CC BY
72
УДК 631.635
Л. А. Ганеева, И. С. Докучаева ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ МАРГАНЦА НА АКТИВНОСТЬ КАТАЛАЗЫ И ПЕРОКСИДАЗЫ И НА ПРОЯВЛЕНИЕ АГРЕССИВНОСТИ ФИТОФТОРЫ
Ключевые слова: каталаза, пероксидаза, фитофтора, соединения марганца. catalase, peroxidase, Phytophthora infestans, manganese compounds
В работе проведено исследование изменения активности каталазы и пероксидазы в клубнях картофеля под воздействием соединений марганца и оценка агрессивности рас фитофторы при внесении данных соединений. Результаты исследования показали, что обработка ткани картофеля соединениями марганца приводит к снижению активности каталазы и пероксидазы и индуцирует устойчивость картофеля к фитофторе.
Epiphytic potential induced by Phytophthora infestans is reason of noneffective methods in potatoes protection against Phytophthora's disease. Anti-oxidant protection plays important part in Phytophthora infestans resistance. Catalase and peroxidase are requisites of antioxidant's protection. The study in alteration activity of catalase and peroxidase and aggressiveness of Phytophthora infestans measurements in potatoes samples under manganese compounds influence were done. The research results has shown that manganese compound treatments ofpotatoes samples to lead to decrease of activity catalase and peroxidase. Treatment by manganese compounds of potatoes samples induced resistance to Phytophthora's disease also has shown.
Возросший эпифитологический потенциал Phytophtora infestans стал причиной снижения эффективности традиционных методов защиты картофеля, в том числе применением фунгицидов. Современная концепция интегрированной защиты картофеля ориентирована на использование как химических, так и агротехнических и биологических методов [1].
Устойчивость растения к патогену, отчасти, определяется его способностью распознавать патоген и в своевременном включении механизма защиты. Но только при сильном адекватном защитном ответе растение сможет защитить себя от патогенного микроорганизма.
В устойчивости картофеля к Phytophtora infestans важную роль выполняет гиперответ на внедрение патогена. Гипер-ответ реализуется через механизм программируемой гибели клетки (ПКС). Так как ключевым моментом, определяющим особенности осуществления ПКС (апоптоз или некроз) является изменение активности антиоксидантной защиты и окислительных ферментов, важным является изучение различных звеньев этих систем, что в перспективе делает возможным управление чувствительностью гипер-ответа. Важнейшими ферментами, в этой связи являются каталаза и пероксидаза [2,3].
Сведения об активности антиокислительных ферментов в процессе поражения патогеном неодназначны [2]. Ключевую роль в реализации и направленности окислительно-восстановительных реакций, осуществляемыми этими ферментами играют «переходные» металлы (металлы с переменной валентностью) [4]. Однако, данные о влиянии ионов марганца, железа и меди на эти процессы, а также на проявление_агрессивности фитофторы практически отсутствуют.
В связи с этим, нами проведена работа по оценке изменчивости активности катала-зы и пероксидазы в клубнях картофеля под воздействием соединений марганца и измерении агрессивности рас фитофторы при внесении данных соединений.
Экспериментальная часть
Для инокуляции использовали изоляты фитофторы, собранные в Нижнекамском районе Республики Татарстан. Изолят подращивали на агаризованной овсяной среде, которую готовили следующим образом: 160 г овсяных хлопьев доводили до кипения в 500 мл дистиллированной воды, в 400 мл дистиллированной воды расплавляли 14 г агар-агара. Растворы смешивали, объем среды доводили до 1 л. [5]. Для наращивания агрессивности патогена использовали метод, разработанный во ВНИИ фитопатологии [6]: газон из листьев картофеля опрыскивали суспензией зооспор и инкубировали при температуре 18-230С. После образования зооспорангиев проводили отбор максимально пораженных фитофторой листьев, зооспоры смывали дистиллированной водой. Таким образом было проведено 5 пассажей патогена.
Для определения ферментативной активности, индекса агрессивности патогена и содержания микроэлементов из клубней нарезались брусочки размером 7 x 10 x 30 мм. Опыты in vitro проводились в трех вариантах: контроль (неинфицированные фитофторой кубики картофеля); брусочки, инфицированные исходной расой и брусочки, инфицированные агрессивной расой фитофторы. Каждый вариант опыта был представлен двадцатью образцами.
Процедура инфицирования: брусочки картофеля одной гранью (7 х 30 мм) на 3-5 секунд погружали в суспензию зооспорангиев, разлитую слоем толщиной 2-3 мм в чашки Петри. Концентрация инокулюма составляла 5-7 конидий в поле зрения микроскопа при увеличении в 80 раз. Инкубацию брусочков проводили при комнатной температуре (18-200С) в перекрытых чашках Петри. Инфицированная грань брусочка была обращена вверх.
Через шесть суток измеряли длину зоны поражения и определяли интенсивность споро-ношения по пятибалльной шкале: 0 - спороношение отсутствует, 5 - спороношение по всей поверхности пораженной зоны, 1-4 - промежуточные значения.
Индекс агрессивности патогена вычисляли по формуле:
У I- D
Х = ^-
n
где ij — средняя величина поражения, мм; Dj - средняя интенсивность спороношения, балл; n - количество заражений.
Для определения активности антиоксидантных ферментов и содержания микроэлементов с граней брусочков, которые были инфицированы, срезали слой ткани высотой в 2-3 мм. В этих срезанных частях после соответствующей подготовки и проводились указанные выше определения. С контрольных брусочков также срезали слой, обращенный вверх.
Активность пероксидазы определяли в кинетической реакции с ферроцианидом калия [7].
Активность каталазы определяли по А.Н.Баху и А.М. Опарину [8].
Содержание марганца, железа и меди в клубнях картофеля определяли методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии на спектрофотометре марки «AAS-З». Определение проводили в окислительном воздушно-ацетиленовом пламени при длинах волн: для железа - 248.3 нм, для марганца - 279.5 нм, для меди - 324.8 нм [9].
Влияние марганца на резистентность растительных клеток к фитофторе изучали с использованием следующих соединений: сульфата марганца, комплекса марганец-ЭДТА (ООО «Агро-химснаб», Россия), сукцината марганца (Universal Nutrition, США). В экспериментах использовали растворы указанных соединений с равной концентрацией по марганцу - 0.8 г/л.
В опытах in vitro брусочки картофеля размером 7 х 10 х 30 мм перед инфицированием фитофторой выдерживали в растворах, содержащих марганец, в течение двух часов. Контролем служили брусочки, выдержанные в дистиллированной воде.
Обсуждение результатов
В опытах использовали водные растворы двух хелатных комплексов марганца: сукцинат марганца, марганец-ЭДТА, а также водный раствор традиционного микроудобрения - сульфата марганца. Обработка проводилась растворами с концентрацией по марганцу 0.8 г/л.
Картофельные брусочки выдерживали в течение двух часов в соответствующих растворах. В каждый вариант опыта было взято по десять брусочков. Контрольные образцы выдерживали в дистиллированной воде в течение двух часов.
Инокуляцию брусочков проводили агрессивной расой фитофторы. Активность ка-талазы и пероксидазы, концентрации металлов и проявление агрессивности патогена определяли описанными ранее способами через шесть суток после заражения.
Результаты эксперимента представлены в табл. 1 и на рис. 1, из которых видно, что обработка картофеля соединениями марганца индуцировала устойчивость к патогену. Причем наиболее устойчивыми к развитию фитофтороза оказались образцы, обработанные сукцинатом марганца. Менее устойчивыми были образцы, обработанные комплексом Мп-ЭДТА. Хуже противостояли развитию паразита клубни, обработанные сульфатом марганца, хотя проявление агрессивности фитофторы в этой группе было все же ниже, чем в контрольном варианте. Что касается активности ферментов, то в образцах, обработанных соединениями марганца, активность каталазы и пероксидазы была ниже, чем в контрольных клетках. По мере снижения активности этих ферментов варианты эксперимента располагаются следующим образом: интактные клетки, клетки обработанные сульфатом марганца, комплексом марганца с ЭДТА и сукцинатом марганца.
Следует отметить, что снижение активности каталазы было достаточно значительным: от 13.1 ± 0.58 мкмоль/мин-г в контроле до 6.34 ± 0.35 мкмоль/мин-г в варианте с сук-цинатом марганца. Статистическая обработка показателей активности этого фермента показала, что эти различия достоверны (р = 0.005).
Снижение активности пероксидазы носило менее резкий характер: от 56.9 ± 4.10 мкмоль/мин-г в контроле до 40.5 ± 5.71 мкмоль/мин-г в варианте с сукцинатом марганца.
Что касается содержания микроэлементов, то было естественно предположить, что инкубация картофельных кубиков в растворах марганца приведет к увеличению содержания этого элемента, хотя бы за счет адсорбции или пассивной диффузии этого элемента в растительные ткани. Определение содержания марганца показало, что содержание этого элемента было приблизительно в полтора раза выше в образцах, инкубированных в растворах с сульфатом марганца и марганец ЭДТА, чем в контроле. Если в последнем его концентрация составляла 6.22 ± 0.75 мг/кг сыр. ткани, то в варианте с сульфатом марганца - 9.10 ± 0.34 мг/кг сыр. ткани, а в варианте с марганец-ЭДТА - 9.92 ± 0.30 мг/кг сырой ткани.
80
70
60
50
40
30
20
10
80
70
60
50
40
30
20
10
Индекс агрессивности 0 Каталаза
Контроль Янтарн. к-та - Мп I I Пероксидаза
Сульфат Мп ЭДТА-Мп
0
Рис. 1 - Показатели индекса агрессивности, активности каталазы и пероксидазы в ткани клубней картофеля из разных экспериментальных групп
Таблица 1 - Показатели активности ферментов, содержания железа, меди, марганца и индексы агрессивности патогена в клубнях после их обработки соединениями марганца
Экспериментальные группы Проявление агрессивности патогена Активность ферментов Содержание металлов в клубнях, мг/кг сыр. ткани
Каталаза мкмоль/мин-г Пероксидаза мкмоль/мин-г Ре Си Мп
Контроль (вода) 72 13.1 ± 0.58 56.9 ± 4.10 17.8 ± 1.08 2.33 ± 0.41 6.22 ± 0.75
Сульфат марганца 46 10.4 ± 0.21 48.8 ± 3.42 15.9 ± 1.83 2.06 ± 0.44 9.10 ± 0.34
Мп-ЭДТА 28 7.21 ± 0.25 44.2 ± 3.89 14.5 ± 2.55 2.22 ± 0.32 9.92 ± 0.30
Мп-янтар. кислота 12 6.34 ± 0.35 40.5 ± 5.71 15.3 ± 2.18 2.80 ± 0.35 14.3 ± 0.23
Максимальное содержание марганца в ткани клубней наблюдалось при использовании соединения Мп-янтарная кислота (14.3 ± 0.23 мг/кг сыр. ткани), достоверно отличаясь, в свою очередь, от других экспериментальных групп (р < 0.05).
Анализ образцов на содержание железа также продемонстрировал некоторые изменения: в вариантах опыта с соединениями марганца его количество снижалось. Если в последнем его концентрация составляла 17.8 ± 1.08 мг/кг сыр. ткани, то в вариантах с марганцем колебалась от 14.5 ± 2.55 мг/кг сыр. ткани до 15.9 ± 1.83 мг/кг сыр. ткани.Различия в содержании меди было незначительным: в контроле (2.33 ± 0.41 мг/кг сыр. ткани) и вариантах с сульфатом марганца (2.06 ± 0.44 мг/кг сыр. ткани) и марганец - ЭДТА (2.22 ± 0.32 мг/кг сыр. ткани). Несколько выше (на 20 %) его концентрация была только в образцах, обработанных сукцинатом марганца - 2.80 ± 0.35 мг/кг сыр. ткани. Характер зависимости проявления агрессивности фитофторы от активности каталазы и содержания марганца представлен на рис. 2.
Рис. 2 - Зависимость индекса агрессивности от показателей активности каталазы и содержания Mn в клубнях картофеля из разных экспериментальных групп
Таким образом, данные описанной серии экспериментов свидетельствуют о том, что обработка ткани картофеля соединениями марганца индуцирует устойчивость картофеля к фитофторе, приводит к снижению активности каталазы и пероксидазы, при этом наиболее значительно эти показатели изменяются в варианте с сукцинатом марганца. Применение соединений марганца, возможно, является одним из способов коррекции устойчивости картофеля к фитофторозу.
Литература
1. Филиппов, А.В. Сроки обработки картофеля для защиты от фитофтороза / А.В.Филиппов // Защита и карантин растений. - 2005. - № 4. - С.74-91.
2. Mittler, R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance / R. Mittler, X. Feng, M. Cohen // Plant Cell. - 1998. - Vol.10. - № 3. - P.461-473.
3. Полесская, О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода / О.Г. Полесская. - М.: КДУ, 2007. - 140 с.
4. Ребров, В.Г. Витамины и микроэлементы / В.Г. Ребров, О.А. Громова. - М.: Алев-В, 2003. -670 с.
5. Поединок, Н.Л. Использование медицинской желчи для ограничения роста колоний Phy-tophthora infestans // Н.Л. Поединок, Ю.Т. Дьяков // Микология и фитопатология. - 1981. - № 6. -С.470-472.
6. Filippov, A.V. Methods of increasing of potatoes stability to phytophthorose / A.V. Filippov, M.A. Kuznetzova, A.N. Rogozhin // J. Rus. Phytopathol. Soc. - 2000. - № 1. - P.69-73.
7. Рогожкин, В.В. Практикум по биологической химии / В.В.Рогожкин. - СПб.: Лань, 2006. -255 с.
8. Тенишева, Н.Х. Практикум по биохимии / Н.Х. Тенишева. - Казань: изд-во КГПУ, 2003. - 150 с.
9. Хавезов, И.Л. Атомно-абсорбционный анализ / И.Л. Хавезов, Д.А. Цалев. - Л.: Химия, 1983. -144 с.
© Л. А. Ганеева- ст. препод. каф. химии Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета, e-mail: kolbatonalilya@mail.ru; И. С. Докучаева - канд. хим.наук, доц. каф. оборудования пищевых производств КГТУ.
