ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ И СВЕТА НА КАЛЛУСООБРАЗОВАНИЯ ГИНКГО ДВУЛОПАСТНОГО (GINKGO BILOBA L.) В УСЛОВИЯХ IN VITRO Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

"SUSTAINABLE FORESTRY"

14-15 October 2022 | scientists.uz

УДК 634.956.82

ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ И СВЕТА НА КАЛЛУСООБРАЗОВАНИЯ ГИНКГО ДВУЛОПАСТНОГО (GINKGO BILOBA L.) В

УСЛОВИЯХ IN VITRO

Убайдуллаева Хуршида Абдуллаева

Доктор биологических наук, профессор, Центр Геномики и Биоинформатики АНРУз,

Ташкент Гафурджанов Бобир Тохир оглы Центр Геномики и Биоинформатики АН РУз, Ташкент https://doi.org/10.5281/zenodo.7199722 Аннотация. В статье приводится результаты исследований по изучению влияние состава искуственной питательной среды и света на каллусообразования эксплантов гинкго двулопастного (Ginkgo biloba L) в условиях in vitro. Материалы для исследований -листья и стебли сеянцев гинкго получены из Научно-исследовательского института лесного хозяйства. Экспланты посеяны в питательную среду Мурашиге и Скуга (МС) агар с добавлением стимуляторов роста (2,4-Д, 6-БАП ва ИУК) в различных концентрациях. На основании опытов необходимо константировать, что в питательной среде МС-4 с составом ИУК -1,0 мг/л, 2,4-Д -2,5 мг/л, 6-БАП 0,4 мг было отмечено наибольший показатель каллусообразования в эксплантах молодых листьев - 96,2% и в эксплантах молодых побегов (10 дневного возраста) -87,6%. Исследование показали, что свет необходим для образования каллуса, особенно на твердой среде РС дополненной 0,5 или 1,0 мг / л 2,4.D в сочетании с 2,0 мг /л и кинетина (93,2%). В общем существует прямая пропорция между светом и образованием каллуса, а также ее ростом

Ключевые слова: реликтовый древесный вид, эксплант, каллусогенез, питательная среда, морфогенез, каллус, стерилизация ,каллусообразование, in vitro INFLUENCE OF THE COMPOSITION OF THE NUTRITIONAL MEDIUM AND LIGHT ON THE CALLUS FORMATION OF Ginkgo biloba (GINKGO BILOBA L.) UNDER IN

VITRO CONDITIONS Abstract. The article presents the results of studies on the influence of the composition of an artificial nutrient medium and light on callus formation in explants of Ginkgo biloba (Ginkgo biloba L) in vitro. Materials for research - leaves and stems of ginkgo seedlings were obtained from the Research Institute of Forestry. The explants were seeded in a nutrient medium Murashige and Skoog (MS) agar with the addition of growth stimulants (2,4-D, 6-BAP va IAA) in various concentrations. Based on the experiments, it is necessary to state that in the MS-4 nutrient medium with the composition of IAA -1.0 mg/l, 2,4-D -2.5 mg/l, 6-BAP 0.4 mg, the highest callus formation rate was noted in explants of young leaves - 96.2% and in explants of young shoots (10 days old) - 87.6%. The study showed that light is required for callus formation, especially on solid medium RS supplemented with 0.5 or 1.0 mg/l 2,4.D in combination with 2.0 mg/l and kinetin (93.2%). In general, there is a direct proportion between light and callus formation and growth.

Keywords: relic tree species, explant, callus genesis, nutrient medium, morphogenesis, callus, sterilization, callus formation, in vitro

"SUSTAINABLE FORESTRY"

14-15 October 2022 | scientists.uz

Ведение. Гинкго билоба (Ginkgo biloba L.) является единственным живым видом отряда Ginkgoales семейства Ginkgoaceae. Другие виды семейства считаются давно вымершими. Вид является двудомным. Дерево растет медленно (3-5 метров каждые 10 лет) и не размножается раньше 20-летнего возраста, и продолжает быть продуктивным более 1000 лет. Этот длительный промежуток времени от одного поколения к другому может свести к минимуму генетическую мутацию.

Дерево считается одним из самых важных деревьев для экосистемы. Он хорошо приспособлен к умеренному климату и особенно устойчив к загрязнению воздуха диоксидом серы и даже радиоактивному излучению. Вид является высокоустойчивым к насекомым, вредителям, грибковым, вирусным и бактериальным заболеваниям. Он также может легко переносить снежные и ледяные бури.

С другой стороны, гинкго имеет длительную историю лекарственного использования в традиционной китайской медицине, где чаще всего используется семя. Научные исследования показали, что хорошие экстракты, которые были получены из корней, коры и листьев, используются при многих расстройствах. Гинкго билоба является источником гинкголидов [2].

Листья гинкго также содержат гинкголиды, которые не встречаются у других видов растений Недавние исследования растения обнаружили ряд биологически активных соединений в листьях, и это вызвало большой интерес к оздоровительному потенциалу растения. В частности, листья стимулируют кровообращение и оказывают тонизирующее действие на головной мозг, уменьшая вялость, улучшая память и давая улучшенное чувство благополучия. Гинкго также продемонстрировал терапевтический потенциал в замедлении некоторых симптомов, связанных с первичными стадиями болезни Альцгеймера.

Было также доказано, что они эффективны в улучшении периферического артериального кровообращения и в лечении нарушений слуха, таких как шум в ушах, так как они являются результатом плохого кровообращения или повреждения сосудов свободными радикалами. Гинкголиды ингибируют аллергические реакции и поэтому полезны при лечении таких расстройств, как астма. Природный источник гинкголидов в настоящее время ограничен. В настоящее время их получают путем извлечения из листьев медленно растущего дерева гинкго.

Культура растительных клеток может быть доступной альтернативой этим натуральным продуктам, но ограничены поставки сырья. Флавоноиды, присутствующие в экстрактах гинкго билоба, существуют в основном в виде гликозилированных производных кемферола и кверцетина. Было показано, что эти флавоноидные гликозиды являются чрезвычайно эффективными поглотителями свободных радикалов[1]

В Узбекистане гинкго билоба встречается очень редко, поэтому эти исследования были направлены на получение этих соединений с помощью метода культивирования тканей, изучение влияние состава питательных сред и света на каллусообразования.

Материалы и методы исследований. Объектом исследований являются гинкго двулопастная, его листья и стебли. Экспланты листьев и стебля промывали под водопроводной водой в течение 5-10 минут, а затем стерилизовали 25% раствором Клорокса в течение 20 мин. В опытах использованы методы Калинина Ф.Л., Кушнира Г.П. и Сарнацкой В.В.(1992). Экспланты трижды промывали стерильной дистиллированной

"SUSTAINABLE FORESTRY"

14-15 October 2022 | scientists.uz

водой в асептических условиях в шкафу с ламинарно-воздушным потоком. Экспланты листьев готовили и разрезали на 1 см, а черешки разрезали на 1,0 см длиной. Листовые и стеблевые экспланты были разделены на две группы в асептических условиях. Первую группу культивировали горизонтально на поверхностной среде MS, содержащей 1 мг/л NAA и 0,50 мг/л кинетина, в то время как вторую группу культивировали вертикально. Значение РН среды для всех культур доводили до 5,70, до автоклавирования при +121°С и 1,3 кг/см2 в течение 20 минут и инкубировали в комнате их рост в течение 4 недель при +25 ± 2°С при 2000 люкс света в течение 16 часов ежедневно. Были проведены визуальные наблюдения, а также определены процент выживаемости, процент образования каллуса и свежий вес каллуса.[3]/

Результаты исследования и их обсуждения. Эксперимент проводился для изучения наиболее подходящего состава питательной среды для эксплантата гинкго билоба для образования и поддержания каллуса. В этой связи использовалась твердая среда MS, дополненная 1 мг/л NAA и 0,5 мг/л кинетина. Из визуального наблюдения видно, что на травмированной поверхности и листовой лопасти образовался рыхлый каллус, в то время как каллус образовалась на основании побега. Кроме того, данные показывают, что на цвет каллуса и текстуры влиял только тип экспланта. Рыхлая зеленая и беловато-зеленая каллус была получена из листьев и стебля. На процент образования каллусов значительно влияла ориентация эксплантов. Эксплант листьев показал ту же тенденцию, зафиксирован самый высокий процент каллусообразования (90%).

Из полученных результатов можно сделать вывод, что наилучшее положение для индукции каллуса на поверхности среды было вертикально и лист был лучшим эксплантом в этом эксперименте.

Рис.1.

Экспланты из молодых листьев и лиственных стебелья Ginkgo biloba L.

Данные, представленные в таблица 2 и на рисунке 1, показывают что во всех методах исследования наблюдалось образование каллуса различного цвета или текстуры через 21 день. Рыхлая или студенистая каллус образовывалась на листьях, а также на стеблях. Что касается процента образования каллуса, данные ясно показывают, что образование каллуса на разных эксплантатах по-разному реагировало на уровень агара.

"SUSTAINABLE FORESTRY"

14-15 October 2022 | scientists.uz

Наибольшее значение каллусообразование было достигнуто в опытах с листовыми и стеблевыми эксплантами на среде, содержащей 7,00 г/л агара (80 и 70 %) соответственно. Свежий вес каллуса (г/эксплант) под влиянием уровня агара в среде, и наибольшее значение этого опыта было зарегистрировано со средой, содержащей 7,00 г/л агара, особенно с эксплантом листьев (1,080 г/эксплант).

Напротив, наименьшее количество каллуса было зафиксировано с стеблевым эксплантом на среде, содержащей 3 г/л агара. Вышеупомянутая благоприятная среда с листовым эксплантом была лучшей для формирования наибольшего количества каллуса свежего веса. Что касается данных индекса каллуса, то они показывают, что листовые экспланты достигли максимального значения на среде MS с 7,0 г/л (86,4), с другой стороны, стебельной эксплант зафиксировал наименьшее значение (0,8) на среде MS, затвердевшей на 3,0 г/л агара.

На основании результатов этого исследования пришли к выводу, что индекс каллуса был высоким, на что значительно влияло среднее затвердевание, увеличение агара с 3,0 до 7,0 г/л улучшило значение всех тестируемых параметров. Также на тип экспланта влияли содержание агара.

1-Таблица

Влияние ориентации и типа эксплантата на свежую массу и образование каллуса, полученных из различных эксплантов гинкго билоба выращенных на базальной твердой среде MS, дополненной 1 мг / л NAA и 0,5 мг / л кинетина.

Эксплантат Каллус г/ эксплантат Каллус Формирование %

Белый зеленый Зелёный Белый зеленый Зелёный

Лист 0.73 1.16 70.0 85.0

Стебель 0.53 0.93 75 80.0

На образование каллуса значительно повлияли все используемые концентрации 2,4-D и кинетина, а также темный или светлый период сутки. В целом каллус, полученная из всех вариантов опыта и выращенные в свете, достигли самого высокого процента, в то время как каллус которая культивировалась на той же среде и инкубировалась в темноте, регистрировала наименьшее значение. Также 2,4-0 в скорости 1,0 мг/л достигал наибольшего значения, в то время как кинетин в скорости 2,0 мг/л регистрировал наилучшие результаты при инкубации в светлое время, также в темное время суток.

2-Таблица

Влияние уровня гелеобразующего индекса каллуса, полученный из различных эксплантов гинкго билоба и выращенный на питательной среде MS с 1,0 мг/л NAA и

0,5 мг/л кинетина.

Тип Agar Выживая Образова Каллус Визуальное наблюдение

"SUSTAINABLE FORESTRY"

14-15 October 2022 | scientists.uz

эксплан тата (g/l) ие % ние каллус % (g) Цвет Текстура

Лист 3.0 60.00 50.00 0.260 Зеленоватый

5.0 75.00 70.00 0.930 Желтый рыхлый

7.0 90.00 80.00 1.080 Зеленый рыхлый

Стебель 3.0 25.00 10.00 0.083 Белый желтаватный

5.0 50.00 30.00 0.130 Белый рыхлый рыхлый

7.0 80.00 70.00 0.330 Зеленовато-белый

Результаты опытов ясно показали, что образование каллуса по разному реагировало на темный светлый период сутки, а также 2,4-0 в сочетании с кинетином на разных уровнях. Из результатов видно что свет необходим для образования каллуса, особенно на твердой среде РС дополненной 0,5 или 1,0 мг / л 2,4.0 в сочетании с 2,0 мг / л кинетина (93,2%). В общем существует обратная пропорция между светом и ростом. Напротив, существует прямая пропорция между светом и образованием каллуса, а также их ростом.

Рис.1.

Влияние светлого и темного периода суток на свежую массу каллуса, образование каллуса, индекс каллуса и сухой вес каллуса, которые были получены из эксплантов листьев гинкго билоба и выращены на базальной твердой среде MS, дополненной

различными концентрациями 2,4-0.

0,6 g 0,5

0 0,4

а ' са

1 03

а —

" 0,2

о

^

Ч

s 0,1

0,1

HL

Свежая масса каллуса

-0,59

0,55

0,45

0,05

1

0,5 1

2,4-D (mg/l)

16

светлый I темный

■

0

0

2

"SUSTAINABLE FORESTRY"

14-15 October 2022 | scientists.uz

Индекс каллуса

40 35 30 25 20 15 10 5 0

20

10 ^

2 ц 5 ^

0,1 0 ■

35

0,5 1

2,4 -D (mg/l)

12

I светлый

темный

-2 пер.: скользящее среднее (светлый)

-2 пер.: скользящее среднее (темный)

50

о4 45

CS 40

Sc ч 35

ri 30

'А

25

S

= CS 20

sa о 15

93 а 10

\о

о 5

0

00

Образование каллус

50

светлый I темный

0 0,5 1 2

2,4-D (mg/l)

0

2

3- Таблица

"SUSTAINABLE FORESTRY"

14-15 October 2022 | scientists.uz

Влияние светлого и темного периода на образование каллуса, сухой массы и индекс каллус гинкго билоба, который выращивался на базальной твердой среде MS,

дополненной различными уровнями 2,4-0 и кинетина

2,4-D mg/l Kinetit mg/l Образавание каллуса % Каллус сухой вес mg/эксплант Каллусный индекс

светлый темный светлый темный светлый темный

0.5 1.0 60.0 33.3 75.30 16.6 45.00 5.30

2.0 93.2 40.0 53.60 15.3 49.30 6.00

1.0 1.0 86.6 46.6 113.0 36.6 97.80 29.30

2.0 93.2 66.6 73.30 20.0 68.00 13.00

2.0 1.0 93.2 53.3 106.6 33.0 98.80 17.58

2.0 86.6 53.3 113.0 31.6 79.80 16.50

Кроме того индекс каллуса используется для сравнения между различными эксплантами и выбранными стимуляторами роста, которые достигают оптимального использования их в каллусообразование. Из полученных результатов можно сделать вывод, что на каллусообразование сильно влияет свет.

Что касается сухой массы каллуса, то данные свидетельствуют о том что все методы показали одинаковую тенденцию к чистому весу каллуса, тогда как наибольшее количество сухой массы каллуса (113,0 мг/эксплант) было достигнуто при использовании среды содержащей 1,0 мг/л 2,4-D плюс 1,0 мг/л кинетина и инкубированной в легком виде. Показано, что оптимальной средой для индукции каллусогенеза является среда Мурасиге и Скуга, дополненная 2,5 мг/л 2,4-Д, 1,0 мг/л ИУК и 0,4 мг/л 6-БАП.

Выводы:

1. Получены каллусные культуры гинкго двулопастного (G. biloba) и установлено, что оптимальным эксплантом для индукции каллусогенеза являются высечки молодой листовой пластинки.

2. Показано, что оптимальной средой для индукции каллусогенеза является среда Мурасиге и Скуга, дополненная 2,5 мг/л 2,4-Д, 1,0 мг/л ИУК и 0,4 мг/л 6-БАП.

3. Свет необходим для образования каллуса особенно на твердой среде РС дополненной 0,5 или 1,0 мг / л 2,4.D в сочетании с 2,0 мг / л кинетина (93,2%). Существует прямая пропорция между светом и образованием каллуса, а также ростом.

REFERENCES

1. Гафурджанов Б.Т., Бердиев Э.Т. Гинкго двухлопастный (Ginkgo biloba L.) - реликт мезозойской эры// Вестник аграрной науки Узбекистана - Узбекистон аграр фани хабарномаси журнали, Ташкент, 2020.-№2(80).-С.99-103.

2. Гафурджанов Б.Т., Хазимов К.М. Биология прорастания семян и развитие ювенильных растений гинкго двулопастного (Ginkgo biloba L.)// Сборник международной научно-практической конференции молодых ученых в рамка XI «Международной зимней

"SUSTAINABLE FORESTRY"

14-15 October 2022 | scientists.uz

школы 2021»(Алматы, КазНАУ, 15.02-27.02 2021 г, )- Алматы, Издательство «Айтумар», 2021.-С. 352-357

3. Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. - К.: Наук. думка, 1992. - 488 с.