Научная статья на тему 'Оценка уровней цитокиноподобных веществ в супернатантах культур бактерий'

Оценка уровней цитокиноподобных веществ в супернатантах культур бактерий Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
175
42
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Зурочка В. А., Зурочка А. В., Дукардт В. В., Зуева Е. Б., Добрынина М. А.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Оценка уровней цитокиноподобных веществ в супернатантах культур бактерий»

«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017

Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya

30-38% по сравнению с контролем. При применении данной комбинации наблюдается выраженный (100%) антиметастатический эффект, т. е. полное отсутствие метастазов у животных, тогда как в контрольной группе они выявлены у 60% мышей в количестве 12 (9 в легких и 3 в селезенке). Торможение роста опухоли сопровождается морфологически регистрируемыми дистрофическими изменениями опухолевых клеток и выраженной лейкоцитарной инфильтрацией. Морфологическое исследование тимуса выявило развитое корковое вещество с плотным расположением тимоцитов, что свидетельствует об активном состоянии Т-клеточного звена иммунитета, которое подтверждается результатами субпопуляционного анализа спленоцитов: содержание Т-клеток было выше контроля (60,33±1,42% против 46,1±2,06%) за счет ТИ. При этом уровень ТИ у мышей данной группы был максимальным среди животных всех групп, составляя 47,9±1,5%, тогда как в других он колебался от 15 до 35%. Все указанные различия статистически достоверны, р < 0,05. По-видимому, стимуляция Х-клеточного звена в данной группе происходит преимущественно под действием Ронколейкина, который обнаруживает аналогичный эффект и при паратуморальном введении в монорежиме. Однако введение одного Ронколейкина не вызывает торможения роста опухоли и только частично ингибирует развитие метастазов. Добавление к комбинации Ронко-лейкин + Ингарон третьего иммуномодулятора Рефнота не приводит к дальнейшей положительной динамике: антиметастатический эффект сохраняется, но составляет 95,4% на фоне незначительного торможения роста меланомы. Сравнение групп, получавших Доксорубицин в монорежиме и Доксорубицин с Ронколейкином, показывает, что Ронколейкин усиливает торможение опухолевого роста как в процессе введения (-27 против -16,2%), так и на момент эвтаназии (-11,55 против +1,9%), но не оказывает значимого влияния на метастазирование в данной комбинации. Иммунологические показатели в комбинации Ронколей-кин + Доксорубицин обнаруживают динамику, аналогичную таковой в других группах, получавших Ронколей-кин (повышение уровня Т-клеток за счет ТИ и снижение В-клеток по сравнению с контролем), в то время как Доксорубицин вызывает депрессию Х-клеточного звена.

Заключение. Проведенные исследования свидетельствуют об антиметастатическом и иммуномодулирую-щем эффекте паратуморального применения комбинации Ронколейкин + Ингарон в эксперименте, а также

0 целесообразности ее использования в лечении онкологических больных. Дальнейший поиск может выявить и другие эффективные сочетания иммунопрепаратов, что позволит оптимизировать цитокинотерапию и уточнить ее роль и место в комплексном лечении злокачественных опухолей, в том числе в комбинации с химиотерапией.

РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОМА В ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА: ВОЗМОЖНОСТИ И ОГРАНИЧЕНИЯ

Зотова А.1, 3, Лопатухина Е.1, 3, Мазуров Д.1, 2 3

1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия

2 ГНЦ«Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Россия

3 Институт биологии гена РАН, Москва, Россия

Программируемые эндонуклеазы вносят разрыв в определенном участке ДНК, который подвергается репарации в клетках по механизму негомологичного со-

единения концов (NHEJ), что, как правило, приводит к нокаутированию гена, или по механизму гомологичной рекомбинации (HDR), если присутствует ДНК-донор, который точно замещает участок поврежденного генома (knock-in). Редактирование генома лимфоидных клеток человека представляет собой сложную задачу из-за низкой трансфекционной способности этих клеток. Дополнительные трудности вносит неэффективная репарация ДНК-разрывов путем HDR. Тем не менее, интерес к редактированию генома лимфоидных клеток не угасает, что связано, прежде всего, с необходимостью лечения различных наследственных иммунодефицитов и ВИЧ-инфекции.

Перед нами стояла задача оценить эффективность и динамику получения нокаута и нокина в линиях T- и B-клеток человека посредством изменения матрицы для репарации ДНК, локусов ДНК-мишеней и типов геномных нуклеаз. Используя нуклеазу, содержащую домены «цинковых пальцев» (ZFN), мы сконструировали клеточные линии Jurkat и CEM с геномом вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), интегрированным в локус AAVS1. При дополнительной трансфекции вспомогательными векторами такие клетки стабильно производят вирусные частицы. Также было показано, что применение как ZFN, так и CRISPR/Cas9 технологии в равной степени эффективно для получения нокаутов в лимфоидных клетках. Однако нами было отмечено значительное снижение on-target активности высокоточной нуклеазы eCas9 1.1, работающей как никаза. Таким образом, для изучения функциональной роли генов в лимфоидных клетках необходимо учитывать баланс между эффективностью нукле-азы в отношении целевого гена и ее off-target (побочной) активностью.

Работа была выполнена при поддержке гранта РНФ «Поиск новых факторов рестрикции ВИЧ-1, ограничивающих репликацию вируса в условиях его межклеточной трансмиссии, путем скрининга библиотеки нокаутов GeCKO» 15-15-00135.

ОЦЕНКА УРОВНЕЙ ЦИТОКИНОПОДОБНЫХ ВЕЩЕСТВ В СУПЕРНАТАНТАХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ

Зурочка А.В.1, 2, Зурочка А.В.1, 2, Дукардт В.В.1, Зуева Е.Б.1, Добрынина М.А.1, Тяпаева Я.В.3, Гриценко В.А.3, 4

1ФГБУН«Институт иммунологии и физиологии» УрО РАН, Екатеринбург, Россия

2 ФГАОУ ВО «Южно-Уральский государственный университет» (Национальный исследовательский университет), Челябинск, Россия

3 ФГБУН«Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза» УрО РАН, Оренбург, Россия

4 ФГБУН «Оренбургский научный центр» УрО РАН, Оренбург, Россия

Введение. Инфицирование тканей макроорганизма бактериальными агентами сопровождается развитием воспалительной реакции, в регуляции которой участвуют различные цитокины, вырабатываемые клетками иммунной системы. В то же время в опытах in vitro нами было показано, что бактерии и супернатанты их бульонных культур при контакте с нейтрофилами существенно влияют на продукцию фагоцитами ци-токинов, причем направленность (стимулирование/ ингибирование) и выраженность этих эффектов зависели от видовой принадлежности микроорганизмов

2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue

Экспериментальные модели Experimental models

(Зурочка А.В. и соавт., 2016). Учитывая выявленное разнообразие модифицирующего действия бактерий и их супернатантов на нейтрофилы, мы предположили, что подобное влияние может быть связано с синтезом самими микроорганизмами ряда цитокинов (цитоки-ноподобных веществ — ЦПВ). Цель работы — проверка данного предположения.

Материалы и методы. В опытах использовали 65 клинических изолятов Staphylococcus aureus (n = 23), коагула-зоотрицательных стафилококков (КОС) — S. haemolyticus и S. epidermidis (n = 14), Enterococcus faecalis и E. faecalis (n = 8), Pseudomonas aeruginosa (n = 8), энтеробактерий — Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli (n = 12), выделенный из ран у больных с синдромом диабетической стопы, из влагалища у женщин с миомой матки, из пустул у новорожденных с пиодермией. Бактерии выращивали в мясопептонном бульоне (МПБ) в течение 24 ч, после чего культуры центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин и отбирали надосадочную жидкость (су-пернатант).

Наличие в супернатантах бактерий цитокинов (ЦПВ) определяли на приборе MAGPIX-100 (США) с использованием тест-системы Multiplex (Luminex, США) для определения 15 цитокинов (G-CSF, GM-CSF, IFNy, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IL-1P, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, MCP-1, MIP-1P, TGF-a); контролем служил МПБ без бактерий. Опыты проводили в двух повтор-ностях; результаты измерений округляли до 0,1 пкг/мл; при регистрации в супернатантах цитокинов в концентрации меньше 3 пкг/мл считали, что в образце ЦПВ отсутствуют. Данные обработаны методами вариационной статистики.

Результаты. Установлено, что в супернатантах бульонных культур бактерий обнаруживаются те или иные ЦПВ, наличие и концентрация которых зависели от видовой/ родовой принадлежности микроорганизмов. Наиболее активными продуцентами ЦПВ оказались штаммы S. aureus, в супернатантах которых присутствовали 13 из 15 тестируемых цитокинов (все, кроме IL-5 и TGF-a); бактерии остальных таксонов в порядке убывания числа продуцируемых ЦПВ распределились в ряд: КОС (7 цитокинов - G-CSF, GM-CSF, IFNy, IL-12p70, IL-17A, IL-1P, MIP-1P), энтерококки (4 - G-CSF, IFNy, IL-12p70, IL-17A), энтеробактерии и псевдомонады (1 — G-CSF). В то же время наблюдалось внутривидовое разнообразие бактерий по наличию и концентрации в супернатан-тах ЦПВ - доля штаммов-продуцентов с учетом их вида и типа ЦПВ колебалась в диапазоне 4,3-83,3%, а уровни варьировали от 3,3 до 239,6 пкг/мл. При этом максимальные (штаммовые и средние) значения концентраций ЦПВ регистрировались у изолятов S. aureus и S. haemolyticus. Следует отметить, что 5 цитокинов (G-CSF, GM-CSF, IFNy, IL-12p70, IL-17A) тестировались в супернатантах у ряда изолятов S. aureus, S. haemolyticus и E. faecalis в относительно высоких концентрациях (> 20 пкг/мл), другие ЦПВ в изученных образцах либо не обнаруживались, либо их уровень был ниже указанного порога.

Заключение. У изученных грамположительных и гра-мотрицательных бактерий в супернатантах бульонных культур выявляется ряд цитокинов (цитокиноподоб-ных веществ - ЦПВ), причем их продукция (наличие и уровень) зависит от таксономической принадлежности микроорганизмов и характеризуется внутривидовой вариабельностью. Наиболее активными продуцентами

ЦПВ являются стафилококки (S. aureus и КОС, в частности S. haemolyticus), которые способны синтезировать 7-13 цитокинов, причем 5 из них (G-CSF, GM-CSF, IFNy, IL-12p70, IL-17A) в относительно высоких концентрациях (> 20 пкг/мл). Учитывая принадлежность указанных цитокинов к провоспалительным и ростовым факторам, нельзя исключить их причастность к развитию начальных этапов воспалительной реакции при инфицировании тканей макроорганизма цитокин-продуцирующими бактериями, в частности путем ранней активации иммуно-компетентных клеток, что требует дальнейшего изучения данного феномена. С другой стороны, необходимо выяснить структурно-молекулярное сходство/различие ЦПВ бактерий с цитокинами макроорганизма, определить их генетическое детерминирование, эволюционное происхождение и роль в биологии прокариотов, а также их участие в формировании патогенного потенциала микроорганизмов.

ВЛИЯНИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА АКТИВНОГО ЦЕНТРА GM-CSF НА ПРОДУКЦИЮ БАКТЕРИЯМИ ЦИТОКИНОПОДОБНЫХ ВЕЩЕСТВ В БУЛЬОННЫХ КУЛЬТУРАХ

Зурочка В.А.1 2, Зурочка А.ВЛ 2, Дукардт В.В.1, Зуева Е.Б.1, Добрынина М.А.1, Тяпаева Я.В.3, Гриценко В.А.3, 4

1ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» УрО РАН, Екатеринбург, Россия

2 ФГАОУВО «Южно-Уральский государственный университет» (Национальный исследовательский университет), Челябинск, Россия

3 ФГБУН «Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза» УрО РАН, Оренбург, Россия

4 ФГБУН «Оренбургский научный центр» УрО РАН, Оренбург, Россия

Введение. В очаге воспаления бактериальные агенты неминуемо вступают во взаимодействие с различными регуляторными молекулами макроорганизма, в том числе цитокинами, которые могут не однозначно влиять на их жизнеспособность и биологические свойства. Так, нами экспериментально показано, что синтетический пептид активного центра GM-CSF оказывал ингиби-рующее действие на репродуктивный потенциал некоторых бактерий (в частности стафилококков) и их био-пленкообразование (Зурочка А.В. и соавт., 2015; Гриценко В.А. и соавт., 2015). В то же время в предварительных опытах нами выявлена способность клинических изо-лятов Staphylococcus aureus и ряда других бактерий экс-кретировать в культуральную среду цитокиноподобные вещества (ЦПВ), с наличием которых, возможно, связано разнонаправленное модифицирующее действие бактерий и их супернатантов на продукцию нейтрофилами широкого спектра цитокинов (Зурочка А.В. и соавт., 2016). Это послужило основанием для изучения влияния синтетического пептида активного центра GM-CSF на продукцию бактериями ЦПВ.

Материалы и методы. В опытах использовали 28 клинических изолятов S. aureus (n = 14), Enterococcus faecalis и E. faecalis (n = 8), энтеробактерий — Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli (n = 6), выделенных из ран у больных с синдромом диабетической стопы, из влагалища у женщин с миомой матки, из пустул у новорожденных с пио-

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.