CC BY
29© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
С.В.Ширшев, И.Л.Масленникова, И.В.Некрасова
ВЛИЯНИЕ СЕКРЕТИРУЕМЫХ МЕТАБОЛИТОВ ESCHERICHIA COLI НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА НА ФОНЕ ДЕЙСТВИЯ ЭСТРИОЛА
Институт экологии и генетики микроорганизмов, Пермь
Цель. Изучить влияние бесклеточных метаболитов Escherichia coli разных фаз развития на фагоцитарную активность нейтрофилов на фоне воздействия гормона беременности
— эстриола (E3). Материалы и методы. Метаболиты E. coli К12 (wt) отбирали в конце фаз адаптации и логарифмического роста путем фильтрации после культивирования при 37оС на LB бульоне. Нейтрофилы гепаринизированной венозной крови здоровых небеременных женщин (фолликулярная фаза, n=8) инкубировали 1 ч с E3 в концентрации 2 нг/мл и 20 нг/мл, затем 30 мин с метаболитами E. coli, средой LB или раствором Хенкса при 37оС. Оценку фагоцитарной активности проводили по ингибированию биолюминесценции E. coli K12 TG1 lux+. Результаты. Экзометаболиты логарифмической фазы роста культуры E. coli ингибировали фагоцитоз нейтрофилов после 40 — 60 мин инкубации, в отличие от метаболитов фазы адаптации при сравнении с LB средой. Культивирование нейтрофилов после гормональной обработки в LB среде, обладающей способностью стимулировать фагоцитоз нейтрофилов по сравнению с раствором Хенкса, не изменяло их фагоцитарной активности. Однако ингибирующее влияние E3 в концентрации 20 нг/мл на фагоцитоз нейтрофилов по сравнению с контролем проявлялось в растворе Хенкса (на 50 — 60 мин) и после воздействия метаболитов фазы адаптации культуры E. coli (на 40 — 60 мин). Заключение. Е3 в концентрации, экстраполированной с его уровня в III триместре беременности, может способствовать снижению противомикробного потенциала нейтрофи-лов на начальных этапах роста патогенных микроорганизмов.
Журн. микробиол. 2014, № 5, С. 65—70
Ключевые слова: Escherichia coli, экзометаболиты, нейтрофилы, фагоцитоз, эстриол, беременность
S.V.Shirshev, I.L.Maslennikova, I.V.Nekrasova
EFFECT OF ESCHERICHIA COLI SECRETED METABOLITES ON FUNCTIONAL ACTIVITY OF HUMAN NEUTROPHILS AGAINST THE BACKGROUND OF ESTRIOL EFFECT
Research Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Perm, Russia
Aim. Study the effect of Escherichia coli acellular metabolites of various phases of development on phagocytic activity of neutrophils against the background of pregnancy hormone effect — estriol (E3). Materials and methods. E. coli K12 (wt) metabolites were selected at the end of adaptation and logarithmic growth phases by filtration after cultivation at 37°C in LB broth. Neutrophils of heparinized venous blood of healthy non-pregnant women (follicular phase, n=8) were incubated for 1 hour with E3 at 2 ng/ml and 20 ng/ml, then 30 minutes with E. coli metabolites, LB medium or Hanks' solution at 37°C. Phagocytic activity evaluation was carried out by inhibition ofbioluminescence of E. coli K12 TG1 lux+. Results. Exometabolites of logarithmic growth phase of E. coli culture inhibited neutrophil phagocytosis after 40 — 60 minutes of incubation in contrast to metabolites of adaptation phase compared with LB medium. Neutrophil cultivation after hormone treatment in LB medium that has the ability to stimulate neutrophil phagocytosis compared with Hanks' solution did not alter their phagocytic activity. However inhibiting effect of E3 at 20 ng/ml on neutrophil phagocytosis compared with control was exhibited in Hanks' solution (at 50
— 60 minutes) and after the effect of E. coli adaptation phase metabolites (at 40 — 60 minutes). Conclusion. E3 at the level extrapolated from its level at III trimester of pregnancy could facilitate the reduction of antimicrobial potential of neutrophils at the early stages of growth of pathogenic microorganisms.
5. ЖМЭИ 5 № 33
65
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 5, P. 65-70
Key words: Escherichia coli, exometabolites, neutrophils, phagocytosis, estriol, pregnancy ВВЕДЕНИЕ
Микробиота человека находится в динамическом взаимодействии с клетками организма хозяина. Изменения в иммунной системе, происходящие в течение беременности, с одной стороны, препятствуют отторжению плода, с другой — приводят к усугублению бактериально-опосредованных заболеваний слизистых матери [10]. Развитие инфекционного процесса в этот период чаще всего обусловлено супрессией функциональной активности фагоцитов бактериальными клетками [12] и (или) продуктами их жизнедеятельности, которые зависят от изменения видового и количественного соотношения микробиоты человека в ходе беременности [19]. Новый гормональный статус в период беременности также определяет состав резидентной вагинальной микробиоты и чувствительность женщины к инфекциям [2, 16].
Эстриол (Е3) синтезируется только во время беременности, т. к. является продуктом фетоплацентарной единицы, а его концентрация служит важным индикатором состояния плода [18]. Данный гормон способен оказывать иммуномодулирующее действие на функции нейтрофилов [7], т.к. эти клетки экспрессируют на своей поверхности рецепторы для эстрогенов [23].
Escherichia coli является комменсалом желудочно-кишечного тракта человека [14]. Кроме этого, при ряде патологий, таких как инфекции урогенитального тракта (пиелонефрит, бактериурия), в 70% случаев первопричиной является присутствие представителей вида E. coli [9]. Наличие данных бактерий в составе вагинальной микро-биоты сопровождается повышенным риском прерывания беременности на ранних сроках [13]. Известно, что E. coli и их экзометаболиты [15, 21] модулируют функциональную активность нейтрофилов. Кроме того, E. coli, в зависимости от фазы роста культуры, способны избегать лизирующего действия компонентов комплемента [25]. В то же время, функциональная активность нейтрофилов, связанная с фагоцитозом, непосредственно зависит от гормонального фона, изменяющегося в процессе развития беременности [5].
Цель работы — изучить влияние экзометаболитов E. coli разных фаз развития культуры на фагоцитарную активность нейтрофилов, подвергнутых предварительному воздействию физиологических концентраций E3.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штамм E. coli K12 (wt) использовали для получения внеклеточных метаболитов. Метаболиты отбирали в конце фаз адаптации (С1) и логарифмического роста (С2) культуры E. coli К12 (wt) путем фильтрации (диаметр пор 0,2 мкм, «Хийу Калур», Эстония) после культивирования при 37°С и 150 об/мин на LB бульоне (триптон — 10 г; дрожжевой экстракт — 5 г; NaCl — 10 г на 1 л среды). Твердая LB среда содержала 1,5% агар.
Чувствительность клеток E. coli K12 к 30% H2O2 в присутствии экзометаболитов C1 и С2 определяли диско-диффузионным методом на LB-агаре (10 мкл H2O2 на диск с диаметром 12 мм). 100 мкл культуры E. coli K12 на разных фазах развития засевали на чашки Петри с LB-агаром. Часть клеток E. coli отмывали от экзометаболитов 0,89% NaCl. Через 24 ч определяли зону ингибирования роста бактерий.
Нейтрофилы выделяли из гепаринизированной венозной крови здоровых небеременных женщин (фолликулярная фаза, n=8) центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 и 1,112 г/мл). Нейтрофилы (106 кл/мл) инкубировали 1 ч при 37°С с Е3 в концентрации 2 нг/мл и 20 нг/мл, соответствующих I и III триместрам беременности [17]. Затем нейтрофилы отмывали от гормона, ресу-спендировали в растворе Хенкса, исходной питательной среде для бактерий (LB), супернатантах фаз адаптации и логарифмического роста культуры E. coli и выдерживали 30 мин при 37°C.
Фагоцитарная система состояла из суспензии нейтрофилов (106 кл/мл), регидра-тированного сенсора E. coli lux+ (107 кл/мл) c lux-опероном Photorhabdus luminescens [1], опсонизированного пулом сывороток (10%). Уровень фагоцитоза оценивали по снижению биолюминесценции E. coli lux+, поглощаемых нейтрофилами. Оценку биолюминесценции проводили на многофункциональном планшетном ридере (Synergy H1, США) через каждые 10 мин в течение часа. Данные представлены в виде индекса фагоцитарной активности (ИФА), который вычисляли по формуле: ИФА=(Х1-Х2)/Х1 х100%, где Xi, — интенсивность исходного свечения сенсора фагоцитарной системы, X2 — свечение в определенный момент времени [6]. Результаты обработаны по парному t-критерию Стьюдента с использованием программы Excel.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Первоначально оценивали способность экзометаболитов E. coli повышать выживаемость бактерий при воздействии H2O2. Установлено, что подобной активностью обладают только метаболиты E. coli логарифмической фазы роста (C2). Удаление супернатантов, содержащих С2, приводит к снижению выживаемости бактерий при действии H2O2. Таким образом, экзометаболиты логарифмической фазы роста оказывают протективный эффект по отношению к E. coli, что косвенно говорит об их способности влиять на фагоцитарную активность лейкоцитов, сопровождаемую кислородным взрывом.
На следующем этапе эксперимента оценивали способность метаболитов разных фаз роста культуры E. coli влиять на фагоцитоз фракционированных нейтрофилов. Установлено, что экзометаболиты С1 не влияют на фагоцитарную активность нейтрофилов, а С2 достоверно ингибируют фагоцитоз на 40 — 60 мин наблюдения по сравнению с исходной питательной средой LB (рис. 1). Необходимо отметить, что
среда LB усиливает фагоцитоз нейтрофилов из-за наличия в ней растворимого ß-глюкана, который активирует клетки врожденного иммунитета [20]. По-видимому, выявленное подавление фагоцитоза супернатантами более поздних фаз развития E. coli по сравнению с LB может быть связано с содержанием в их составе белков и (или) аутоиндукторов. Известно, что белок теплового шока (Hsp) 70 эука-риот, гомологичный белку DnaK E. coli, блокирует кислородный взрыв нейтро-филов, индуцированный липополисаха-ридом или липотейхоевой кислотой, запускающих внутриклеточный сигналинг, приводящий к фосфорилированию мито-ген-активируемых протеинкиназ [26]. Поскольку синтез DnaK увеличивается в ответ на истощение питательных веществ [11], что характерно для фазы С2 (переход бактериальной культуры из экспоненциальной в стационарную фазу роста), можно полагать, что снижение фагоцитарной активности обусловлено бактериальными гомологами Hsp 70, а также цитотоксическим действием производных алкилоксибензолов [4], присутствующих в экзометаболитах фазы С2 [3].
В период физиологически протекаю-
Рис. 1. Влияние бесклеточных метаболитов разных фаз развития культуры E. coli К12 на фагоцитарную активность нейтрофилов.
1 — раствор Хенкса, 2 — среда LB, 3 — метаболиты фазы адаптации (С1), 4 — метаболиты экспоненциальной фазы (С2). * p<0,05 между С2 и средой LB , л p<0,05 между средой LB и раствором Хенкса.
Рис. 2. Влияние E3 на фагоцитарную активность при действии метаболитов E. coli.
а — Среда LB, б — метаболиты фазы адаптации (С1), в — метаболиты логарифмической фазы (С2). * p<0,05 по сравнению с контролем; 2 и 20 нг/мл — концентрация E3.
щей беременности происходит гормональная модуляция функциональной активности нейтрофилов. Предварительная обработка нейтрофилов Е3 в концентрации, соответствующей III триместру беременности, достоверно снижает фагоцитоз нейтрофилов на 50 — 60 мин, что подтверждает полученные нами ранее данные [7].
Последовательное воздействие E3 и супернатантов E. coli, моделирующее особенности фагоцитоза бактерий у беременных, показало, что на фоне высокой концентрации E3 (20 нг/мл) проявилось ингибирующее влияние ранних экзометаболитов С1, сходное по эффекту с воздействием С2. Следует отметить, что в исходной питательной среде для бактерий гормональная модуляции нейтрофилов нивелировалась (рис. 2).
ОБСУЖДЕНИЕ
Выявленный эффект E3 можно объяснить синергичным действием низкомолекулярных бактериальных аутоиндукторов, присутствующих в экзометаболитах С1 [8]. Речь идет, прежде всего, об аутоиндукторе 3 (AI-3) бактерий, который по химической природе сходен с катехоламинами млекопитающих [22]. Ранее было показано, что в составе метаболитов фазы адаптации E. coli K-12 на среде LB концентрация норадре-налина, дофамина и доксифенилаланина (предшественника катехоламинов) значительно превышает физиологические концентрации в периферической крови (250 и 800 нМ, соответственно), в отличие от метаболитов экспоненциальной фазы роста (С2) [8]. Известно, что катехоламины могут снижать активность фагоцитов только в высоких концентрациях [24], поэтому их действие может проявляться исключительно в ранних супернатантах (С1). Однако для нейтрофилов их эффект не достаточен. По-видимому, Е3 снижает порог чувствительности нейтрофилов к депрессивному действию AI-3, реализуя одновременно собственное угнетающее действие. Таким образом, нейтрофилы, находящиеся под воздействием Е3 в III триместре беременности, более уязвимы для экзометаболитов С1, что, по-видимому, может определять повышенную восприимчивость женщин к бактериальной инвазии в ранние сроки беременности.
Работа поддержана программой Президиума РАНМКБ 12-П-4-1017.
ЛИТЕРАТУРА
1. Данилов В.С., Зарубина А.П., Ерошникова Г.Е. и др. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий. Вестник МГУ. Серия 16. Биология. 2002, 3: 20-24.
2. Бебнева Т.Н., Летуновская А.Б. Роль эстриола в поддержании биоценоза влагалища. Гинекология. 2011, 2: 22-26.
3. Мулюкин А.Л. Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий: свойства, разнообразие, диагностика. Автореф. дисс. д.б.н. М., 2010.
4. Свиридова Т.Г., Слободчикова С.В., Дерябин Д.Г. и др. Влияние алкилоксибензолов на поглотительную и секреторную функции нейтрофилов периферической крови человека. Иммунология. 2013, 2: 84-88.
5. Ширшев С.В. Механизмы иммуноэндокринного контроля процессов репродукции. Екатеринбург, УрО РАН, 2002.
6. Ширшев С.В., Куклина Е.М., Заморина С.А. и др. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека по степени гашения биолюминесценции. Патент РФ № 2292553 от 21.01.2007. Бюлл. № 3.
7. Ширшев С.В., Некрасова И.В. Влияние женских половых стероидных гормонов на микробицидную активность нейтрофилов. Пробл. эндокринологии. 2010, 56 (1): 2630.
8. Шишов В.А., Кировская Т.А., Кудрин В.С. и др. Нейромедиаторные амины, их предшественники и продукты окисления в биомассе и супернатанте культуры Escherichia coli К-12. Прикл. биохим. микробиол. 2009, 5: 1-5.
9. Artero A., Alberola J., Eiros J.M. et al. Pyelonephritis in pregnancy. How adequate is empirical treatment? Rev. Esp. Quimioter. 2013, 26 (1): 30-33.
10. Beigi R.H., Yudin M.H., Cosentino L. et al. Cytokines, pregnancy, and bacterial vaginosis: comparison of levels of cervical cytokines in pregnant and nonpregnant women with bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 2007, 196: 1355-1360.
11. Blum P., Ory J., Bauernfeind J. et al. Physiological consequences of DnaK and DnaJ overproduction in Escherichia coli. J Bacteriol. 1992, 174 (22): 7436-7444.
12. Boll E.J., Struve C., Sander A. et al. The fimbriae of enteroaggregative Escherichia coli induce epithelial inflammation in vitro and in a human intestinal xenograft model. J. Infect. Dis. 2012, 206 (5): 714-722.
13. Donders G.G., Van Calsteren K., Bellen G. et al Predictive value for preterm birth of abnormal vaginal flora, bacterial vaginosis and aerobic vaginitis during the first trimester of pregnancy. BJOG. 2009, 116 (10): 1315-1324.
14. Hao W.L., Lee Y.K. Microflora ofthe gastrointestinal tract: a rewire. Methods Mol. Biol. 2004, 268: 491-502.
15. Hofman P., Le Negrate G., Mograbi B. et al. Escherichia coli cytotoxic necrotizing factor-1 (CNF-1) increases the adherence to epithelia and the oxidative burst of human polymorphonuclear leukocytes but decreases bacteria phagocytosis. J. Leukoc. Biol. 2000, 68 (4): 522528.
16. Hyman R.W., Herndon C.N., Jiang H. et al. The dynamics of the vaginal microbiome during infertility therapy with in vitro fertilization-embryo transfer. J. Assist. Reprod. Genet. 2012, 29 (2): 105-115.
17. Kase N.G., Reyniak J.V. Endocrinology of pregnancy. Mount. Sinai. J. Med. 1985, 52: 1134.
18. Kim S.Y, Kim S.K., Lee J.S. et al. The prediction adverse pregnancy outcome using low unconjugated estriol in the second trimester ofpregnancy without risk of Down's syndrome. Yonsei Med. 2000, 41 (2): 226-229.
19. Koren O., Goodrich J.K., Cullender T.C. et al. Host remodeling of the gut microbiome and metabolic changes during pregnancy. Cell. 2012, 150 (3): 470-480.
20. Lee J.N., Lee D.Y., Ji I.H. et al. Purification of soluble beta-glucan with immune-enhancing activity from the cell wall of yeast. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, 65 (4): 837-841.
21. Loughman J.A., Hunstad D.A. Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria. Microbes Infect. 2011, 13(6): 555-565.
22. Sperandio V., Torres A.G., Jarvis B. et al. Bacteria-host communication: the language of hormones. PNAS. 2003, 100 (15): 8951-8956.
23. Stefano G.B., Prevot V., Beauvillain J.C. et al. Estradiol coupling to human monocyte nitric
oxide release is dependent on intracellular calcium transients: evidence for an estrogen surface receptor. J. Immunol. 1999, 163 (7): 3758-3763.
24. Wenisch C., Parschalk B., Weiss A. et al. High-dose catecholamine treatment decreases polymorphonuclear leukocyte phagocytic capacity and reactive oxygen production. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1996, 3 (4): 423-428.
25. Wooster D.G., Maruvada R., Blom A.M. et al. Logarithmic phase Escherichia coli K1 efficiently avoids serum killing by promoting C4bp-mediated C3b and C4b degradation. Immunology. 2006, 117 (4): 482-493.
26. Yurinskaya M., Evgen'ev M.B., Antonova O.Yu. et al. Exogenous heat shock protein HSP70 suppresses bacterial pathogen-induced activation of human neutrophils. Doklady Akademii Nauk. 2010, 435 (3): 407-410.
Поступила 27.02.14
Контактная информация: Масленникова Ирина Леонидовна,
614081, Пермь, ул. Голева, 13, р.т. (342)280-84-31
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Н.Н.Вольский, О.М.Перминова, О.П.Колесникова
СДВИГ та^/ГШ-БАЛАНСА ПРИ ОСТРОЙ РЕАКЦИИ «ТРАНСПЛАНТАТ ПРОТИВ ХОЗЯИНА», РАЗВИВАЮЩЕЙСЯ НА ФОНЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПЕРЛИ-ПИДЕМИИ
Институт клинической иммунологии, Новосибирск
Цель. Оценить влияние экспериментальной гиперлипидемии на интенсивность развития острой реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) у мышей. Материалы и методы. В качестве лабораторной модели острой РТПХ использовали полуаллогенную систему C57B1/6 ^ □ (C57B1/6 x DBA/2)F1. Экспериментальную гиперлипидемию у мышей-реципиентов вызывали многократным введением полоксамера 407. Результаты. Смертность в группе мышей с острой РТПХ, развивающейся на фоне предшествующей гиперлипидемии, была существенно выше (70% на 50 сутки развития РТПХ), чем в контрольной группе с острой РТПХ (смертность 50% на 50 сутки). Такое воздействие на степень тяжести острой РТПХ, индуцированной в условиях гиперлипидемии, подтверждается более выраженной деструкцией тимуса у мышей в группе с предварительно вызванной гипер-липидемией. Заключение. Предшествующая гиперлипидемия, вызванная введением полоксамера 407, сдвигает ТЫ/ТИ2-баланс в развитии острой РТПХ в сторону Th1. Обсуждаются механизмы этого эффекта и возможное участие ядерных рецепторов LXR в регуляции иммунных реакций.
Журн, микробиол., 2014, № 5, С. 70—77
Ключевые слова: гиперлипидемия, ТЫ/^2-баланс, острая РТПХ, ядерные рецепторы LXR
N.N.Volsky, O.M.Perminova, O.P.Kolesnikova
TH1/2-BALANCE SHIFT DURING ACUTE GRAFT-VERSUS-HOST REACTION DEVELOPING AGAINST THE BACKGROUND OF EXPERIMENTAL HYPERLIPIDEMIA
Institute of Clinical Immunology, Novosibirsk, Russia
Aim. Evaluate the effect of experimental hyperlipidemia on the intensity of development of acute graft-versus-host reaction (GVHR) in mice. Materials and methods. Half-allogenic system C57Bl/6 (C57Bl/6 x DBA/2)F1 was used as a laboratory model of acute GVHR. Experimental hyperlipidemia in mice-recipients was induced by repeated administration of poloxamer 407.
