± 0,2
Качество перенесенных эмбрионов 3,4 ± 0,1 ** 3,35 ± 0,15 2,85 ± 0,17
Толщина эндометрия на день переноса, мм 10,57 ± 0,41 (7-21) 10,2 ± 0,44 (7,7-14,1) 10,3 ± 0,37 (8,5-13)
Процент наступления беременности 68,75 % * 13,33 % 38,46 %
Процент рождения живых детей 50 % * 0 % 30,7 %
перенесенных эмбрионов не отличалось, но видно, что в 3-й группе имеется тенденция к снижению числа перенесенных эмбрионов 1,9 ± 0,2, в то время как у женщин других групп данный показатель был примерно одинаков. Уменьшение числа перенесенных эмбрионов в 3-й группе может быть обусловлено снижением их качества, а также риском многоплодной беременности в связи с хорошей готовностью эндометрия. Средний показатель толщины эндометрия у всех трех групп был примерно одинаковый, однако частота наступления беременности после переноса эмбрионов оказалась выше у женщин, принимавших фолликулостимулирующий гормон (68,75 %), по сравнению с двумя другими группами. Во второй группе женщин, где для стимуляции суперовуляции применялся человеческий менопаузальный гормон, процент беременностей крайне низкий, что вероятнее всего связано с возрастом и наличием многих других заболеваний в анамнезе.
Таким образом, анализ данных позволяет предположить, что наступление беременности в большей степени зависит от возраста и здоровья женщины, от качества эмбрионов, которое определяется этими факторами, а также от взаимодействия
эмбриона со слизистой оболочкой матки, нежели чем от проведения эмбриологического этапа цикла ЭКО. Кроме того, качество эмбрионов может быть обусловлено и непрогнозируемыми факторами, такими как хромосомные или органные нарушения в половых клетках как мужчины, так и женщины.
Литература
1. Доказательная эндокринология: пер. с англ. □ 2-е изд. □М.: ГЭОТАР-Медия, 2008. □ 640 с.
2. Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в ооцит: современное состояние / под ред. В.И. Кулакова, Л.Н. Кузьмичева, Ю.Е. Мосе-совой. □ М.: ООО «Медицинское информационное агенство » 2007. □344 с.
3. Назаренко, Т.А. Стимуляция функции яичников / Т.А. Назаренко. □ М.: МЕДпресс-информ, 2008. □ 272 с.
4. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. Вводный курс: пер. с англ. □ М.: Мир, 1989. □ 656 с.
5. Элдер, К. Экстракорпоральное оплодотворение: пер. с англ. /Кэй Элдер, Брайан Дэйл. □ М.: МЕДпресс-информ, 2008. □304 с.
Поступила в редакцию 10 января 2011 г.
