ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ РТУТИ НА УРОВЕНЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ
М.Е. Кубракова
ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет Росздрава»
Как известно, загрязнение окружающей среды ртутью, в частности ее органическими производными, является одной из актуальных проблем, так как и сам металл и его производные являются высокотоксичными соединениями. Они поступают в окружающую среду в результате антропогенной деятельности или образуются в реакциях биохимического алкилирования из неорганических соединений. Соединения ртути применяются в различных отраслях хозяйственной деятельности человека, что является существенным фактором загрязнения экосистем. Источником органических и неорганических соединений ртути служат производства, связанные с обогащением руд, изготовлением красителей, фармацевтических препаратов, ртутных батарей, термометров, манометров и т. д.
В связи с вышеизложенным представляется актуальным изучить на молекулярном уровне влияние соединений ртути, которые являются аналогами природных соединений, на изменение свободнорадикальных процессов (СРП), состояния мембран клеток, продукции пероксинитрита и его производных, сравнить действие органической соли ртути и металлоорганического производного на вышеперечисленные процессы и установить степень выраженности изменений при действии этих соединений в концентрациях, не вызывающих и вызывающих клинические проявления ртутной интоксикации.
Экспериментальное исследование было проведено на 180 белых беспородных крысах обоего пола. Животным внутрижелудочно вводили водные растворы исследуемых веществ. В эксперименте использовали органическую соль - ацетат ртути и металлоорганическое соединение - нитрат метилртути в двух концентрациях: 0,3 мг/кг - доза, не вызывающая клинических проявлений ртутной интоксикации (субклиническая концентрация), и 0,75 мг/кг -доза, вызывающая клинические признаки ртутной интоксикации (клиническая концентрация).
Для проведения эксперимента животные были разделены на подгруппы: контрольную и две опытные. Опытные группы, в свою очередь, были разделены на четыре подгруппы. Контрольной группе животных вводили дистиллированную воду. Опытной группе I вводили ацетат ртути, опытной группе II -нитрат метилртути. Первая и третья подгруппы получали субклиническую концентрацию вещества, вторая и четвертая - клиническую концентрацию. Взятие материала производили через 24 ч у животных первой и второй подгруппы (1-е сутки, что соответствует первому ответу организма на действие соединений ртути), через 120 ч у третей и четвертой подгруппы (5-е сутки, когда происходит практически полное перераспределение токсикантов в органах и тканях организма). Объектом исследования служила плазма крови.
Исследовали СРП с помощью следующих биохимических методик: Н2О2-люминолзависимая хемилюминесценция (ХЛ) по методике В.А. Шестакова (1979); оценка высоты быстрой вспышки - ХЛ (Н) и светосуммы свечения -ХЛ (Бш); количество диеновых коньюгатов (ДК) спектрофотометрическим методом И.Д. Стальной (1977); малоновый диальдегид (МДА) по методу И.Д. Стальной (1997); шиффовы основания (ШО) по методу Б1Шаек (1973); суммарная пероксидазная активность (СПА) методом А. А. Покровского (1969); содержание внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) гемоглобинцианидным методом; содержание пероксинитрита (ОКООН) и продуктов метаболизма оксида азота - нитротирозина (КОТир) и нитроглутатиона (ГБКО) спектрофотометрическим методом И.И. Лобышевой (1999). Результаты проведенных исследований представлены в табл. 1 и 2.
Таблица 1. Изменение биохимических показателей при действии ацетата ртути
Показатель Контроль Субклиническая концентрация Клиническая концентрация
на 1-е сутки на 5-е сутки на 1-е сутки на 5-е сутки
ХЛ (Н), мм 75,50 ± 5,16 94,67 ± 8,37 86,10 ± 8,42 92,90 ± 6,75 81,20 ± 3,68
ХЛ (Бш), отн.ед ХЛ за 100 с 295,2 ± 15,5 413,9 ± 57,9 286,5 ± 26,3 368,4 ± 25,1 292,7 ± 17,3
ДМ/мл 10,15 ± 0,37 12,12 ± 0,63 21,09 ± 1,35 16,24 ± 0,65 21,32 ± 2,09
МДА, нМ/мл 21,99 ± 0,79 26,21 ± 1,43 34,06 ± 3,22 31,34 ± 1,48 31,70 ± 1,44
ШО, ед. фл./мл 0,70 ± 0,05 1,05 ± 0,06 0,87 ± 0,06 1,57 ± 0,08 0,67 ± 0,04
СПА, усл. ед/мл 5,14 ± 0,43 6,81 ± 0,82 6,35 ± 0,72 11,48 ± 1,86 7,27 ± 0,64
ВЭГ, мкМ/л 4,58 ± 0,54 7,15 ± 0,37 5,61 ± 0,29 7,23 ± 0,24 6,72 ± 0,30
ОКООН, нМ/мг белка 91,36 ± 2,11 93,23 ± 2,06 87,58 ± 2,26 132,8 ± 4,63 109,9 ± 5,91
ГБКО, нМ/мг белка 47,11 ± 3,05 52,88 ± 2,68 55,39 ± 2,50 105,2 ± 8,47 73,85 ± 2,83
КОТир, нМ/мг белка 5,12 ± 0,26 5,47 ± 0,27 7,81 ± 0,52 14,14 ± 0,93 11,52 ± 0,64
Таблица 2. Изменение биохимических показателей при действии нитрата метилртути
Показатель Контроль Субклиническая концентрация Клиническая концентрация
на 1-е сутки на 5-е сутки на 1-е сутки на 5-е сутки
ХЛ (Н), мм 75,50 ± 5,16 108,8 ± 11,73 106,9 ± 8,54 103,40 ± 9,15 86,10 ± 3,14
ХЛ (8ш), отн.ед ХЛ за 100с 295,2 ± 15,5 436,3 ± 45,20 363,8 ± 41,46 382,90 ± 39,95 289,0 ± 28,72
ДК, нМ/мл 10,15 ± 0,37 14,54 ± 0,69 27,74 ± 1,97 12,18 ± 1,05 34,68 ± 2,05
МДА, нМ/мл 21,99 ± 0,79 27,93 ± 1,24 32,40 ± 1,53 25,98 ± 0,55 30,23 ± 1,09
ШО, ед. фл./мл 0,70 ± 0,05 1,04 ± 0,07 0,72 ± 0,04 1,03 ± 0,10 0,80 ± 0,04
СПА, усл. ед/мл 5,14 ± 0,43 12,01 ± 2,03 13,30 ± 1,16 11,47 ± 1,97 12,43 ± 0,54
ВЭГ, мкМ/л 4,58 ± 0,54 6,72 ± 0,49 7,27 ± 0,35 8,18 ± 0,50 5,93 ± 0,26
ОШОН, нМ/мг белка 91,36 ± 2,11 127,4 ± 3,41 111,20 ± 1,63 107,65 ± 1,43 101,24 ± 3,62
нМ/мг белка 47,11 ± 3,05 95,26 ± 4,24 65,08 ± 2,66 66,14 ± 3,42 59,80 ± 4,31
нМ/мг белка 5,12 ± 0,26 12,99 ± 0,83 9,75 ± 0,68 8,80 ± 0,80 9,67 ± 0,77
Установлено, что при внутрижелудочном введении обоих токсикантов в живом организме происходит достоверная активация свободнорадикаль-ного окисления (СРО). Стимулирование процессов СРО при попадании в организм соединений ртути происходит при повышении генерации АФК -супероксид иона (О2^-) и свободного гидроксильного радикала (ОН), что подтверждается достоверными изменениями Н2О2-люминолиндуцирован-ной ХЛ, которая в основном отражает уровень О2- и ^ОН-радикалов и скорость липидной пероксидации в изучаемом биологическом материале [1]. Интенсификацию перекисного окисления отмечали при действии обоих токсикантов, но при действии нитрата метилртути эти показатели были достоверно в 2 раза выше, чем при действии ацетата ртути, что подтверждает данные о более выраженных токсических свойствах металло-органического производного ртути [2]. Что касается действия токсиканта в концентрации, не вызывающей клинические проявления, и в дозе, когда мы отмечали признаки ртутной интоксикации, то оказалось, что как низкая, так и высокая концентрация токсиканта примерно в равной степени активировали процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ).
Анализируя содержание продуктов ПОЛ отмечали, что при действии ацетата ртути содержание ДК в плазме крови, по сравнению с другими продуктами ПОЛ, было максимально. Закономерная картина происходила как при введении субклинической, так и клинической концентрации ацетата ртути, но образование продуктов ПОЛ при действии субклинической концентрации было примерно в 2,5 раза меньше. На наш взгляд, интенсивность образования продуктов ПОЛ была равнозначной при
действии обеих концентраций нитрата метилртути, но имело место более быстрое перераспределение продуктов ПОЛ в клеточные структуры при введении высокой концентрации металлоорганического производного ртути.
Для стабильности и нормального функционирования биомембран важнейшим условием является стационарность процессов СРО. Проведенное исследование свидетельствует о достоверном нарушении стабильности мембран эритроцитов при действии соединений ртути, о чем говорит значительное повышение уровня СПА и ВЭГ в плазме крови, которые рассматриваются как чувствительные показатели стабильности мембран клеток. Хотелось бы отметить, что при действии ацетата ртути в концентрации, не вызывающей признаки интоксикации, происходит достоверное изменение структурного состояния мембран клеток, а при действии большей концентрации ацетата ртути эти изменения происходят примерно в 4 раза более интенсивно. Что касается действия нитрата метилртути, то действие как высокой, так и низкой концентрации оказывало даже более значительные изменения структурного состояния мембран по сравнению с действием клинической концентрации ацетата ртути.
Наряду с биохимическими показателями, отражающими уровень СРО в живом организме, было проведено определение показателей обмена монооксида азота ("МО), который в физиологических концентрациях играет ключевую роль во многих биохимических процессах [3]. В больших концентрациях "КО является токсичным для клеток из-за действия на Бе-и Си-содержащие ферменты. Существенное цитотоксическое действие "КО обусловлено реакцией с супероксид ионом. В результате реакции образуется пероксинитрит (высокореакционное соединение), который в кислой среде диссоциирует с образованием гидроксильного радикала. А при восстановлении пероксинитрита образуется нитрозопероксикарбонат, который способен осуществлять реакцию нитрования тирозина в белках, что приводит к изменению конформации белковой молекулы, а также к одно- и двунитевым разрывам ДНК. Эти эффекты пероксинитрита приводят к активации СРО и необратимым молекулярным изменениям. В результате выполненных исследований установлено, что при действии токсикантов происходит достоверное увеличение продукции пероксинитрита и его производных, как при действии ацетата ртути, так и нитрата метилртути, во всех исследованных концентрациях.
Таким образом, при действии метилртутного производного наблюдается более быстрый и значительно выраженный токсический эффект, по сравнению с органической солью ртути. Достоверные изменения биохимических процессов наблюдаются независимо от концентрации токсикантов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Владимиров Ю.А. Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция как инструмент в медико-биологических исследованиях //Соросов-ский образовательный журнал. 2001. Т. 7. № 1. С. 16-23.
2. Осипова В.П. Изучение механизма действия органических производных ртути на объекты окружающей среды: Автореф. дис... канд. хим. наук. Российский гос. ун-т нефти и газа. М., 2000. 24 с.
3. Северин Е.С. Биохимические основы патологических процессов.М.: Медицина, 2000. 304 с.