CC BY
111
УДК 577.l5 +63l.524
АКТИВНОСТЬ ГИДРОЛАЗ, ИХ ИНГИБИТОРОВ В ТКАНЯХ РАСТЕНИЙ ПРИ ЗАРАЖЕНИИ ФИТОПАТОГЕНАМИ И ОБРАБОТКЕ ИНДУКТОРАМИ
УСТОЙЧИВОСТИ
© А. Р. Ахатова1, Л. Г. Яруллина1,2*, И. А. Шпирная2, Е. А. Заикина1,
О. Б. Сурина1, В. О. Цветков2, Р. И. Ибрагимов2
1Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Тел./факс: +7 (347) 235 60 SS.
E-mail: [email protected] 2Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел./факс: +7 (347) 273 67 7S.
E-mail: ibragimov56@yandex. ru
В данной статье приведены результаты исследований влияния обработки салициловой и жасмоновой кислотами на уровень активности протеолитических и амилолитических ферментов, их ингибиторов в тканях пшеницы и каллусах картофеля при поражении патогенными микроорганизмами (Septoria nodorum, Phytophthora infestans). Выявлено, что заражение растений патогенами и обработка сигнальными молекулами приводит к повышению уровня активности ингибиторов протеиназ и снижению активности собственных амилаз в растительных тканях.
Ключевые слова: гидролазы, ингибиторы протеиназ, салициловая и жасмоновая кислоты, S. nodorum, Ph. infestans.
Введение
Одним из факторов агрессивности и патогенности у микробных возбудителей болезней растений являются гидролитические ферменты, которые обеспечивают эффективное расщепление растительных полимеров. Известно, что важной составляющей защитного ответа растений на действие патогенов является образование соединений, подавляющих гидролитическую активность микроорганизмов [1]. Многочисленные данные свидетельствуют об участии ингибиторов гидролаз в защитных реакциях растений [2, 3], также показана возможность изменения баланса ингибиторов протеиназ в тканях под воздействием стрессоров биотической и абиотической природы [4-6]. Вероятно, изменение уровня анти-ферментной активности является важной частью приспособительных механизмов растительного организма, в частности, при инфицировании патогенными организмами.
В индукции и реализации защитного ответа в растительном организме принимают участие различные сигнальные системы. Выявлена важная роль салициловой и жасмоновой кислот в качестве сигнальных молекул (медиаторов) при развитии защитных реакций растений [7]. В этом плане исследование ферментативных процессов, происходящих в тканях, обработанных сигнальными молекулами на фоне заражения растений патогенными микроорганизмами, представляет несомненный научный и практический интерес.
В нашей работе измеряли уровень активности амилолитических и протеолитических ферментов, ингибиторов протеиназ в листьях пшеницы при заражении возбудителем септориоза и в каллусах картофеля при заражении фитофторой на фоне воздействия салициловой (СК) и жасмоновой (ЖК) кислот.
Экспериментальная часть
В опытах использовали листья мягкой пшеницы ТтШеит агяйуыш Ь. сорта Башкирская 24, выращенные из предобработанных (3 ч) 10-6 М раствором СК (чда, «Реахим» (Россия) и 10-7 М раствором ЖК (чда, «Реахим» (Россия). Семена предварительно проращивали на фильтровальной бумаге при комнатной температуре. Полностью развернутые листья 7-и суточных проростков срезали, помещали во влажную камеру на фильтровальную бумагу, срезы прикрывали ватой, смоченной в растворе бензимидазола (40 мг/л). Отрезки листьев инокулировали 2 мкл суспензии пикноспор 8. пвйвтит из расчета 106 спор/мл [8]. Интенсивность развития гриба на эпидермисе листьев оценивали через 96 ч после инокуляции.
В качестве эксплантов для получения каллусов использовали отделенные зеленые листья пробирочных растений картофеля сорта Ранняя роза [9]. В опыте полученные каллусы раскладывали в чашки Петри по поверхности твердой питательной среды Мурасига-Скуга (МС), содержащей СК в конечной концентрации 0.05 мМ и ЖК (10-7 М). Контролем служили каллусы, растущие на среда МС. На 3 сутки после первого пассажа каллусы инфицировали 2 мкл суспензии зооспор PH. infestans (105 спор/мл). Интенсивность развития фитофтороза оценивали на 3-и и 10-е сутки после инокуляции.
Активность протеиназ и их ингибиторов определяли спектрофотометрически по гидролизу хромогенного синтетического субстрата БАПНА [10] и по гидролизу желатина, активность амилаз - по гидролизу крахмала, иммобилизованных в геле агарозы [11].
Результаты и их обсуждение Влияние СК и ЖК на развитие гриба пойогыт на листьях пшеницы
Наблюдение за ростом гриба 8. пойвтит на эпидермисе листьев показало, что признаки развития
* автор, ответственный за переписку
септориоза в контрольных листьях наблюдались через 24 ч после инфицирования в виде слабого обесцвечивания листьев с последующим их побурением, а через 72 ч после инокуляции симптомы септориоза проявлялись в виде крупных бурых пятен (рис. 1а).
На листьях растений, предобработанных СК и ЖК, симптомы болезни были выражены значительно слабее, чем у листьев контрольного варианта (рис. 1 б, в). Как видно, предпосевная обработка семян как СК, так и ЖК задерживает развитие гриба на листьях в течение 72 ч наблюдений, что указывает на индуцирование устойчивости пшеницы к септориозу в этих вариантах опыта.
При поражении пшеницы патогенным грибом S. nodorum происходит изменение уровня активности гидролитических ферментов (табл. 1) и ингибиторов протеиназ в листьях (рис. 2).
В частности, при заражении патогеном снижается уровень активности как гидролитических ферментов (амилаз, протеиназ), так и активность их ингибиторов. Предобработка семян пшеницы индукторами устойчивости существенно не влияет на уровень гидролитической и антипротеиназной активности в листьях незараженных растений. Тогда как инфицирование растений, выращенных из пре-добработанных индукторами устойчивости семян, приводит к повышению активности ингибиторов протеиназ в листьях.
Изменения в активности протеиназ, амилаз, и их ингибиторов имеют место также при заражении каллусов картофеля фитофторой на фоне обработки индукторами устойчивости (табл. 2; рис. 3).
Причем, активность протеолитических, ами-лолитических ферментов, а также их ингибиторов изменяется как при заражении фитофторой, так и
под воздействием обработки каллусов индукторами устойчивости. Так, в инфицированных каллусах уже в начале взаимодействия растительных клеток с патогеном (3-сутки после инокуляции) происходит повышение протеолитической активности (табл. 2), и снижение активности ингибиторов протеиназ (рис. 3) Однако на 10-е сутки инфицирования активность ингибиторов протеиназ в каллусах картофеля во всех вариантах опыта становилась выше, чем в контроле (табл. 2).
Интересно отметить, что заражение каллусов сопровождается полным подавлением амилолити-ческой активности в тканях. Во всех вариантах с неинокулированным материалом, в каллусах выявляется активность амилолитических ферментов. Причем, обработка незараженных каллусов индукторами устойчивости существенно повышает уровень активности амилаз в незараженных тканях. Напротив, в зараженных фитофторой каллусах, в т.ч. и при обработке СК и ЖК, активность амилаз не выявлялась. Как уже отмечалось, гидролитические ферменты, продуцируемые патогеном, играют важную роль в их вирулентности, обеспечивая разрушение защитных барьеров клеточных стенок.
Известно, что амилолитическая активность характерна для представителей большинства таксономических групп грибов и почти всегда эти ферменты представлены конститутивными белками, даже у дереворазрушающих грибов [12]. Однако амилаза отсутствует у оомицетов, в частности у грибов рода Phytophthora. Представители этого рода используют для расщепления крахмала ферменты картофеля, активируя их биосинтез в пораженных клубнях [13].
а б в
Рис. 1. Проявление симптомов септориоза на листьях пшеницы, обработанных салициловой и жасмоновой кислотами, через 72 ч после инокуляции. а - контроль, б - обработка СК, в - обработка ЖК.
Таблица 1
Активность гидролитических ферментов в листьях пшеницы Башкирская 24 при инфицировании 8. пвйвгит
и обработке индукторами устойчивости
1 № | Вариант опыта | Активность протеиназ, ПЕ/мл | Активность амилаз, АЕ/мл |
1 контроль 2.2+0.2 17.З±1.8
2 S. nodorum 1.4±0.1 8.8±0.7
З обработка СК 1.9±0.1 17.5±1. 8
4 СК+ S. nodorum 1.6±0.07 12.7±0.2
5 обработка ЖК 1.9±0.08 17.2±1.8
6 ЖК + S. nodorum 1.4±0.05 8.8±0.6
Вариант опыта
Рис. 2. Активность ингибиторов протеиназ в листьях пшеницы при инфицировании S. nodorum и обработке индукторами устойчивости. 1 - контроль; 2 - S. nodorum; З - обработка СК; 4 - СК+ S. nodorum; 5 - обработка ЖК; б - ЖК + S. nodorum.
□ 3-х суточные
□ 10-ти суточные
.й
о
о
га
S
ГЇ
S
S
З00
250
200
150
100
50
і
і
1 2 3 4 5 6
Вариант опыта
Рис. З. Активность ингибиторов протеиназ в каллусах картофеля, обработанных индукторами устойчивости и зараженных Ph. infestans. 1 - контроль; 2 - Ph. infestans; З - обработка СК; 4 - СК+ Ph. infestans; 5 - обработка ЖК;
б - ЖК + Ph. Infestans.
Таблица 2
Активность гидролитических ферментов в каллусах картофеля сорта Ранняя роза, обработанных индукторами устойчивости и зараженных PH. infestans
№ Вариант опыта Собственная протеолитическая активность (желатин), ПЕ/ мл Собственная амилолитическая активность, АЕ/ мл
I 1 II I 1 II
1 Контроль 1.9+0.01 9.75±0.8 4.2±0.0З 6.З±0.04
2 Ph. infestans З.4±0.0З 19.5±1.2 0 0
З Обработка СК 2.З±0.02 9.75±0.7 6.2±0.04 9.6±0.5
4 СК+ Ph. infestans З.6±0.02 18.25±1.З 0 0
5 Обработка ЖК 1.9±0.01 12.5±0.9 4.2±0.02 19.6±1.З
б ЖК + Ph. infestans З.6±0.0З 1З.75±1.1 0 0
Примечание: I - 3-и сутки после инфицирования; II - 10-е сутки после инфицирования
0
Таким образом, подавление активности собственных гидролитических ферментов и повышение уровня активности ингибиторов экзогенных гидролаз в тканях может являться проявлением защитных механизмов растений при патогенезе.
Работа проведена при финансовой поддержке гранта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы проект ГК №16.740.11.0061 и РФФИ_поволжье_а № 11-04-97037.
ЛИТЕРАТУРА
1. Яруллина Л. Г., Ибрагимов Р. И. Клеточные механизмы формирования устойчивости растений к грибным патогенам. Уфа: Гилем, 2006. 232 с.
2. Мосолов В. В., Валуева Т. А. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. Т.41. №3. С. 261-282.
3. Ревина Т. А., Г ерасимова Н. Г., Кладницкая Г. В., Чаленко Г. И., Валуева Т. А. Влияние белковых ингибиторов протеиназ из клубней картофеля на рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44. №1. С. 101-105.
4. Домаш В. И., Шарпио Т. П., Забрейко С. А., Сосновская Т. Ф. Протеолитические ферменты и ингибиторы трипсина высших растений в условиях стресса // Биоорганическая химия. 2008. Т. 1. № 3. С. 353-357.
5. Фролова С. А., Титов А. Ф. Активность протеолитических ферментов и ингибиторов трипсина в листьях пшеницы в начальный период действия и в последействии низкой закаливающей температуры // Физиология растений. 2008. №5. С. 549-552.
6. Шпирная И. А., Ахатова А. Р., Цветков В. О., Яруллина Л. М., Артемьева М. А., Ибрагимов Р. И. Иммуностимулирующий эффект препаратов-биорегуляторов при обработке клубней картофеля // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т. 13. №5(3). С. 221-224.
7. Тарчевский И. А. Сигнальные системы растений. М.: Наука, 2002. 294 с.
8. Пыжикова Г. В., Карасева Е. В., Методика изучения возбудителя септориоза на изолированных листьях пшеницы // С.-х. биология. 1985. №12. С. 112-114.
9. Калинин Ф. Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. К.: Наукова думка, 1980. 488 с.
10. Erlanger B. F., Kokowski N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic substrutes of trypsin // Arch. Biochem. Biophys. 1961. V. 95. №2. P. 271-278.
11. Шпирная И. А., Умаров И. А., Шевченко Н. Д., Ибрагимов Р. И. Определение активности гидролаз и их ингибиторов с использованием субстратов, иммобилизованных в геле агарозы // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т. 45, N 4. С. 497-501.
12. Семенкова И. Г. Фитопатология. Дереворазрушающие грибы, гнили и патологические окраски древесины (определительные таблицы). М.: ГОУВПОМГУЛ, 2008. 72 с.
13. Бэккер З. Э. Физиология и биохимия грибов. М.: Изд. МГУ, 1988. 230 с.
Поступила в редакцию 16.05.2012 г.
