CC BY
22
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
(Зурочка А.В. и соавт., 2016). Учитывая выявленное разнообразие модифицирующего действия бактерий и их супернатантов на нейтрофилы, мы предположили, что подобное влияние может быть связано с синтезом самими микроорганизмами ряда цитокинов (цитоки-ноподобных веществ — ЦПВ). Цель работы — проверка данного предположения.
Материалы и методы. В опытах использовали 65 клинических изолятов Staphylococcus aureus (n = 23), коагула-зоотрицательных стафилококков (КОС) — S. haemolyticus и S. epidermidis (n = 14), Enterococcus faecalis и E. faecalis (n = 8), Pseudomonas aeruginosa (n = 8), энтеробактерий — Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli (n = 12), выделенный из ран у больных с синдромом диабетической стопы, из влагалища у женщин с миомой матки, из пустул у новорожденных с пиодермией. Бактерии выращивали в мясопептонном бульоне (МПБ) в течение 24 ч, после чего культуры центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин и отбирали надосадочную жидкость (су-пернатант).
Наличие в супернатантах бактерий цитокинов (ЦПВ) определяли на приборе MAGPIX-100 (США) с использованием тест-системы Multiplex (Luminex, США) для определения 15 цитокинов (G-CSF, GM-CSF, IFNy, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-1P, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, MCP-1, MIP-1P, TGF-a); контролем служил МПБ без бактерий. Опыты проводили в двух повтор-ностях; результаты измерений округляли до 0,1 пкг/мл; при регистрации в супернатантах цитокинов в концентрации меньше 3 пкг/мл считали, что в образце ЦПВ отсутствуют. Данные обработаны методами вариационной статистики.
Результаты. Установлено, что в супернатантах бульонных культур бактерий обнаруживаются те или иные ЦПВ, наличие и концентрация которых зависели от видовой/ родовой принадлежности микроорганизмов. Наиболее активными продуцентами ЦПВ оказались штаммы S. aureus, в супернатантах которых присутствовали 13 из 15 тестируемых цитокинов (все, кроме IL-5 и TGF-a); бактерии остальных таксонов в порядке убывания числа продуцируемых ЦПВ распределились в ряд: КОС (7 цитокинов - G-CSF, GM-CSF, IFNy, IL-12p70, IL-17A, IL-1P, MIP-1P), энтерококки (4 - G-CSF, IFNy, IL-12p70, IL-17A), энтеробактерии и псевдомонады (1 — G-CSF). В то же время наблюдалось внутривидовое разнообразие бактерий по наличию и концентрации в супернатан-тах ЦПВ - доля штаммов-продуцентов с учетом их вида и типа ЦПВ колебалась в диапазоне 4,3-83,3%, а уровни варьировали от 3,3 до 239,6 пкг/мл. При этом максимальные (штаммовые и средние) значения концентраций ЦПВ регистрировались у изолятов S. aureus и S. haemolyticus. Следует отметить, что 5 цитокинов (G-CSF, GM-CSF, IFNy, IL-12p70, IL-17A) тестировались в супернатантах у ряда изолятов S. aureus, S. haemolyticus и E. faecalis в относительно высоких концентрациях (> 20 пкг/мл), другие ЦПВ в изученных образцах либо не обнаруживались, либо их уровень был ниже указанного порога.
Заключение. У изученных грамположительных и гра-мотрицательных бактерий в супернатантах бульонных культур выявляется ряд цитокинов (цитокиноподоб-ных веществ - ЦПВ), причем их продукция (наличие и уровень) зависит от таксономической принадлежности микроорганизмов и характеризуется внутривидовой вариабельностью. Наиболее активными продуцентами
ЦПВ являются стафилококки (S. aureus и КОС, в частности S. haemolyticus), которые способны синтезировать 7-13 цитокинов, причем 5 из них (G-CSF, GM-CSF, IFNy, IL-12p70, IL-17A) в относительно высоких концентрациях (> 20 пкг/мл). Учитывая принадлежность указанных цитокинов к провоспалительным и ростовым факторам, нельзя исключить их причастность к развитию начальных этапов воспалительной реакции при инфицировании тканей макроорганизма цитокин-продуцирующими бактериями, в частности путем ранней активации иммуно-компетентных клеток, что требует дальнейшего изучения данного феномена. С другой стороны, необходимо выяснить структурно-молекулярное сходство/различие ЦПВ бактерий с цитокинами макроорганизма, определить их генетическое детерминирование, эволюционное происхождение и роль в биологии прокариотов, а также их участие в формировании патогенного потенциала микроорганизмов.
ВЛИЯНИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА АКТИВНОГО ЦЕНТРА GM-CSF НА ПРОДУКЦИЮ БАКТЕРИЯМИ ЦИТОКИНОПОДОБНЫХ ВЕЩЕСТВ В БУЛЬОННЫХ КУЛЬТУРАХ
Зурочка В.А.1 2, Зурочка А.ВЛ 2, Дукардт В.В.1, Зуева Е.Б.1, Добрынина М.А.1, Тяпаева Я.В.3, Гриценко В.А.3, 4
1ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» УрО РАН, Екатеринбург, Россия
2 ФГАОУВО «Южно-Уральский государственный университет» (Национальный исследовательский университет), Челябинск, Россия
3 ФГБУН «Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза» УрО РАН, Оренбург, Россия
4 ФГБУН «Оренбургский научный центр» УрО РАН, Оренбург, Россия
Введение. В очаге воспаления бактериальные агенты неминуемо вступают во взаимодействие с различными регуляторными молекулами макроорганизма, в том числе цитокинами, которые могут не однозначно влиять на их жизнеспособность и биологические свойства. Так, нами экспериментально показано, что синтетический пептид активного центра GM-CSF оказывал ингиби-рующее действие на репродуктивный потенциал некоторых бактерий (в частности стафилококков) и их био-пленкообразование (Зурочка А.В. и соавт., 2015; Гриценко В.А. и соавт., 2015). В то же время в предварительных опытах нами выявлена способность клинических изо-лятов Staphylococcus aureus и ряда других бактерий экс-кретировать в культуральную среду цитокиноподобные вещества (ЦПВ), с наличием которых, возможно, связано разнонаправленное модифицирующее действие бактерий и их супернатантов на продукцию нейтрофилами широкого спектра цитокинов (Зурочка А.В. и соавт., 2016). Это послужило основанием для изучения влияния синтетического пептида активного центра GM-CSF на продукцию бактериями ЦПВ.
Материалы и методы. В опытах использовали 28 клинических изолятов S. aureus (n = 14), Enterococcus faecalis и E. faecalis (n = 8), энтеробактерий — Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli (n = 6), выделенных из ран у больных с синдромом диабетической стопы, из влагалища у женщин с миомой матки, из пустул у новорожденных с пио-
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
дермией. Бактерии выращивали в течение 24 часов в мя-сопептонном бульоне (МПБ) с синтетическим пептидом активного центра GM-CSF (в конечной концентрации 10 мкг/мл) и без него, после чего культуры центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут и отбирали надо-садочную жидкость (супернатант).
Наличие в супернатантах бактерий цитокинов (ЦПВ) и их уровень определяли на приборе MAGPIX-100 (USA) с использованием тест-системы мультиплексного анализа (Multiplex) компании Luminex (USA) для определения 15 цитокинов (G-CSF, GM-CSF, IFNy, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, MCP-1,MIP-1ß, TGF-a); контролем служил МПБ без бактерий. Опыты проводили в двух повторностях; результаты измерений округляли до 0,1 пкг/мл; при регистрации в супернатанте цитокинов в концентрации меньше 3 пкг/мл считали, что в образце ЦПВ отсутствуют. Данные обработаны методами вариационной статистики. О достоверности отличий между опытными и контрольными группами судили по критерию Стьюдента — t (p < 0,05).
Результаты. Добавление в МПБ синтетического пептида активного центра GM-CSF по-разному влияло на продукцию ЦПВ бактериями в зависимости от их видовой/родовой принадлежности. Так, при наличии в среде данного пептида у всех культур энтерококков регистрировалось снижение в супернатантах уровня продуцируемых ими ЦПВ (G-CSF, IFNy, IL-12p70, IL-17A) на 58,5-98,3%, тогда как у энтеробактерий (K. pneumoniae и E. coli) уменьшение концентрации G-CSF наблюдалось только у 33,3% культур, а у остальных изолятов фиксировалось повышение уровня указанного ЦПВ в 2,2-2,5 раза. Среди изоля-тов S. aureus реакция на синтетический пептид GM-CSF была еще более вариабельной и касалась всех продуцируемых ими ЦПВ (G-CSF, GM-CSF, IFNy, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-6, MCP-1, MIP-1ß). С учетом изменения под действием пептида концентрации ЦПВ в супернатантах культур S. aureus выделено 3 группы изолятов: 1 — 7,1-42,9% штаммов, у которых наблюдалось снижение продукции указанных ЦПВ (в среднем на 15,065,8%); 2 — 7,1-57,1% штаммов, у которых уровень ЦПВ существенно не изменялся (±10% от контроля — индифферентность); 3 — 35,7-64,3% штаммов, у которых фиксировалось повышение концентрации ЦПВ (в 1,4-3,6 раза; p < 0,05). Эта же закономерность касалась и тех ЦПВ (G-CSF, IFNy, IL-12p70, IL-17A), которые секретирова-лись S. aureus в контроле на относительно высоком уровне (> 20 пкг/мл) — их продукция под действием синтетического пептида GM-CSF у одних изолятов бактерий стимулировалась в 1,4-2,3 раза, у других — ингибировалась на 15,0-32,6%.
Заключение. Анализ полученных данных свидетельствует, что присутствие в питательной среде синтетического пептида активного центра GM-CSF отражается на способности грампозитивных и грамнегативных бактерий продуцировать цитокиноподобные вещества (ЦПВ), а направленность и выраженность этой реакции на пептид характеризуются не только видовой/родовой детерминированностью, но и штаммовой вариабельностью. Следует отметить, что большинство изолятов S. aureus, у которых под влиянием пептида наблюдалась стимуляция выработки ЦПВ, были выделены из ран у больных с синдромом диабетической стопы. Изучение механизмов продукции бактериями ЦПВ и её регуляции синтетическим пептидом активного центра GM-CSF должно стать предметом дальнейших исследований.
ЗАВИСИМОСТЬ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ МАКРОФАГОВ ОТ СТРУКТУРЫ ИМПЛАНТИРУЕМОГО МАТЕРИАЛА
Калмыкова Н.В., Демьяненко И.А., Хац Ю.С., Суслов А.П.
ФГБУ«Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
При контакте макрофагов с имплантируемым материалом происходит их активация и последующая поляризация на два подтипа — классически активированных М1 и альтернативно активированных М2. Так как одной из основных проблем регенеративной медицины и трансплантологии является ответ организма хозяина на введенный материал, то поляризация макрофагов крайне важна, так как именно соотношение подтипов М1/М2 в зоне введения определяет выраженность воспаления, деградацию материала и скорость регенерации ткани. В литературе имеется множество данных о связи поляризации иммуногенеза с физическими и механическими свойствами имплантируемого, но мало известно о зависимости поляризации от морфологической структуры. В настоящей работе было изучено влияние структуры имплантируемого материала на вызываемый им макрофагальный ответ, а именно на соотношение М1 и М2 подтипов макрофагов.
Цель. Исследовать дифференцировку макрофагов на подтипы М1 и М2 при имплантации разных структурных форм биоматериала на основе очищенного внеклеточного матрикса (ВКМ), полученного методом щелочной обработки дермы быка домашнего.
Для анализа тканевой реакции мышам (п = 48) делали подкожные инъекции исследуемых образцов в область спины. Животным опытной группы вводили биоматериал на основе очищенного ВКМ в форме геля и в форме порошка с жидким компонентом глюкозой для удобства введения. Гель представляет собой солюбилизированный ма-трикс, а порошок — измельченный матрикс с сохраненной структурой пучков волокон и волокон с размером частиц не более 500 мкм. Животным контрольной группы вводили аналогичный объем 10% раствора глюкозы. На 1-е и 5-е сутки после инъекций мышей выводили из эксперимента и проводили иссечение участков кожного лоскута, содержавших имплантированный образец. На срезах кожного лоскута проводили иммуногистохимическое выявление специфического макрофагального антигена £4/80, а также антигенов, характерных для различных подтипов макрофагов: для М1 — CCR7, для М2 — CD163, при этом характеризовали соединительную ткань, располагающуюся между panniculus carnosus и имплантатом и дерму. Исследовали по 20 полей зрения для каждого животного.
Результаты исследования показали, что количество М1 макрофагов в соединительной ткани зоны имплантации порошка ВКМ статистически достоверно больше, как на 1-е, так и на 5-е сутки после введения, по сравнению с контрольной группой. Также было обнаружено увеличение числа М2 макрофагов на 5-е сут в дерме прилежащей кожи в той же группе. Кроме того, было выявлено статистически достоверное увеличение соотношения М1/М2 на 1-е сутки в соединительной ткани, окружающей порошок ВКМ. Количество макрофагов в группе имплантации геля статистически не отличалось от контроля на обоих исследованных сроках.
