CC BY
77
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
указанным фенотипом над аналогами, сильно экспрессирующими CD49d, на протяжении всего периода наблюдения, то в лимфатических узлах CD49dы-варианг центральных Т-клеток памяти вообще на порядок ниже CD49d1o-варианта даже у контрольных мышей (см. рис. 6). Следует оговориться, что роль уровня экспрессии cD49d как маркера истинных и образующихся в результате конверсии фенотипа центральных Т-клеток памяти (т.е. суррогатных) недостаточно строго обоснована [14]. Однако при отсутствии других маркерных различий между названными вариантами клеток нам остается воспользоваться этим критерием.
Таким образом, результаты анализа спектра наивных Т-клеток/Т-клеток памяти в популяции Т-лимфоцитов регенерирующих лимфоидных органов свидетельствуют о высокой эффективности восстановления Т-клеток памяти и неполноценности этого процесса для наивных Т-клеток. Однако, по всей вероятности, значительный (если не основной) вклад в восстановление Т-клеток памяти (по крайней мере их центральной фракции) вносит не их пролиферация, а формирование за счет конверсии фенотипа пролиферирующих наивных Т-клеток.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований РАН; грант 11-04-01741-а.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ярилин А.А., Полушкина Э.Ф. Радиационное повреждение и восстановление Т-лимфоцитов. II. Динамика восстанолвения субпопуляций Т-клеток. Радиобиология. 1981; 21(2): 193-7. 10. Митин А.Н., Комогорова В.В., ЛитвинаМ.М., Шевелев С.В., Шарова Н.И., Ярилин А.А. Динамика субпопуляций тимо-цитов при регенерации тимуса. Иммунология. 2012; 33(6): 297-303.
REFERENCES
1. Yarilin A.A., Polushkina E.F. Irradiation damage and restoration of T lymphocytes. II. Dynamics of restoration of T-cells subpop-ulations.Radiobiologiya. 1981; 21: 193-7 (in Russian).
2. Andreson R.E., Warner N.L. Ionizing radiation and the immune response. Adv. Immunol. 1976; 24: 215-335.
3. Goldrath A.W., Bevan M.J. Low-affinity ligands for the TCR drive proliferation of mature CD8+ T cells in lymphopenic hosts. Immunity. 1999; 11: 183-90.
4. Mahajan VS., Leskov I.B., Chen J.Z. Homeostasis of T cell diversity. Cell. Mol. Immunol. 2005; 2: 1-10.
5. WilliamsK., Hakim F.T., GressR.E. T Cell Immune Reconstitution Following Lymphodepletion. Semin Immunol. 2007; 19: 318-30.
6. Ge Q., Hu H., Eisen H.N., Chen J. Different contributions of thy-mopoiesis and homeostasis-driven proliferation to the reconstitution of naive and memory T cell compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99: 2989-94.
7. Cho B.K., Rao V.P., Ge Q., Eisen H.N., Chen J. Homeostasis-stimulated proliferation drives naive T cells to differentiate directly into memory T cells. J. Exp. Med. 2000; 192: 549-56.
8. Goldrath A.W., Bogatzki L.Y., Bevan M.J. Naive T cells transiently acquire a memory-like phenotype during homeostasis driven proliferation. J. Exp. Med. 2000; 192: 557-64.
9. Gleeson P.A., Toh B.H., van Driel I.R., Organ-specific autoimmunity induced by lymphopenia. Immunol. Rev. 1996; 149: 97-125.
10. Mitin A.N., Komogorova V.V., Litvina M.M., Shevelev S.V., Sharova N.I., Yarilin A.A. Dynamics of thymocytes subpopulations during thymus regeneratin. Immunologiya. 2012; 33: 172-6 (in Russian).
11. Sprent J., Cho J.-H., Boyman O., Surh C.D. T cell homeostasis. Immunology and Cell Biology. 2008; 86: 312-9.
12. Sallusto, F., Geginat, J., Lanzavecchia, A., Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance. Annu. Rev. Immunol. 2004; 22: 745-63.
13. Sprent J., Surh C.D. Normal T cell homeostasis: the conversion of naive cells into memory-phenotype cells. Nature. Immunology. 2011; 12: 478-84.
14. Haluszczak C., Akue F.D., Hamilton S.E. et al. The antigen-specifi c CD8 + T cell repertoire in unimmunized mice includes memory phenotype cells bearing markers of homeostatic expansion. J. Exp. Med. 2009; 206: 435-48.
Поступила 18.07.13
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 612.018.2.063:612.112.95]:618.2
О.Л. Горбунова, С.В. Ширшев, С.А. Заморина
ВЛИЯНИЕ КИССПЕПТИНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОЦИТОВ
Лаборатория иммунорегуляции ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, 614081, г. Пермь, ул. голева, 13; тел. (342)2808431, факс (342)2809211; e-mail: [email protected]
Исследовано влияние недавно открытого гормона кисспептина, который детектируется в периферической крови только в период беременности, на функциональную активность моноцитов. Выявлено, что кисспептин в концентрации, соответствующей III триместру беременности, стимулирует фагоцитарную активность моноцитов и во всех исследуемых концентрациях повышает продукцию активных форм кислорода в реакции спонтанной и стимулированной люминолзависимой хемилюминесценции. Показано, что кисспептин в концентрации, соответствующей II триместру беременности, понижает активность внутриклеточной миелопероксидазы (МПО) моноцитов, повышая при этом активность секреторной МПО и липополисахарида индуцированной индоламин-2,3-диоксигеназы. Таким образом, впервые показано, что ранее не учитываемый гормон кисспептин является важным регулятором функций моноцитов во время беременности.
Ключевые слова: кисспептин, моноциты, фагоцитоз, люминолзависимая хемилюминесценция, миелопероксида-за, индоламин-2,3-диоксигеназа
O.L. Gorbunova, S.V Shirshev, S.A. Zamorina
KISSPEPTIN EFFECT ON MONOCYTE FUNCTIONAL ACTIVITY
- 247 -
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2013
Effect of recently opened hormone kisspeptin that is detected in peripheral blood only in pregnancy was analyzed against the monocyte functional activity. It was revealed that kisspeptin in concentration corresponding to III trimester of pregnancy promoted the phagocyte activity of monocytes and in all of concentrations under study favored the increase in reactive oxygen production in spontaneous and stimulated luminol-dependent chemiluminescence. It was demonstrated that kisspeptin in concentration similar to that in II trimester of pregnancy lowered the activity of intracellular myeloperoxidase (MPO) of monocytes while elevating the activity of secretory MPO and lipopolysaccharide induced indolamin-2,3-dioxygenase. Thus, it is originally shown that previously neglected hormone - kisspeptin is an essential regulator of monocyte functioning during pregnancy.
Key words: kisspeptin, monocytes, phagocytosis, luminol-dependent chemiluminescence, myeloperoxidase, indolamin-2,3-dioxygenase
Кисспептины образуют семейство пептидов, производных от продукта первичной трансляции гена KiSS-1, и продуцируются нейронами, локализованными в ядрах гипоталамуса. Кисспептины, вырабатываемые в головном мозге, стимулируют высвобождение гонадотропин-рилизинг-гормона, что, в свою очередь, индуцирует выброс гонадотропных гормонов гипофиза [16, 17].
В плазме крови у мужчин и небеременных женщин уровень кисспептина практически не детектируется. Наиболее значительное повышение концентрации кисспептина наблюдают только при беременности. Установлено, что источником такого высокого уровня циркулирующего кисспептина является плацента [19]. Рецептор кисспептина (KiSS-1R) относится к большому семейству трансмембранных рецепторов и сопряжен с гетеротримерным G-белком, в состав которого входит а -субъединица, активирующая фосфолипазу c (PLc) [18, 22]. Специфические мембранные рецепторы кисспепти-на обнаружены на клетках иммунной системы, в том числе и на моноцитах [20]. С учетом того, что кисспептин появляется в циркуляции преимущественно в период беременности, он способен оказывать системное влияние на клетки иммунной системы только в этот период.
Процесс беременности от оплодотворения до рождения ребенка можно назвать феноменом естественной аллотрансплантации. Однако при физиологически протекающей беременности отторжения генетически чужеродного трансплантата не происходит [6]. В период беременности супрессия адаптивного иммунного ответа матери компенсируется активацией системы естественного иммунитета. Установлено, что главную роль в обеспечении выживания плода играют клетки врожденного иммунитета, основными эффекторами среди которых являются моноциты/макрофаги [7, 9]. Моно-циты/макрофаги осуществляют клиренсную функцию, фагоцитируя патогены, клеточный детрит и апоптотические тельца [6]. Более того, при беременности моноциты и их потомки - дендритные клетки определяют вид иммунного реагирования, усиливая при определенных условиях активность Т-лимфоцитов хелперов 2-го типа, определяющих трофическую функцию иммунной системы матери в отношении плода [7]. С учетом вышеизложенного изучение регуляции функциональной активности моноцитов новым гормоном кисспептином весьма актуально.
Цель работы - оценка влияния кисспептина в концентрациях, сопоставимых с уровнем гормона в разных триместрах беременности, на функциональную активность моноцитов периферической крови женщин.
Материалы и методы. В работе использовали фракционированную суспензию мононуклеарных клеток периферической крови (МПК) 10 здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста (от 23 до 32 лет). Периферическую кровь забирали из кубитальной вены в фолликулярную фазу менструального цикла (5-11-е сутки), поскольку экспрессия KiSS-1R имеет максимум в проэструс [13]. Кисспептин (кисспептин-54, Metastin, Synthetic, CALBIOCHEM, США) использовали в физиологических концентрациях, соответствующих его уровню в периферической крови в I, II и III триместрах беременности, - 1,3, 4,6 и 9,6 пМ/л соответственно [19]. Мононуклеарные клетки выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/ см3). Полученную суспензию после двойной отмывки средой
199 помещали на чашки Петри с 5% эмбриональной телячьей сывороткой и инкубировали 45 мин при 37°С, затем адгезированные моноциты снимали механическим способом, дважды отмывали и стабилизировали инкубированием в течение 45 мин при 4°С [3]. Чистота выделения моноцитов, оцениваемая с использованием моноклональных антител к CD14 (Primary Anti-Human CD14, ICN Ph., США), составляла 78-85%. Жизнеспособность фракционированных моноцитов определяли в тесте с эозином, что составляло 95-98%. Для оценки функциональной активности моноциты (5-106/мл) инкубировали с кисспептином в течение 1 ч при 37°С. В контрольные пробы вместо гормона вносили официналь-ный растворитель (0,9% NaCl). После инкубации с гормоном определяли фагоцитарную активность моноцитов, продукцию ими активных форм кислорода (АФК) в тесте люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ), активность секреторной (с) и внутриклеточной (в) миелопероксидазы (МПО), а также активность индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO).
Фагоцитарную активность моноцитов оценивали по поглощению бактерий люминесцентного генно-инженерного штамма E.coli lux+ [5]. E. coli lux+, несущих lux-оперон морской люминесцентной бактерии V. fischeri («Эколюм-5»), любезно предоставлен В.С. Даниловым [1]. Принцип метода заключается в том, что бактерии E. coli lux+ обладают способностью к биолюминесценции, которая в процессе фагоцитоза снижается прямо пропорционально их количеству в реакционной смеси, что подтверждают высевы культуры E. coli lux+ на среду Эндо после контакта бактерий с моноцитами периферической крови (рис. 1). Процесс определения фагоцитарной активности состоял из следующих этапов: на первом этапе готовую суспензию бактерий (180 мкл, 5-106 / мл) вносили в лунки 96-луночного планшета для люминоска-на (Microlitetm1, Финляндия) инкубировали при 37°С в течение 3-5 мин и снимали фоновый уровень свечения бактерий. На втором этапе вносили обогащенную моноцитами клеточную культуру с 10% аутоплазмой (соотношение моноцит/ бактерия 1/10). На третьем этапе измеряли степень гашения биолюминесценции в течение 30 мин, регистрируя показатели гашения биолюминесценции каждые 10 мин. Поскольку интенсивность свечения можно фиксировать различными приборами в разных единицах измерения (RUL, имп/мин) ввели индекс фагоцитарной активности (ИФА) клеток, отражающий процент гашения биолюминесценции по сравнению с исходным уровнем по формуле: ИФА=((Х(-Х2)/Х()^100, где Х1 - интенсивность биолюминесценции контрольной пробы, Х2 - интенсивность биолюминесценции опытной пробы [5]. В данной работе измерение производили в динамике процесса на люминометре Luminoskan Ascent (Thermo electron corporation, Финляндия). Необходимо отметить, что метод определения фагоцитоза с использованием E. coli lux+ хорошо известен и применяется как в нашей стране [3], так и за рубежом [10].
Продукцию АФК оценивали в реакции ЛЗХЛ [14]. Измерение данных показателей проводили с использованием люминометра Luminoskan Ascent (Thermo electron corporation, Финляндия). Для этого в лунку плоскодонного планшета вносили 180 мкл раствора, содержащего 110 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, 2,5 MgCl2, 5 мМ глюкозы и 104 М люминола (pH 7,4). После инкубации среды для хемилюминесценции в течение 3-5 мин при 37°С и замера фонового свечения добав-
- 248 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
а б в
Рис. 1. Изменение интенсивности (в имп/с) биолюминесценции (а), ИФА (в %) (б) и количества (• 105 кл/мл) КОЕ E. coli lux (в) в клеточной культуре моноцитов в результате поглощения E. coli lux+.
Здесь и на рис. 2: по оси абсцисс - время (в мин). * - рассчитанный процент падения биолюминесценции и КОЕ в контрольных точках (0, 10, 30 мин); ** - свечение оценивали на приборе "Биотокс-6".
Контроль ■ Кисспептин 1,3 пМ/л
Кисспептин 4,6 пМ/л —Кисспептин 9,6 пМ/л
Рис. 2. Влияние уровня кисспептина на фагоцитарную активность моноцитов периферической крови.
Рис. 3. Влияние уровня киссептина на модуляцию активности IDO. По оси ординат - концентрация (в мкМ) кинуренина; по оси абсцисс - группа исследования: 1 - контроль; 2 - ЛПС; 3 - киссептин 1,3 пМ/л + ЛПС; 4 - киссептин 4,6 пМ/л + ЛПС; 5 - киссептин 9,6 пМ/л + ЛПС.
# - достоверные (р < 0,05) по f-критерию Стьюдента различия с уровнем ЛПС.
По оси ординат - ИФА ( в%). Здесь и на рис. 3: * - достоверные (р < 0,05) по f-критерию Стьюдента различия с контролем гормона.
ляли 20 мкл клеточной суспензии (5 - 106/мл), предварительно инкубированной с кисспептином, и измеряли интенсивность спонтанной хемилюминесценции. Затем в кювету вносили 20 мкл опсонизированных бактерий E.coli штамма К-12 и фиксировали интенсивность стимулированной хемилюминесценции до того момента, когда, пройдя максимум, показатель снизится на 2/3. Реакцию оценивали в течение 30 мин, производя замеры каждые 10 мин. Результаты выражали в относительных световых единицах (related light units, RLU).
Активность сМПО в клеточных супернатантах культур моноцитов тестировали спектрофотометрическим методом [4]. Для этого 0,05 мл клеточного супернатанта помещали в лунки плоскодонных 96-луночных планшетов для иммунных реакций, затем вносили 0,10 мл субстратной смеси, состоящей из 0,04% ортофенилендиамина и 0,014% Н2О2 на фосфат-цитратном буфере (рН 5,0). По истечении 10-минутной инкубации при комнатной температуре реакция останавливалась 0,10 мл 10% H2SO4.
Интенсивность оптической плотности фиксировали в многоканальном спектрофотометре Anthos HMTL III (Labtec Instruments, Австрия) при длине волны 492 нм, в качестве бланка использовали раствор ортофенилдиамина и 10% H2SO4 без супернатанта. Для тестирования изменения активности фермента при
стимуляции клеток в ряде исследований пробы индуцировали опсонизированным зимозаном (3 мг/мл) и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. По аналогичной методике определяли активность вМПО, предварительно лизируя моноциты дистиллированной водой [4]. Результаты выражали в единицах оптической плотности (E).
Активность IDO в МПК определяли спектрофотометрически по изменению концентрации кинуренина - первого стабильного метаболита пути распада триптофана [12]. Для этого МПК, стимулированные липополисахаридом (ЛПС) (100 нг/ мл, Sigma, США), культивировали в растворе Хенкса, содержащем 100 мкМ триптофана (Sigma, США), в течение 4 ч. Затем к 100 мкл клеточного супернатанта добавляли 50 мкл 30% трихлоруксусной кислоты, встряхивали и центрифугировали в течение 5 мин. Затем в лунки 96-луночного планшета вносили
Влияние уровня кисспептина на реакцию ЛЗХЛ и модуляцию активности сМПО и вМПО в кратковременных культурах моноцитов
Гормональное воздействие Чис- ло проб Спонтанная ЛЗХЛ, RLU Стимулированная ЛЗХЛ, RLU Спонтанная активность сМПО, E Стимулированная активность сМПО, E Стимулированная активность вМПО, E
Контроль 10 0,027±0,005 0,055±0,007 0,362±0,06 0,454±0,115 0,749±0,268
Кисспептин:
1,3 пМ/л 10 0,042±0,004* 0,090±0,009* 0,364±0,05 0,462±0,164 0,719±0,295
4,6 пМ/л 10 0,037±0,005* 0,085±0,005* 0,556±0,07* 0,529±0,169* 0,702±0,292*
9,6 пМ/л 10 0,040±0,007* 0,076±0,004* 0,591±0,06* 0,453±0,161 0,752±0,273
Примечание. * - достоверные (р<0,05) по f-критерию Стьюдента различия с соответствующим контролем гормона.
- 249 -
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2013
75 мкл супернатанта, смешивали с равным объемом реактива Эрлиха. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на многоканальном спектрофотометре.
Учитывая, что во всех тестах выборочное распределение было нормальным, достоверность различий между средними величинами оценивали согласно парному /-критерию Стью-дента.
Результаты и обсуждение. При исследовании фагоцитарной активности моноцитов установили, что часовая инкубация обогащенной моноцитами клеточной суспензии с кисспептином в концентрации, соответствующей III триместру беременности (9,6 пМ/л), достоверно стимулирует процесс поглощения опсонизированных E.coli lux+ на 15—30-й минуте регистрации фагоцитоза (рис. 2). В концентрациях, отражающих уровень гормона в I—II триместры, гормон был не эффективен.
Активные кислородные метаболиты являются важными факторами бактерицидности моноцитов, не только обеспечивающими антимикробную резистентность организма, но и участвующими в процессах ремоделировании тканей при физиологически протекающей беременности [7, 11]. Процессы генерации АФК фагоцитами являются результатом активации НАДФН-оксидазы и МПО, которые, как и фагоцитоз, регулируются сигналами, повышающими в конечном счете уровень внутриклеточного Са2+ (Ca2+.) [8].
При исследовании влияния кисспептина на процессы генерации АФК моноцитами в тесте ЛЗХЛ установили, что гормон вне зависимости от концентрации достоверно стимулирует как спонтанную, так и стимулированную реакцию (см. таблицу). Аналогичный эффект кисспептин дает и в отношении стимулированной сМПО, однако в отличие от ЛЗХЛ-стимулирующего действия этот эффект реализуется гормоном только в концентрации, соответствующей его уровню во II триместре беременности (4,6 пМ/л). Одновременно кисспептин в этой же концентрации угнетает активность вМПО (см. таблицу). С учетом того, что кисспептин приводит к повышению уровня (Ca2+). [18], такое действие гормона можно объяснить стимуляцией процессов секреции гранул, содержащих МПО. В ходе исследования также выявили увеличение спонтанной активности сМПО под действием кисспептина в дозах, характерных для таковых во II и III триместрах беременности, что согласуется с имеющимися в литературе данными о росте активности МПО в ходе гестации [21].
Таким образом, можно предположить, что взаимодействие кисспептина с KiSS-1R, которое приводит к активации PLC и дальнейшему образованию вторичных посредников, диацилглицерола и инозитол-1,4,5-трифосфата, стимулирующих протеинкиназу С, и повышению уровня Ca2+. соответственно [18], определяет активацию процессов поглощения опсонизированного объекта с последующей сборкой НАДФН-оксидазного комплекса и дегрануляцией МПО [15].
Моноциты являются не только эффекторными клетками, но и выполняют регуляторную функцию. В частности, при беременности они экспрессируют фермент IDO, конвертирующий триптофан до токсичных продуктов кинуренинов, блокирующих активацию и вызывающих апоптоз цитотоксических Т-лимфоцитов в зоне соприкосновения материнских иммунных клеток с антигенами плацентарно-фетального комплекса [6].
При оценке ЛПС-индуцируемой активности IDO моноцитами установили, что кисспептин в концентрации, соответствующей II триместру беременности, достоверно усиливает активность IDO (рис. 3). Таким образом, гормон способен не только активировать процессы фагоцитоза и синтеза АФК моноцитами, но и при определенных условиях (наличие эндотоксина) запускать механизм отрицательной обратной связи, блокируя воспалительную реакцию, развитие которой может иметь фатальные последствия для поддержания беременности. Такая пластичность регуляторного потенциала кисспептина реализуется в концентрации, которую наблюдают во II триместре беременности, наиболее уязвимом периоде для иммунокомпрометирующих состояний.
Суммируя вышесказанное, можно заключить, что кис-спептин, который появляется в кровотоке беременных женщин и в силу этого способен специфически регулировать функциональную активность моноцитов, является новым, ранее не учитываемым фактором иммунорегуляции во время физиологически протекающей беременности.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» РАН 12-П-4-1017.
ЛИТЕРАТУРА
1. Данилов В.С., Зарубина А.П., Ерошников Г.Е. и др. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий. Вестник Московского университета. Серия 16. Биология. 2002; 3: 20-4.
2. Дерябин Д.Г., Каримов И.Ф. Особенности реагирования рекомбинантных люминесцирующих бактерий с различными LUX-оперонами в фагоцитарной системе. Вестник Оренбургского государственного университета. 2007; 12: 4-6.
3. Дёрфлинг П., Вихнер З. Выделение макрофагов из суспензии спленоцитов. В кн.: Фримель Г., ред. Иммунологические методы: Пер. с нем. А.П. Тарасова. М.: Медицина; 1987: 373-8.
4. Кондратьева И.А., Ярилин А.А., Егорова С.Г. и др. Определение активности миелопероксидазы в фагоцитирующих клетках периферической крови человека. В кн.: Кондратьева И.А., Ярилин А.А., ред. Практикум по иммунологии. 2-е изд. М.: Издательский центр «Академия»; 2004: 193-5.
5. Ширшев С. В., Куклина Е. М., Заморина С. А. и др. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека по степени гашения биолюминесценции. Патент РФ № 2292553. 2007.
6. Ширшев С.В. Иммунология материнско-фетальных взаимодействий. Екатеринбург: УрО РАН, 2009.
7. Abrahams V.M., Kim Y.M., Straszewski S.L. et al. Macrophages and apoptotic cell clearance during pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 2004; 51: 275-82.
8. Albrecht D., Jungi T.W. Luminol-enhanced chemiluminescence induced in peripheral blood-derived human phagocytes: obligatory requirement of myeloperoxidase exocytosis by monocytes. J. Leukoc. Biol. 1993; 54: 300-6.
9. Alexander H., Zimmerman G., Lehmann M. et al. HCG secretion by peripheral mononuclear cells during pregnancy. Domest. an. Endocrinol. 1998; 15: 377-87.
10. Atosuo J. T., Lilius E.M. The real-time-based assessment of the microbial killing by the antimicrobial compounds of neutrophils. Scient. World J. 2011; 11: 2382-90.
11. Banchereau J., Steinman R.M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 1998; 392: 245-52.
12. Braun D., Longman R. S., Albert M. L. A two-step induction of indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO) activity during dendritic-cell maturation. Blood. 2005; 106: 2375-81.
13. Castellano J.M., Gaytan M., Roa J. et al. Expression of KiSS-1 in Rat Ovary: Putative Local Regulator of Ovulation? Endocrinology. 2006; 147: 4852-62.
14. Dahigren C. Myeloperoxidase modulates the phagocytic activity of polymorphonuclear neutrophil leukocytes. Studies with cells from a myeloperoxidase deficient patient. J. Clin. Invest. 1984; 73: 366-73.
15. Dale D.C., BoxerL., Liles W.C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 2008; 112(4): 935-45.
16. Dhillo W.S., Murphy K.G., Bloom S.R. The neuroendocrine physiology of kisspeptin in the human. Rev. Endocrinol. Metab. Disord. 2007; 8: 41-6.
17. Dhillo W.S. Kisspeptin: a novel regulator of reproductive function. J. Neuroendocrinol. 2008; 8: 963-70.
18. Harms J.F., Welch D.R., Miele M.E. KISS1 metastasis suppression and emergent pathways. Clin. Exp. Metastas. 2003; 1: 11-5.
19. Horikoshi Y., Matsumoto H., Takatsu Y. et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin
- 250 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
as a novel placenta-derived hormone in humans. J. Clin. Endocrinol. 2003; ...(2): 914-9.
20. Muir A.I., Chamberlain L., Elshourbagy N.A. et al. AXOR12, a novel human G protein-coupled receptor, activated by the peptide KiSS-1. J. Biol. Chem. 2001; 276: 28969-75.
21. Selvaraj R.J., Sbarra A.J., Thomas G.B. et al. A microtechnique for studying chemiluminescence response of phago-
cytes using whole blood and its application to the evaluation of phagocytes in pregnancy. J. Reticuloendothel. Soc. 1982; 31: 3-16.
22. Stafford L.J., Xia C., Ma W. et al. Identification and characterization of mouse metastasis-suppressor KiSS1 and its G-protein-coupled receptor. Cancer Res. 2002; ...(19): 5399-404.
Поступила 11.03.13
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616-008.921-008.64-07:616.155.32
Г.В. Луценко, М.В. Гречихина, Л.Г. Дьячкова, А.М. Сапожников
протективное действие аутокринных факторов цитотоксических t-лимфоцитов в условиях химической гипоксии
ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, г Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10
Исследовали влияние аутокринных факторов клеток цитотоксической линии CTLL-2 на их жизнеспособность и энергетический метаболизм в условиях химической интоксикации, создаваемой с использованием азида натрия (NaN3) или хлорида кобальта (CoCl2). Показано, что аутокринные факторы, содержащиеся в 50% кондиционированной среде клеток CTLL-2, способны восстанавливать уровень АТФ в этих клетках, сниженный в условиях химической гипоксии, которая получена при их инкубации в течение 3 ч в присутствии 10 мМ NaN3 или 200 мкМ CoCl2. Результаты цитометрического анализа количества клеток CTLL-2, проведенного после 20 ч культивирования в условиях химической гипоксии (200 мкМ CoCl2), показали, что более 90% клеток подвергаются гибели по пути апоптоза или некроза. Добавление к клеткам 50% кондиционированной среды, богатой аутокринными факторами, снижало уровень погибших клеток до 10%. Сделан вывод о том, что аутокринные факторы цитотоксических клеток CTLL-2 в условиях химической гипоксии способны оказывать протективное действие на клетки за счет переключения энергетического метаболизма на анаэробный гликолиз.
Ключевые слова: аутокринные факторы, цитотоксические Т-лимфоциты, химическая гипоксия, апоптоз, некроз, проточная цитометрия
G.V Lutsenko, M.V Grechikhina, L.G. Diachkova, A.M. Sapozhnikov
PROTECTIVE ACTION OF AUTOCRINE FACTORS OF CYTOTOxIC T LYMPHOCYTES UNDER CHEMICAL hypoxia CONDITIONS
Federal State Budgetary Institution of Science “Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry”, Russian Academy of Sciences, 117997, Moscow, Russian Federation
The influence of autocrine factors of CTLL-2 cytotoxic cell line on cell viability and energy metabolism under chemical hypoxia conditions was investigated with using of sodium azide (NaN3) and cobalt chloride (CoCl2). Autocrine factors containing in 50% condition medium of CTLL-2 cells have been shown to restore ATP content in the cells depressed under chemical hypoxia conditions which were made by 3 hour incubation in the presence of 10 mM NaN3 or 200 mcM CoCl2. Flow cytometric analysis of CTLL-2 cells cultivated with CoCl2 for 20 hrs showed that more than 90% of the cells were dead (apoptotic or necrotic type of the cell death). The addition of 50% condition medium to the cell cultures decreased the percentage of dead cells after cultivation under chemical hypoxia conditions up to 10%. The conclusion was made that autocrine factors of CTLL-2 cytotoxic cells are able to protect the cells from hypoxia induced cell death by means of augmentation the rate of anaerobic glycolysis.
Key words: autocrine factors, cytotoxic T lymphocytes, chemical hypoxia, apoptosis, necrosis, flow cytometry
В многоклеточном организме выживание и энергетический метаболизм клеток находятся под контролем множества цитокинов и факторов роста. Так, известно, что интерлейкин (ИЛ)-3 может влиять на рост клеток и их выживание через свое действие на метаболизм глюкозы [1]. Наряду с пара-кринными факторами, которые клетка получает от клеток других типов, в контроле энергетического метаболизма и выживания клеток могут принимать участие аутокринные факторы, которые клетка секретирует сама и получает от клеток того же типа [2]. Ранее мы показали, что аутокринные факторы осуществляют контроль выживания Т-лимфоцитов через регуляцию уровня внутриклеточного АТФ [3].
Клетки иммунной системы при их миграции из кровяного русла в ткани организма переходят из области относительно высокого содержания кислорода (нормоксия) в область его
низкого содержания (гипоксия). Показано, что содержание кислорода в лимфоидных органах мыши составляет 0,54,5% при его содержании в атмосферном воздухе на уровне 20% [4]. В ряде патологических состояний наблюдается усиление гипоксии. Состояние повышенной гипоксии выявляют в злокачественных опухолях [5, 6], ранах кожных покровов [7], атероматозных бляшках [8], областях перелома кости [9], при низком артериальном давлении [10], в суставах при ревматоидном артрите [11]. Таким образом, активированные Т-лимфоциты при патологических состояниях организма часто функционируют в условиях повышенной гипоксии.
Механизмы поддержания энергетического метаболизма и сохранения жизнеспособности активированных Т-лим-фоцитов в условиях гипоксии представляют большой интерес. Данная работа посвящена исследованию протектив-
- 251 -
