Научная статья на тему 'Активность гидролаз, их ингибиторов в тканях растений при заражении фитопатогенами и обработке индукторами устойчивости'

Активность гидролаз, их ингибиторов в тканях растений при заражении фитопатогенами и обработке индукторами устойчивости Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

CC BY
485
88
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ГИДРОЛАЗЫ / ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ / САЛИЦИЛОВАЯ И ЖАСМОНОВАЯ КИСЛОТЫ / S. NODORUM / PH. INFESTANS / HYDROLASE / INHIBITORS PROTEINASE / SALICYLIC ACID AND JASMONIC ACID

Аннотация научной статьи по агробиотехнологии, автор научной работы — Ахатова А. Р., Яруллина Л. Г., Шпирная И. А., Заикина Е. А., Сурина О. Б.

В данной статье приведены результаты исследований влияния обработки салициловой и жасмоновой кислотами на уровень активности протеолитических и амилолитических ферментов, их ингибиторов в тканях пшеницы и каллусах картофеля при поражении патогенными микроорганизмами (Septoria nodorum, Phytophthora infestans). Выявлено, что заражение растений патогенами и обработка сигнальными молекулами приводит к повышению уровня активности ингибиторов протеиназ и снижению активности собственных амилаз в растительных тканях.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по агробиотехнологии , автор научной работы — Ахатова А. Р., Яруллина Л. Г., Шпирная И. А., Заикина Е. А., Сурина О. Б.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

ACTIVITY OF HYDROLASES AND THEIR INHIBITORS IN PLANT TISSUES DURING INFECTION OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI UNDER RESISTANCE INDUCTORS

This article presents the results of studying the salicylic and jasmonic acids effect on the level of activity of proteolytic and amylolytic enzymes and their inhibitors in the tissues of wheat and potato calli with the defeat of pathogens (Septorianodorum, Phytophthorainfestans). It is revealed that the infection of plant pathogenns and processing of signaling molecules leads to increasing the activity of proteinase inhibitors and reducing the activity of their own amylases in plant tissues.

Текст научной работы на тему «Активность гидролаз, их ингибиторов в тканях растений при заражении фитопатогенами и обработке индукторами устойчивости»

УДК 577.l5 +63l.524

АКТИВНОСТЬ ГИДРОЛАЗ, ИХ ИНГИБИТОРОВ В ТКАНЯХ РАСТЕНИЙ ПРИ ЗАРАЖЕНИИ ФИТОПАТОГЕНАМИ И ОБРАБОТКЕ ИНДУКТОРАМИ

УСТОЙЧИВОСТИ

© А. Р. Ахатова1, Л. Г. Яруллина1,2*, И. А. Шпирная2, Е. А. Заикина1,

О. Б. Сурина1, В. О. Цветков2, Р. И. Ибрагимов2

1Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.

Тел./факс: +7 (347) 235 60 SS.

E-mail: yarullina@bk.ru 2Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

Тел./факс: +7 (347) 273 67 7S.

E-mail: ibragimov56@yandex. ru

В данной статье приведены результаты исследований влияния обработки салициловой и жасмоновой кислотами на уровень активности протеолитических и амилолитических ферментов, их ингибиторов в тканях пшеницы и каллусах картофеля при поражении патогенными микроорганизмами (Septoria nodorum, Phytophthora infestans). Выявлено, что заражение растений патогенами и обработка сигнальными молекулами приводит к повышению уровня активности ингибиторов протеиназ и снижению активности собственных амилаз в растительных тканях.

Ключевые слова: гидролазы, ингибиторы протеиназ, салициловая и жасмоновая кислоты, S. nodorum, Ph. infestans.

Введение

Одним из факторов агрессивности и патогенности у микробных возбудителей болезней растений являются гидролитические ферменты, которые обеспечивают эффективное расщепление растительных полимеров. Известно, что важной составляющей защитного ответа растений на действие патогенов является образование соединений, подавляющих гидролитическую активность микроорганизмов [1]. Многочисленные данные свидетельствуют об участии ингибиторов гидролаз в защитных реакциях растений [2, 3], также показана возможность изменения баланса ингибиторов протеиназ в тканях под воздействием стрессоров биотической и абиотической природы [4-6]. Вероятно, изменение уровня анти-ферментной активности является важной частью приспособительных механизмов растительного организма, в частности, при инфицировании патогенными организмами.

В индукции и реализации защитного ответа в растительном организме принимают участие различные сигнальные системы. Выявлена важная роль салициловой и жасмоновой кислот в качестве сигнальных молекул (медиаторов) при развитии защитных реакций растений [7]. В этом плане исследование ферментативных процессов, происходящих в тканях, обработанных сигнальными молекулами на фоне заражения растений патогенными микроорганизмами, представляет несомненный научный и практический интерес.

В нашей работе измеряли уровень активности амилолитических и протеолитических ферментов, ингибиторов протеиназ в листьях пшеницы при заражении возбудителем септориоза и в каллусах картофеля при заражении фитофторой на фоне воздействия салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот.

Экспериментальная часть

В опытах использовали листья мягкой пшеницы ТтШеит агяйуыш Ь. сорта Башкирская 24, выращенные из предобработанных (3 ч) 10-6 М раствором СК (чда, «Реахим» (Россия) и 10-7 М раствором ЖК (чда, «Реахим» (Россия). Семена предварительно проращивали на фильтровальной бумаге при комнатной температуре. Полностью развернутые листья 7-и суточных проростков срезали, помещали во влажную камеру на фильтровальную бумагу, срезы прикрывали ватой, смоченной в растворе бензимидазола (40 мг/л). Отрезки листьев инокулировали 2 мкл суспензии пикноспор 8. пвйвтит из расчета 106 спор/мл [8]. Интенсивность развития гриба на эпидермисе листьев оценивали через 96 ч после инокуляции.

В качестве эксплантов для получения каллусов использовали отделенные зеленые листья пробирочных растений картофеля сорта Ранняя роза [9]. В опыте полученные каллусы раскладывали в чашки Петри по поверхности твердой питательной среды Мурасига-Скуга (МС), содержащей СК в конечной концентрации 0.05 мМ и ЖК (10-7 М). Контролем служили каллусы, растущие на среда МС. На 3 сутки после первого пассажа каллусы инфицировали 2 мкл суспензии зооспор PH. infestans (105 спор/мл). Интенсивность развития фитофтороза оценивали на 3-и и 10-е сутки после инокуляции.

Активность протеиназ и их ингибиторов определяли спектрофотометрически по гидролизу хромогенного синтетического субстрата БАПНА [10] и по гидролизу желатина, активность амилаз - по гидролизу крахмала, иммобилизованных в геле агарозы [11].

Результаты и их обсуждение Влияние СК и ЖК на развитие гриба пойогыт на листьях пшеницы

Наблюдение за ростом гриба 8. пойвтит на эпидермисе листьев показало, что признаки развития

* автор, ответственный за переписку

септориоза в контрольных листьях наблюдались через 24 ч после инфицирования в виде слабого обесцвечивания листьев с последующим их побурением, а через 72 ч после инокуляции симптомы септориоза проявлялись в виде крупных бурых пятен (рис. 1а).

На листьях растений, предобработанных СК и ЖК, симптомы болезни были выражены значительно слабее, чем у листьев контрольного варианта (рис. 1 б, в). Как видно, предпосевная обработка семян как СК, так и ЖК задерживает развитие гриба на листьях в течение 72 ч наблюдений, что указывает на индуцирование устойчивости пшеницы к септориозу в этих вариантах опыта.

При поражении пшеницы патогенным грибом S. nodorum происходит изменение уровня активности гидролитических ферментов (табл. 1) и ингибиторов протеиназ в листьях (рис. 2).

В частности, при заражении патогеном снижается уровень активности как гидролитических ферментов (амилаз, протеиназ), так и активность их ингибиторов. Предобработка семян пшеницы индукторами устойчивости существенно не влияет на уровень гидролитической и антипротеиназной активности в листьях незараженных растений. Тогда как инфицирование растений, выращенных из пре-добработанных индукторами устойчивости семян, приводит к повышению активности ингибиторов протеиназ в листьях.

Изменения в активности протеиназ, амилаз, и их ингибиторов имеют место также при заражении каллусов картофеля фитофторой на фоне обработки индукторами устойчивости (табл. 2; рис. 3).

Причем, активность протеолитических, ами-лолитических ферментов, а также их ингибиторов изменяется как при заражении фитофторой, так и

под воздействием обработки каллусов индукторами устойчивости. Так, в инфицированных каллусах уже в начале взаимодействия растительных клеток с патогеном (3-сутки после инокуляции) происходит повышение протеолитической активности (табл. 2), и снижение активности ингибиторов протеиназ (рис. 3) Однако на 10-е сутки инфицирования активность ингибиторов протеиназ в каллусах картофеля во всех вариантах опыта становилась выше, чем в контроле (табл. 2).

Интересно отметить, что заражение каллусов сопровождается полным подавлением амилолити-ческой активности в тканях. Во всех вариантах с неинокулированным материалом, в каллусах выявляется активность амилолитических ферментов. Причем, обработка незараженных каллусов индукторами устойчивости существенно повышает уровень активности амилаз в незараженных тканях. Напротив, в зараженных фитофторой каллусах, в т.ч. и при обработке СК и ЖК, активность амилаз не выявлялась. Как уже отмечалось, гидролитические ферменты, продуцируемые патогеном, играют важную роль в их вирулентности, обеспечивая разрушение защитных барьеров клеточных стенок.

Известно, что амилолитическая активность характерна для представителей большинства таксономических групп грибов и почти всегда эти ферменты представлены конститутивными белками, даже у дереворазрушающих грибов [12]. Однако амилаза отсутствует у оомицетов, в частности у грибов рода Phytophthora. Представители этого рода используют для расщепления крахмала ферменты картофеля, активируя их биосинтез в пораженных клубнях [13].

а б в

Рис. 1. Проявление симптомов септориоза на листьях пшеницы, обработанных салициловой и жасмоновой кислотами, через 72 ч после инокуляции. а - контроль, б - обработка СК, в - обработка ЖК.

Таблица 1

Активность гидролитических ферментов в листьях пшеницы Башкирская 24 при инфицировании 8. пвйвгит

и обработке индукторами устойчивости

1 № | Вариант опыта | Активность протеиназ, ПЕ/мл | Активность амилаз, АЕ/мл |

1 контроль 2.2+0.2 17.З±1.8

2 S. nodorum 1.4±0.1 8.8±0.7

З обработка СК 1.9±0.1 17.5±1. 8

4 СК+ S. nodorum 1.6±0.07 12.7±0.2

5 обработка ЖК 1.9±0.08 17.2±1.8

6 ЖК + S. nodorum 1.4±0.05 8.8±0.6

Вариант опыта

Рис. 2. Активность ингибиторов протеиназ в листьях пшеницы при инфицировании S. nodorum и обработке индукторами устойчивости. 1 - контроль; 2 - S. nodorum; З - обработка СК; 4 - СК+ S. nodorum; 5 - обработка ЖК; б - ЖК + S. nodorum.

□ 3-х суточные

□ 10-ти суточные

о

о

га

S

ГЇ

S

S

З00

250

200

150

100

50

і

і

1 2 3 4 5 6

Вариант опыта

Рис. З. Активность ингибиторов протеиназ в каллусах картофеля, обработанных индукторами устойчивости и зараженных Ph. infestans. 1 - контроль; 2 - Ph. infestans; З - обработка СК; 4 - СК+ Ph. infestans; 5 - обработка ЖК;

б - ЖК + Ph. Infestans.

Таблица 2

Активность гидролитических ферментов в каллусах картофеля сорта Ранняя роза, обработанных индукторами устойчивости и зараженных PH. infestans

№ Вариант опыта Собственная протеолитическая активность (желатин), ПЕ/ мл Собственная амилолитическая активность, АЕ/ мл

I 1 II I 1 II

1 Контроль 1.9+0.01 9.75±0.8 4.2±0.0З 6.З±0.04

2 Ph. infestans З.4±0.0З 19.5±1.2 0 0

З Обработка СК 2.З±0.02 9.75±0.7 6.2±0.04 9.6±0.5

4 СК+ Ph. infestans З.6±0.02 18.25±1.З 0 0

5 Обработка ЖК 1.9±0.01 12.5±0.9 4.2±0.02 19.6±1.З

б ЖК + Ph. infestans З.6±0.0З 1З.75±1.1 0 0

Примечание: I - 3-и сутки после инфицирования; II - 10-е сутки после инфицирования

0

Таким образом, подавление активности собственных гидролитических ферментов и повышение уровня активности ингибиторов экзогенных гидролаз в тканях может являться проявлением защитных механизмов растений при патогенезе.

Работа проведена при финансовой поддержке гранта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы проект ГК №16.740.11.0061 и РФФИ_поволжье_а № 11-04-97037.

ЛИТЕРАТУРА

1. Яруллина Л. Г., Ибрагимов Р. И. Клеточные механизмы формирования устойчивости растений к грибным патогенам. Уфа: Гилем, 2006. 232 с.

2. Мосолов В. В., Валуева Т. А. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. Т.41. №3. С. 261-282.

3. Ревина Т. А., Г ерасимова Н. Г., Кладницкая Г. В., Чаленко Г. И., Валуева Т. А. Влияние белковых ингибиторов протеиназ из клубней картофеля на рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44. №1. С. 101-105.

4. Домаш В. И., Шарпио Т. П., Забрейко С. А., Сосновская Т. Ф. Протеолитические ферменты и ингибиторы трипсина высших растений в условиях стресса // Биоорганическая химия. 2008. Т. 1. № 3. С. 353-357.

5. Фролова С. А., Титов А. Ф. Активность протеолитических ферментов и ингибиторов трипсина в листьях пшеницы в начальный период действия и в последействии низкой закаливающей температуры // Физиология растений. 2008. №5. С. 549-552.

6. Шпирная И. А., Ахатова А. Р., Цветков В. О., Яруллина Л. М., Артемьева М. А., Ибрагимов Р. И. Иммуностимулирующий эффект препаратов-биорегуляторов при обработке клубней картофеля // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13. №5(3). С. 221-224.

7. Тарчевский И. А. Сигнальные системы растений. М.: Наука, 2002. 294 с.

8. Пыжикова Г. В., Карасева Е. В., Методика изучения возбудителя септориоза на изолированных листьях пшеницы // С.-х. биология. 1985. №12. С. 112-114.

9. Калинин Ф. Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. К.: Наукова думка, 1980. 488 с.

10. Erlanger B. F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrutes of trypsin // Arch. Biochem. Biophys. 1961. V. 95. №2. P. 271-278.

11. Шпирная И. А., Умаров И. А., Шевченко Н. Д., Ибрагимов Р. И. Определение активности гидролаз и их ингибиторов с использованием субстратов, иммобилизованных в геле агарозы // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т. 45, N 4. С. 497-501.

12. Семенкова И. Г. Фитопатология. Дереворазрушающие грибы, гнили и патологические окраски древесины (определительные таблицы). М.: ГОУВПОМГУЛ, 2008. 72 с.

13. Бэккер З. Э. Физиология и биохимия грибов. М.: Изд. МГУ, 1988. 230 с.

Поступила в редакцию 16.05.2012 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.