CC BY
27
УДК 60:57.085.2:582.623.2 Асист. С.Ю. Бтоус, канд. бюл. наук -
НУ бюресурав i природокористування Украти, м. Ктв
ПРЯМИЙ ОРГАНОГЕНЕЗ POPULUS TREMULA L. З Р1ЗНИХ ТИП1В ЕКСПЛАНТ1В IN VITRO
Дослщжено особливост шдукцп прямо! регенерацп тканин P trémula залежно вщ генотипу, типу експланту та умов культивування in vitro. З'ясовано шляхи ре^зацп морфогенетичного потенцiалу мiкропагонiв P. trémula. Розроблено шдходи до мшрок-лонального розмноження осики зеленокоро! форми. Встановлено оптимальнi складовi живильного середовища з додаванням 0,25-0,5 мг-л-1 кшетину, тiдiазурону та активова-ного вугшля, що забезпечили повну реалiзацiю морфогенетичного потенщалу експлан-тiв з утворенням укорiнених рослин та можливiстю довгострокового пасажування P. trémula в умовах in vitro.
Ключовi слова: Populus trémula L., in vitro, живильне середовище, експлант, морфогенез, регулятори росту.
Вступ. Нинi використання екзогенних гормональних регуляторiв росту рослин (РРР) е одним з основних пiдходiв для отримання рослин-регенеранлв in vitro. Для запобтання структурним i функщональним змiнам геному й отримання генетично-вдентичного рослинного матерiалу дощльно iндукувати пряму регенерацiю безпосередньо тканинами експланту. Визначальну роль у процес диференцiацií та морфогенезу iзольованих тканин та оргашв вiдiграють не лише генотиповi й видовi особливосп але й гормональний баланс, спiввiдношен-ня цитокiнiнiв та ауксинiв у складi живильного середовища (ЖС) [3]. Утворен-ня адвентивних бруньок можливо досягнути практично з кожного органа чи тканини рослини, шляхом активацп вже наявних у рослинi меристем, заснова-ному на зняттi ашкального домiнування, та в цьому випадку, кшьккть утворе-них мiкропагонiв залежатиме вiд генотипу рослини [5].
Першою роботою з вивчення дií фггогормошв як iндуктора органогенезу в культурi тканини були роботи Скуга та ш. [4, 7]. У дослщженнях з впливу фь тогормонiв ауксишв i цитокiнiнiв на розвиток експланпв у культурi in vitro вони показали, що залежно вщ сшвввдношення гормонiв у ЖС спостер^алося ут-ворення пагошв, коренiв або калюсно! тканини. Тканини рiзних видав рослин вiдрiзняються вимогами щодо конкретних концентрацiй фiтогормонiв для ш-дукцп органогенезу. Напевно, основною причиною вiдмiнностей морфогенезу in vitro при використанш екзогенних гормонiв е наявнiсть у тканинах ендоген-них гормошв. Так, для тканин з високим вмктом цитокiнiнiв додавання до середовища додаткових цитокiнiнiв призводить до шпбування розвитку бруньок i органогенезу. У такому випадку органогенез вщбуватиметься за ввдсутносп ци-токiнiнiв. Пiдтвердженням цього е робота Арнольда та Ержсона [10].
Мета дослщження - визначити залежнiсть ефективностi регенерацií органогенезу осики ввд концентрацй' у ЖС регуляторов росту цитокiнiнового типу дц та типу експланту для тривалого, масового культивування iзольованих бруньок i мжропагошв осики шляхом прямого морфогенезу.
Матер1али та методи. Об'ектом дослщжень слугували зразки осики зе-ленокоро! форми. У процесi культивування використовували ЖС МС [8], Wood Plant Medium (WPM) [9] та Драйвера (DKW) [7] з додаванням до 'хнього складу
pi3HHx груп цитокiнiнiв 6-БАП, ТДЗ та кшетину як окремо, так i комбiнуючи мiж собою. Додатково до середовища додавали активоване вугiлля (1 гл-1), в якостi вуглеводневого живлення сахарозу (30 г-л-1), мезоiнозит (100 мг-л-1) та агар (0,7 %), рН середовища 5,6-5,7.
Для деревних культур синтетичний аналог цитокiнiну ТДЗ у низьких концентращях ефективнiший пор1вняно з традицшними похвдними пуришв, ос-кшьки стимулюе рiст через власну бюлопчну (цитокiнiнову) активнiсть, здат-ний штенсифжувати синтез i нагромадження ендогенних цитокшшв, що неодноразово пiдтверджено дослщженнями рiзних авторiв[1, 6, 10]. На основi цих даних проведено дослщження гормонального впливу 6-БАП, кiнетину та ТДЗ на ркт та розвиток експланпв осики в культурi in vitro на ЖС за прописом МС, DKW та WPM.
Для шдукцц регенерацп листковi (розмiром 1-1,5 см2), стебловi та коре-невi (довжиною 1-1,5 см) експлантати, отримаш вiд асептичних рослин на Б-ЖС, культивували на запропонованих нами морфогенних живильних середови-щах (М-ЖС) з додаванням рiзноí концентрацií (БАП, ТДЗ, кшетин) протягом 30 д1б (табл. 1). Висаджували вiд 5 до 15 експланпв кожного варiанта, що-найменше в трьох повторностях. Отримаш даш опрацьовано статистично. Виз-начали ефективнiсть регенерацií вiдсоток регенерацп (ВР), середню довжину регенерантiв (СДР) та середню кшьккть регенерантав (СКР) у розрахунку на один експлант з регенерантами [2]. Результати дослщження та 1х обговорення. Внаслiдок проведеного експерименту встановлено, що утворення мжророслин вiдбувалось пiд даею регуляторiв росту, яю додавали до основного живильного середовища МС, DKW та WPM.
Табл. 1. Вплив концентраци цитоюттв на пагоноутворення у листкових
та кореневих експланпйв Populus tremula L.
М-ЖС Гормон, мг-л-1 Кшьюсть експла-нпв з регенерантами, шт. ВР, % СКР, шт. ЕР СДР, см Наявнiсть калюсу на експлантi Характеристика пагона
Листковi експланти
МС 1 0,2 ТДЗ 15 50,0 7,0 3,5 0,5 +++ зелений
МС 2 0,4 ТДЗ 10 33,3±1р 5,3 1,8 0,3±и,1 +++ зелений
МС 3 0,5 ТДЗ 12 40,0",° 6,1 2,4 0,3±ид +++ зелений
KopeHeBi експланти
МС 13 0,5 К1Н 6 60,0й," 1,7 1,0 2,0™,' - зелений
МС 14 0,25 К1Н 4 40±и 1,5 0,6 1,8±U,J - зелений
МС 3 0,5 ТДЗ 0 0 0 0 0 + -
МС 6 1,0 ТДЗ 0 0 0 0 0 ++ -
Так, iцдукцiя органогенезу й утворення морфогенних структур ввдбува-лась на 18 варiантах живильних середовищ, проте позитивш результати отри-мано лише в окремих випадках, що свдаить про рiзний морфогенетичний потенциал кттин експланту.
Кореневi експланти на ЖС з ТДЗ (0,5-1,0 мг-л"1) через 1,5 тижш утворю-вали щiльну калюсну тканину, в яко1 в подальшому не виявлено утворення морфогенних структур. Лише на ЖС МС-13 та МС-14 кореневi експланти мали ВР
60,0±1,0 % та 40,0±1,5 % вiдповiдно. Водночас СКР на ЖС МС-13 також 6ув бшь-ший вiд 1,7 стввщношення регенерант/експлант (рис. 1). На ввдмну вiд коре-невих експланпв листковi мали дещо менший BP, i в 1'хньому випaдкy макси-мальний 50,0±1,0 % на ЖС МС-1 з додаванням 0,2 мгл-1 ТДЗ. Водночас СКР бу-ла бшьшою, нiж у кореневих експланлв 7,0 регенерант/експлант.
Рис. 1. Пряма тдукщя рoслин-рeгeнeранmiв oсики Populus trémula L. з кйpeHeeux eкспланmiв: 1, 2) шщащя пaгоноутворeння тарuзогeнeзу на ^perneux emniaHmax; 3) noeHO^HHÏpослuнu-peгeнepaнтu з mperneux eксплaнтiв з вupaжeнuм моpфогeннuм
потeнцiaлом
Одночасно з пагоногенезом на листкових експлантах вщбувався штен-сивний калюсогенез на вшх вapiaнтax ЖС iз вмютом ТДЗ (0,2-0,5 мгл-1). Сфор-мований калюс мав свiтло-зелене забарвлення та наявш моpфогеннi зони, якi за сприятливих умов культивування утворювали рослини-регенеранти осики (рис. 2).
Рис. 2. Пряма тдукцш мiкpoпагoнiв з лuсmкoвux e^nßaHmie oсuкu Populus trémula L.: 1) тщащяутвоpeння мтропагошв; 2) формування множинних мтропагошв осики
За даними експерименту, на стеблових експлантах у бшьшосп випадюв спостерпали пагоногенез, школи калюсогенез та ризогенез. Так, на ЖС з додаванням у високих концентращях цитокшшу 6-БАП - 1,0-2,0 мг-л-1 негативно впливало на стебловi експлантати на всix живильних середовищах, про що свщ-чить низький BP, 26,7±0,6 % та 46,7±0,6 % (табл. 2).
Культивування експлантапв на сеpедовищi з кiнетином 0,5 мг-л-1 спричи-няло розвиток з меристем бруньок незначно'1 кiлькостi пагошв та додаткових бруньок, що характеризувались yповiльненим розвитком, СДP - 2,6±0,8 см (мь сячний пpиpiст становив 0,5-1,0 см), ŒP сягав 3,5. Bикоpистaння 0,25 мгл-1 кь нетину сприяло утворенню мiкpопaгонiв, BP сягав 86,7±1,0 % (рис. 3).
Табл. 2. Вплив концентраций цитокШшв на пагоноутворення у стеблових експлант'ю Populus trémula L.
М-ЖС Гормон, мг-л-1 Кшькють екс-планпв з реге-нерантами, шт. ВР, % СКР, шт. ЕР СДР, см Наявтсть калюсу на експлантi Характеристика пагона
МС 1 0,2 ТДЗ 11,0 73 3±0,6 2,2 0,1 2,0±0,2 +++ зелений
МС 2* 0,4 ТДЗ 14,0 93,3±0,6 2,0 1,9 1,4±0,4 ++ зелений
МС 3* 0,5 ТДЗ 15,0 100,0±и0 9,6 9,6 2 5±0,6 - зелений
МС 4* 0,6 ТДЗ 12,0 80,0±10 1,9 1,5 1,2±°,у - зелений
МС 5* 0,8 ТДЗ 9,0 60,0±1Д) 1,2 0,7 1,8±0,8 - зелений
МС 6* 1,0 ТДЗ 8,0 53,3±^5 1,1 0,6 1,7±o,v - зелений
МС 7* 1,5 ТДЗ 6,0 40,0^ 1,0 0,4 1,0±0,3 - св. зелений
МС 8* 2,0 ТДЗ 3,0 20,0±1Д° 1,0 0,2 0,7±0,3 - св. зелений
МС 9* 2,5 ТДЗ 1,0 6,7±0,6 2,0 0,1 0,3±0,0 - св. зелений
МС 10 0,5 БАП 8,0 53 3±0,6 1,0 0,5 2,1±0,7 зелений
МС 11 1,0 БАП 4,0 26,7±0,6 1,0 0,3 0,4±0,i - св. зелений
МС 12 2,0 БАП 7,0 46,7±0,6 1,1 0,5 0,9±0,3 + св. зелений
МС 13 0,5 К1Н 12,0 80,0±1,2 3,4 2,7 2 2±0,8 - зелений
МС 14 0,25 К1Н 13,0 86,7±^0 3,5 3,0 2,6±0,8 - зелений
DKW 15 0,5 БАП 5,0 И о ±0,6 33,3 1,0 0,3 1,3±0,6 - св. зелений
DKW 16 1,0 БАП 3,0 20,0±j,0 1,0 0,2 0,6±0,3 - св. зелений
DKW 17 2,0 БАП 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 - св. зелений
WPM 18 0,5 БАП 5,0 И о±1,2 33,3 1,6 0,5 1,2±0,3 - св. зелений
WPM 19 1,0 БАП 3,0 20,0±j,0 1,0 0,2 1,5±0,4 - св. зелений
WPM 20 2,0 БАП 0 0 0 0 0 + св. зелений
*ПС з додаванням 1 гл- активованого вугшля.
Рис. 3. Динамжа утворення мжропагошв на стеблових експлантах осики Populus trémula L. (протягом трьох тижтв)
У npo^ci дослщжень установлено, що висока концентращя цитокшшу ТДЗ, така як 1,5-2,5 мг-л-1, негативно впливала на експлантати. Спостеpiгали пpигнiчення !хнього росту, вщсутшсть пагоноутворення. Експлантати мали ви-гляд стебла з бруньками, яю не встигли розвинутись у пагони, деяю рослини вiдзначались почеpвонiнням листкiв та i'x опаданням. Це явище характерне тд час використання тiдiазуpону [10, 11].
У раз1 0,2 мгл-1 ТДЗ (МС-1) на стеблових експлантах одночасно з шщъ ацieю пагоноутворення вщбувалась iндукцiя калюсно! тканини в базальнш час-тинi, згодом весь експлант був покритий калюсом. Високу морфогенну здат-нiсть, максимальний прирют pослин-pегенеpантiв, збiльшення кiлькостi мiжвуз-лiв та формування потужно! коренево! системи вщзначали на живильному сере-довишд з додаванням 0,4-0,5 мгл-1 ТДЗ, ВР 100,0±0,0 (рис. 4).
Рис. 4. Морфогенез мтропагошв зi стеблових експлантах Роры1т &ети1а Ь. на ЖС з ргзним спiввiдношенням РР: 1) МС + 0,5 мг •л'1 ТДЗ; 2) Мс + 0,2 мг •л'1 ТДЗ; 3) МС + 0,5 мг л'1 ТДЗ; 4) МС + 0,25 мг л'1 кшетину
Нашнтенсившше пагоноутворення зафжсоване на ЖС з додаванням ни-зьких концентрацш гормошв цитокшшового типу ди з додаванням 0,4-0,5 мгл~ 1 ТДЗ та 0,25 мг-л-1 кшетину (МС-2, МС-3, МС-14) СКР 5,2 для МС-3 та 3,5 -МС-14. Далi данi ЖС позначатимемо як ЖС-М.
Живильнi середовища DKW та WPM з додаванням БАП характеризува-лись незначним пагоноутворенням. Максимальний показник отримано з дода-ванням 0,5 мг- л -1 БАП 33,3±0,6 % та 33,3±1,2 % вiдповiдно. Водночас експланти вiдзначались пригнiченням росту, пожовтiнням та почервоншням листкiв, вщ-сутнiстю пагоноутворення. Внаслщок цього вказанi прописи ЖС у подальших дослiдженнях як основу для створення модифiкованих середовищ для вирощу-вання та культивування експланлв осики не використовували.
На наступному етапi сформованi мiкропагони вiд рiзних типiв експлан-тiв вiддiляли та переносили на свiже М-ЖС з додаванням 0,5 мг- л-1 ТДЗ для чергово'1 мультиплшацп впродовж тривалого часу, але тривале культивування рослин-регенеранлв на М-ЖС з додаванням ТДЗ ефективне лише протягом 34 пасажiв тому, що в клггинах експлантiв вiдбуваeться нагромадження гормошв, що призводило до пригнiчення росту та зменшення коефiцieнта регенерацп. Через це наступне культивування тканин проводили на Б/Г ЖС за прописом МС, або з додаванням 0,25 мг-л"1 кшетину. Адже рослинш тканини внаслщок стимулювання ростових чиннишв гормональною дieю та iндукцieю морфоген-ного потенщалу тканин експланту, продовжували свш рiст та розвиток з висо-ким коефiцieнтом регенерацп (1:10).
Висновки. Отже, попереднi дослiдження дали змогу розробити пiдходи до мiкроклонального розмноження осики зеленокоро'1 форми. Вдалося з'ясува-ти, що органогенез у культурi бруньок осики залежить вiд вшу рослини-донора, пори року, кшьюсного та яюсного спiввiдношення регуляторiв росту в ЖС. Основною причиною розроблення методiв е необхiднiсть iндивiдуального добору живильного середовища для культивування рiзних експлантатiв на кожному наступному еташ мiкроклонального розмноження. Оптимальним е варiант ви-користання живильного середовища з такими складом: 0,25 мг-л-1 кшетину +1 г-л-1 активованого вугшля та 0,5 мг-л-1 ТДЗ+1 гл-1 активованого вугiлля, якi забезпечують не тшьки iндукцiю органогенезу, але повну реатзащю морфоге-нетичного потенцiалу експлантату з утворенням укорiнених рослин.
Лггератури
1. Булычёва Н.В. Изучение влияния сочетаний фитогормонов на каллусообразование и регенеративную способность тополя Populus populus spp. / Н.В. Булычёва, А.М. Камионская, К.Г. Скрябин // Биотехнология: состояние и перспективы развития : матер. Междунар. моск. трет. конгр., 14-18 марта, 2005 г. : тез. докл. - М., 2005. - Ч. 1. - С. 234.
2. Конвалюк I.I. Прямий органогенез in vitro тирличу жовтого (Gentiana Lutea L.) / I.I. Конвалюк, Н.Б. Кравець, Н.М. Дробик та ш. // Бютехнологш : журнал. - К. : Вид-во 1н-ту бю-хши ш. О.В. Палладна НАН Украши. - 2010. - Т. 3, № 5. - С. 66-73.
3. Кушшр Г.П. Мжроклональне розмноження рослин, теорш i практика / Г.П. Кушшр, ВВ. Сарнацька. - К. : Вид-во "Наук. думка", 2005. - 270 с. (73).
4. Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология / В.С. Шевелуха, Е.А. Калашникова, Е.З. Кочиева и др. - Изд. 3-е, [перераб. и доп.]. - М. : Изд-во "Высш. шк.", 2008. - 710 с.
5. Ahuja M.R. Aspen. In: Evans DA, Sharp WR and Ammirato PJ (Eds.) Handbook of Plant Cell Culture / M.R. Ahuja / Macmillan Publishing Company. - New York, 1986. - Pp. 626-651.
6. Aubakirova L. Application of cellular biotechnology for storage of aspen biodiversity (Populus trémula L.) / L. Aubakirova, E. Kalashnikova / International journal of agriculture: Research and review. - 2011. - Vol. 1 (1). - Pp. 16-20.
7. Driver J.A. In vitro propagation of Paradox walnut root stock / J.A. Driver, A.H. Kuniyuki // HortScience. - 1984. - Vol. 19. - Pp. 507-509.
8. Murashige T. A revised medium for rapid, growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F.A. Scoog // Physiol. plantarum. - 1962. - Vol. 15. - № 3. - Pp. 473-497.
9. McCown B.H. Woody plant medium (WP 14) - a mineral nutrient formulation for microculture of woody plant species / B.H. McCown, G.B. Lloyd // Ibid. - 1981. - Vol. 16. - Pp. 453.
10. Pijut P.M. Micropropagation of Juglans cinerea L. (Butternut) / P.M. Pijut // Biotechnology in agriculture and forestry. - Berlin : Springer-Verlag. - 1997. - Vol. 39. - Pp. 345-357.
11. Tsvetkov I. Thidiazuron-induced regeneration in root segments of white poplar (P. alba L.) / I. Tsvetkov, J.F. Hausman, L. Jouve // Bulg. J. Agric. Sci. - 2007. - № 13. - Pp. 623-626 p.
Билоус С.Ю. Прямой органогенез Populus trémula L. из разных типов эксплантов in vitro
Исследованы особенности индукции прямой регенерации тканей P trémula в зависимости от генотипа, типа экспланта и условий культивирования in vitro. Установлены пути реализации морфогенетического потенциала микропобегов P. trémula с образованием укоренившихся растений. Разработаны подходы к микроклональному размножению осины зеленокорой формы. Установлены оптимальные составляющие питательной среды с добавлением 0,25-0,5 мг-л-1 кинетина, тидиазурона и активированного угля, которые обеспечили полную реализацию морфогенетического потенциала эксплантов с образованием укоренившихся растений и возможностью долгосрочного пасирования P. trémula в условиях in vitro.
Ключевые слова: Populus trémula L., in vitro, питательная среда, эксплант, морфогенез, регуляторы роста.
Bilous S.Yu. The Direct Organogenesis of Populus Trémula L. from Different Types of Explants in Vitro Culture
The features of direct induction of tissue regeneration of P. trémula depending on genotype, type of explants and culture conditions in vitro were researched. The ways of implementation of the morphogenetic potential of microshoots P. trémula to form rooted plants were established. Some approaches to microclonal reproduction of aspen were elaborate. The optimal components of the culture medium with the addition of 0.25-0.5 mg-l-1 kinetyn, tidiazu-ron and activated carbon, which provided the full realization of morphogenetic potential to form explants rooted plants and the possibility of long-term cultivation P. trémula in conditions in vitro aré sampléd.
Keywords: Populus trémula L., in vitro, the culture medium, explants, morphogenesis, growth regulators.
