CC BY
29СТ0Р1НКА МОЛОДОГОВЧЕНОГО
А. О. Глибовець, С. О. Лашук, Л. М. Мазурець
Укранський нститут експертизи сорлв рослин
УДК: 633.791:631.526.3
Вплив стерилщюгих^агентгв,, регулятор1в росту, вуглевоЫв i гелююгих^агентхв на регенерацию повнощннщ• рослин хмелю при МщоклональноМу ро^Мно-женш*
Розглянуто питання розроблення технологй клонального мкророзмноження на безв'руснш основ1 щнних i перспективних г'рких сорт1в хмелю та вивчення морфогенетичних потенща-л1в рiзних клтин, тканин та органiв хмелю в умовах культури in vitro.
Ключовi слова:
хмть звичайний, клональне мкророзмноження, живильне середовище, рослина-регенерант, вуглеводи,
агар, калюс.
В Укра'У хмiль почали вирощува-ти у промислових масштабах з XIX стол^тя. У 70-80 роки XX стол^тя хмелярство досягло пку, ^ею культурою було засаджено 10 тис. га, а валовий збip досяг 8 тис. тонн, що повшстю задовольняло потреби Держави. Але на початку 1990-х ро-юв поавш площ^ та й саме вироб-ництво хмелю, piзкo скоротилося.
Одшею з проблем при виро-щуваннi хмелю е вipуcнi хвороби, як значно знижують i попршують якicть сировини. Система захoдiв, спрямованих на оздоровлення по-садкового матеpiалу хмелю, базу-еться на методах in vitro зокрема i методу мiкpoклoнальнoгo роз-множення (МКР). Мiкpoклoнальне розмноження - масове безстатеве розмноження, при якому отриман рослини щентичш до вихщноТ бать-ювськоТ форми [1].
У цiлoму метод МКР фунтуеться на iндукoванoму цитокУнами роз-pocтаннi веpхiвкoвих i пазушних меристем, кожна з яких дае початок багатьом пагонам. Швидюсть МКР варю залежно вiд виду рослини,
але часто можна отримати з едино'' бруньки деюлька мтьйошв рослин за рк. При цьому треба вивчити вплив фактopiв, якi впливають на процес мiкpoклoнальнoгo розмноження, зокрема типу експлантату, складу живильних середовищ та умов культивування.
Мета роботи - встановлення впливу cтеpилiзуючих агенлв, ре-гулятopiв росту, вуглевoдiв та ге-люючих агенлв на pегенеpацiю пoвнoцiнних, стерильних рослин хмелю при мiкpoклoнальнoму роз-множенш.
Об'ект дослщження - сорт хмелю Словянка, який занесений до Державного реестру сорлв рослин. Орипнатором сорту е 1нститут хмелярства Нацюнально'Т академи аграрних наук УкраТни [2]. Дош-дження проводили в лаборатори бютехнолги оздоровлення i мкро-клонального розмноження рослин на базi 1нституту cадiвництва НААН.
Методика дослщжень. Для отримання здорових екcплантатiв хмелю використовували живильне середовище Мурааге-Скуга (МС).
Приготування поживних середо-вищ проводилось з використанням традицмних методик, прийнятих у роботах по кулы^ тканин [3] (табл. 1).
Стеpилiзацiю матеpiалу проводили наступним чином: експлантати промивали проточною водою про-тягом 1 год., полм cтеpилiзували в 25% розчин гiдpoхлopиду натpiю та в 0,1% HgCI2 (сулеми) з piзнoю три-валicтю часу. (табл. 2).
Таблиця 1
Склад живильного середовища
Макро МС 50 мл
Мкро МС 1 мл
CaCl2 10 мл
Na2Fe ЕДТА 40 мг
Тiамiн HCI2 (B: ) 1 мл
^ридоксин HCI2 (B6) 0,5 мл
РР 0,5 мл
Адемiнcульфат 40 мг
Мезошозит 100 мг
БАП 0,5 мл
1ОК 0,1 мл
Глюкоза 30 г/л
Агар 7 г
рн 5,6-5,8
* Кер1вник роботи: Медведева Т. В. ст. наук. сгмвробЬн. (1С) НААН
Вплив стер^зуючих areHTiB, регуляторiв росту, вуглеводiв i гелюючих areHTiB на регенерацiю повноцiнних рослин хмелю
при мкрОКЛОНаЛЬНОМу рОЗМНОЖеНН
Культури тканин i оргашв in vitro потребують введення у середови-ще екзогенних pегулятopiв росту i морфогенезу рослин. Як правило, це синтетичн аналоги ауксишв i цитoкiнiнiв, пберелши i абцисова кислота природного походження (таб. 3).
Пкля 2-3 тижыв культивoвaнi експлантати перенесли на рщке жи-вильне середовище того ж складу, але лише з вмiстoм бензиламшо-пурину (БАП) (0,5 мг/л). На цьому середовищ^ через 10 дыв почалося iнтенсивне утворення пагошв. Па-сажування (перенесення) на свiже середовище проводили через кож-н два тижнi. Сфopмoвaнi пагони вщокремлювали iз пpoлiфеpуючих експлaнтaтiв та пересаджували в o^Mi пpoбipки на тверде середовище МС з низькими концентра-^ями iндoлилoцтoвoí кислоти (1ОК) (0,1 мг/л) для вкopiнення [4, 5].
Результати досл1джень. Одним з головних фактсрв, що зумовлюе устх МКР, е пiдбip живильного се-редовища. Основу всiх середовищ складають мiнеpaльнi сoлi, якi мк-тять необхщш для росту рослин макро- i мiкpoелементи. Кpiм того, до Тхнього складу входять амшокисло-ти, фiзioлoгiчнo aктивнi речовини, вггамши тощо [6].
Дoслiди з добору оптимальних середовищ для штенсифкацп ре-генaцiйних пpoцесiв у aпексi хмелю показали, що з цтоТ низки ага-ризованих або рщких середовищ найкращим е тверде середовище Мурааге-Скуге (МС).
Для введення в культуру in vitro в якосп первинного експлантату ви-користовували апкальы (пaзушнi) бруньки здорових рослин хмелю (рис. 1).
Основною умовою одержання калюсних культур е додержання стерильность Для цього використо-вували 70% розчин спирту, розчин пдрохлориду натр^ 25% та 0,1% розчин HgCI2.
У наших достдженнях нaйкpaшi результати одержали при викорис-
Таблиця 2
Вплив стерил1зуючих речовин на вихщ стерильного матер1алу
Стерилiзуючi речовини Кшьккть експлантатiв шт. Тривалкть стерилiзацм хв. Вихщ стерильних експлантатiв %
70% спирт 0,1% HgCl2 50 1 5 83
Гiдpoхлopид нaтpiю 25% 1:2 0,1% HgCl2 50 10 1,5 89
Гiдpoхлopид нaтpiю 25% 1:3 0,1% HgCl2 50 20 2 90
Гiдpoхлopид натр^ 25% 50 20 48
0,1% HgCl2 50 2 94
70% спирт 50 5 73
Таблиця 3
Вплив концентращУ регулятор1в росту на регенерац1ю повноц1нних
рослин
Концентращя БАП Кшьккть експлантанлв, шт. % регенерацп Параметри пролiферацм
кшьккть лисшв довжина пагона, см.
МС 0 мг/л БАП 50 12 2-3 2,0
0,5 мг/л БАП +0.1 мг/л ГК 50 51 8-10 7,3
0,7 мг/л БАП +0.1 мг/л ГК 50 48 5-9 6,8
1,0 мг/л БАП +0.1 мг/л ГК 50 39 5-7 6,2
1,5 мг/л БАП+0.1 мг/л ГК 50 24 3-4 5,7
Рис. 1. Ап1кальн1 бруньки рослин хмелю.
Рис. 2 . Регенерац1я експланталв з утво-ренням листк1в та пагон1в.
тaннi 0,1% HgCI2 (94% стерильних експлaнтaтiв) i гiдpoхлopиду Na 25% 1:3 i 1:2 з додаванням 0,1% HgCI2 та 89%. Стерильы експлантати виса-джували на живильне середовище МС [7].
Рис. 3. Рослини хмелю на живильному середовищ! i3 використанням глюкози.
Отриман стеpильнi пaзушнi бруньки помЦали в колби Ерлен-мейера з 5 мл рщкого поживного середовища МС з piзнoю концен-тpaцiею БАП i пбереловоТ кислоти (ГК), у свгглову культуральну юмна-ту, в якiй протягом певного часу (23 тижнiв) проводились спостере-ження.
Вже на 11 день був помггний роз-виток експланта^в, формування па-гoнiв. Особливо помггно це було на середовище в якому вмiст БАП ста-новив 0,5 мг/л та 0,1 мг/л ГК. У результат досшджень (на 21 день) було встановлено, що саме концентра^я
Вплив стерилiзYючих агент, регYляторiв росту, вYглеводiв i гелюючих аген™ на
при мiкроклональномY розмноженн
Таблиця 4
Вплив вуглеводiв на ркт рослин-регенератчв
Вугле-води Юльккть експланталв, шт. Довжина пагожв, см Юльккть листв, шт. Кшьккть корежв, шт. Довжина коpeнiв, см
Глюкоза 30 8,0 ± 1,2 10,2±0,5 7,7±0,4 1,8±0,3
Сахароза 30 6,0 ± 0,8 8,4±0,3 5,1±0,3 1,5±0,2
Таблиця 5
Вплив гелюючих агетчв на picT рослин - регенеранлв
Назва агенту Концентра-щя г/л Юльккть рослин-peгeнepaнтiв, шт. Довжина пагожв, см. Юльккть листв, шт. Число вкорше-них експланталв шт.
Ф1тогель 2 20 3,4 3,5±0,15 10
Желр1т 2 20 5,6 5,1±0,17 13
Желр1т + агар 1,25+3 20 6,9 6,4±0,21 15
Агар 8 20 8,9 8,2±0,32 20
БАП 0,5 мг/л та вмкт ГК 0.1мг/л сти-мулювали утворення 51% регенера-цп з найбiльшим утворенням листкiв та довжини пагонiв (рис. 2).
Для росту в кулы^ in vitro i30-льованих органiв, тканин або кштин до складу середовища включають джерела вуглеводiв (табл. 4)
Для бтьшосп культур тканин з метою штенсивного росту та роз-витку експлантапв використовують сахарозу. Проте для хмелю кращий рiст in vitro спостер^ався при вико-ристаннi глюкози (рис. 3).
Отриманi результати свщчать про те, що використання глюкози в по-живних середовищах сприяе розви-тку регенерантiв, зокрема Тх росту та кiлькостi.
Для вивчення впливу гелюючого агенту використали наступн речо-вини: фiтогель, желрiт, агар та сумш желрiту та агару (таб. 5).
Дошдження показали, що фто-гель виявився негативним гелеутво-рюючим агентом для середовища. При його використанн регенеранти мали найменшу довжину пагонiв
регенерацiю повноцЫних рослин хмелю
i кiлькiсть листш. Дещо кращим агентом був желр^, при викорис-таннi якого довжина пагошв та юль-кiсть листш регенеранлв була дещо бiльною. Найкращим гелеутворю-ючим компонентом виявився агар. Середня довжина пагоыв на а^ складала 8,9 см, середня шьюсть листкiв - 8,2 шт., число укоршених експлантатiв сягло 20 шт.
Висновки та пропозицп. Методика мiкроклонального розмно-ження гарантуе отримання високо-якiсних безвiрусних живцiв хмелю iз генетично цiнними ознаками. Для одержання стерильного мате-рiалу з високою регенерацiйною здатнiстю необхiдно використо-вувати стерилiзуючий агент 0,1% НдС12, а найвищу регенерацiю екс-планталв можна забезпечити, ви-користовуючи регулятор росту БАП у концентраци 0,5 мг/л з додаван-ням 0,1 мг/л ГК. Найбтьше число укоршених експланталв одержали при використаннi гелюючого агенту агару з глюкозою - найкращим джерелом вуглеводiв для росту та розвитку експланталв.
ВИКОРИСТАНА ШЕРАТУРА
1. Бойко, А. Л. Вирусы и вирусные болезни хмеля, 5. способы борьбы с ними / А. Л. Бойко, Г. С. Литвинов, Е. А. Кондратюк, С.А. Ромашов [и др.] // Хмелеводство, 1983. - № 12. - С. 31-35.
2. Державний реестр сорлв рослин придатних до по- 6. ширення в УкраТн (витяг станом на 01.03.2010). - К.: ТОВ «Алефа», 2010. - 245 с. Калинин, Ф. Л. Методы культуры тканей физиологии и биохимим растений. / Ф. Л. Калинин, 7. В. В. Сарнацкая, В. Е. Полищук. - К.: Наукова думка, 1980. - 488 с.
Кушыр, Г. П. Мкроклональне розмноження рослин / Г. П. Кушыр, В. В. Сарнацька. - К.: Наукова думка, 2005. - 242 с.
3.
4.
Кормильцев, Б. Ф. Використання методу культури апкальних меристем для оздоровлення хмелю вщ деяких вiрусiв / Б. Ф. Кормильцев, А. Л. Бойко // Хмелярство. - 1992. - Вип. 14. - С. 20-23. Мельничук, М. Д. Бютехнолопчний процес одержання рослин хмелю на безвiруснiй основа Допо-в^ НАН УкраТни / М. Д. Мельничук, О. £. Крткий [та ш.]. - 1996. - № 98. - С. 139-141. Мельничук, М. Д. Отримання безвiрусного посад-кового матерiалу хмелю (Humulus lupulus) в умовах in vitro: Науковий в^ник НАУ / М. Д. Мельничук, О. £. Крткий [та ш.]. - К.: 1рена, 2000. - Вип. 29. -С. 47-52.
